c1r蛋白酶类似物在制备胶质瘤放化疗药物中的应用
技术领域
1.本发明涉及一种c1r蛋白酶类似物在制备胶质瘤放化疗药物方面的应用。
背景技术：
2.胶质母细胞瘤(glioblastoma,gbm)是颅内最常见的原发性肿瘤，脑胶质瘤占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的原发性颅内肿瘤，年发病率为3～8人/10万人口。如同其他肿瘤一样，胶质瘤也是由于先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致。一些已知的遗传疾病，例如神经纤维瘤病(i型)以及结核性硬化疾病等，为脑胶质瘤的遗传易感因素。有这些疾病的患者，其脑胶质瘤的发生机会要比普通人群高很多。
3.脑胶质瘤所导致的症状和体征，主要取决其占位效应以及所影响的脑区功能。胶质瘤由于其在空间的“占位”效应，可以使患者产生头痛、恶心及呕吐、癫痫、视物模糊等症状。此外，由于其对局部脑组织功能的影响，还可以使患者产生其他的症状。比如，视神经胶质瘤可以导致患者视觉的丧失；脊髓胶质瘤可以使患者产生肢体的疼痛、麻木以及肌力弱等症状；中央区胶质瘤可以引起患者运动与感觉的障碍；语言区胶质瘤可以引起患者语言表达和理解的困难。胶质瘤由于恶性程度不同，其所产生症状的速度也不同。例如，低级别胶质瘤患者的病史往往在几个月甚至上年，而高级别胶质瘤患者的病史往往在几个星期至几个月。根据患者的病史、症状以及体征，可以初步推断出病变的部位以及恶性程度。
4.目前的治疗方法包括手术、放疗、化疗及其结合等综合治疗方案。但是胶质瘤很难根治，往往会复发。因此，亟待研发一种新的药物，以提高胶质瘤的治疗效率，降低复发率。
技术实现要素：
5.针对现有技术中的上述问题，本发明提出了一种c1r蛋白酶类似物在制备胶质瘤放化疗药物中的应用，可以提高胶质瘤的治疗效率，降低复发率。
6.第一方面，本发明提出了一种c1r蛋白酶类似物，所述c1r蛋白类似物由702个氨基酸残基组成，在n端有440个～460个氨基酸残基，包含两个cub和egf结构域，在c端有240个～260个氨基酸残基的丝氨酸蛋白酶结构域。
7.本发明的c1r蛋白酶类似物为单链长形结构，分子量大约为85kda。
8.具体地，本发明的c1r蛋白酶类似物在c端的丝氨酸蛋白酶结构域，与非补体丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶，糜蛋白酶等)高度同源。
9.第二方面，本发明提出了所述的c1r蛋白酶类似物在制备胶质瘤放化疗药物中的应用。
10.作为本发明的具体实施方式，所述药物以c1r蛋白酶类似物作为活性成分，所述活性成分的重量百分含量为1％～99％。
11.作为本发明的具体实施方式，所述药物还包括药学上可接受的载体。
12.作为本发明的具体实施方式，所述载体至少选自填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润湿剂、香味剂或甜味剂中的一种。
13.作为本发明的具体实施方式，所述填充剂至少选自淀粉、蔗糖和乳糖中的一种；和/或，所述粘合剂至少选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的一种；和/或，所述润湿剂为甘油；和/或，所述崩解剂至少选自琼脂和碳酸钙中的一种；和/或，所述吸收促进剂为季铵化合物；和/或，表面活性剂为十六烷醇；和/或，所述吸附载体至少选自高岭土和蒙脱石中的一种；和/或，所述润滑剂至少选自滑石粉、硬脂酸钙和聚乙二醇中的一种。
14.作为本发明的具体实施方式，所述药物为片剂、颗粒剂或胶囊。
15.第三方面，本发明提出了一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1所述的通式的化合物或其盐，以一种药学上可接受的载体或赋形剂。
16.第四方面，本发明提出了所述的药物组合物在制备胶质瘤放化疗药物中的应用。
17.本发明所述药物的使用剂量可随特定的给药方式、病症的严重程度等而相应调整。一般情况下，剂量水平在每天约0.01mg/kg-1mg/kg体重，可有效用于上述疾病。对于特殊的病人的特定计量水平将取决于许多因素，包括年龄、健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度、药物组合和收到治疗的特定疾病及严重程度。
18.胶质母细胞瘤具有高度异质性，其中间质亚型gscs的存在导致了胶质瘤细胞的放化疗抵抗性，是抗癌治疗后复发的主要原因，然而间质亚型gscs的形成机制尚不清楚。本发明发现的补体c1r在间质亚型gscs形成和维持过程中的功能及潜在信号通路为依据，旨在利用体内外诱导转换模型揭示c1r调控胶质瘤间质亚型特性的相关信号通路及其作用靶点，并验证候选靶点对间质亚型gscs特性调控的作用，阐明间质亚型gscs形成与维持的分子机制。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不构成对本发明的任何限制。
20.实施例1
21.实施例1提出了一种胶质瘤放化疗药物，所述药物为片剂，每片100mg，c1r蛋白酶类似物的重量百分比为1％，其中，c1r蛋白酶类似物1mg，淀粉90mg，琼脂5mg，蒙脱石4mg。
22.实施例2
23.实施例2提出了一种胶质瘤放化疗药物，所述药物为颗粒剂，c1r蛋白酶类似物的重量百分比为99％，其中，c1r蛋白酶类似物99mg，藻酸盐1mg。
24.实施例3
25.实施例3提出了一种胶质瘤放化疗药物，所述药物为胶囊，c1r蛋白酶类似物的重量百分比为50％，其中，c1r蛋白酶类似物50mg，乳糖5mg，蔗糖5mg，琼脂10mg，淀粉25mg，高岭土5mg。
26.研究方法
27.(1)确认c1r依赖的间质亚型转换相关信号通路。
28.a、利用western blot技术，在c1r抑制表达的间质亚型gscs和c1r高表达的前神经亚型gscs中检测候选信号通路stat3、nfκb活化标记物的表达(phosphor-stat3，phosphor-iκb，phosphor-p65)，确认c1r对候选信号通路的调控作用。b、在c1r抑制表达的间质亚型gscs所形成的肿瘤组织中，通过免疫荧光染色确认间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神
经亚型标记物(sox2、olig2等)、c1r以及stat3、nfκb信号通路的相关性。
29.c、在胶质瘤患者样本乏氧坏死部位，通过免疫荧光染色检测间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)、c1r以及stat3、nfκb信号通路，确认c1r调控的下游信号通路与间质亚型胶质瘤的临床相关性。
30.d、分离不同亚型患者胶质瘤组织中的单细胞，通过流式细胞术分选不同亚型胶质瘤干细胞(mes型标记：cd44、ykl40；pn型标记：sox2、olig2)，并通过phos-flow技术确认stat3及nfκb信号通路。
31.(2)明确c1r调控胶质瘤干细胞间质表型的作用靶点。
32.a、分离胶质瘤细胞膜蛋白，并加入标记有生物素的重组蛋白c1r进行过夜孵育，通过偶联亲和素的磁珠捕捉c1r补体-受体复合物，利用磁极回收磁珠-补体-受体复合物，通过质谱分析确认c1r与候选靶点(c3ar1、c5ar1)的结合。
33.b、干扰抑制间质亚型gscs中靶点基因(c3ar1、c5ar1)的表达，并利用不同浓度c1r重组蛋白刺激靶点基因敲减后的gscs，通过western blot检测其对下游信号通路活化标记(phospho-stat3，phospho-iκb，phospho-p65)的影响。
34.c、在稳定表达firefly luciferase的间质亚型gscs中敲减靶点基因，利用化学发光法检测胶质瘤细胞的增殖情况，利用gscs成球实验检测胶质瘤细胞的自我更新能力；通过免疫荧光染色检测间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)的表达水平；对细胞进行辐照或替莫唑胺药物处理，通过annexinv凋亡试剂盒检测胶质瘤细胞对放化疗的抵抗性。
35.d、向裸鼠脑部注射10万个敲减靶点基因的gscs及对照组gscs(均稳定表达firefly luciferase)，通过活体成像监测肿瘤细胞的致癌性；对小鼠胶质瘤模型行全脑放疗或(及)替莫唑胺治疗，统计小鼠胶质瘤复发率及生存期；利用小鼠胶质瘤样本，通过免疫荧光检测间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)及下游信号通路的相关性。
36.(3)探讨靶点基因及其下游信号通路的临床应用方案。
37.a、在前期研究中，我们已收集了100例胶质瘤患者的组织样本，并统计了患者临床信息(包括年龄、性别、病理诊断、治疗方法、生存期等)。我们拟进一步通过免疫荧光染色，检测这些样本中间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)、c1r、靶点蛋白及下游信号通路表达水平，并进一步应用生存统计分析、单变量分析、多变量分析等生物统计分析法，探究这些蛋白的表达水平与患者预后的相关性。
38.b、利用靶点蛋白抑制剂(如c3ar1抑制剂sb290157，c5ar1抑制剂w54011)处理间质亚型胶质瘤干细胞，利用化学发光法检测胶质瘤细胞的增殖情况，利用gscs成球实验检测胶质瘤细胞的干性水平；通过免疫荧光染色检测间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)的表达水平；对细胞进行辐照或替莫唑胺药物处理，通过annexinv凋亡试剂盒检测胶质瘤细胞对放化疗的抵抗性。
39.c、在前期研究中，我们在前神经亚型干细胞中建立了间质亚型转换报告系统。将携带报告系统的前神经亚型gscs与间质亚型gscs各10万个，混合注射于小鼠颅内，以模拟临床胶质瘤组织中的高度异质性。利用靶点蛋白抑制剂对小鼠进行治疗，通过活体成像监测前神经亚型胶质瘤的间质亚型转换情况。
luciferase底物d-luciferin，室温反应5min后，用化学发光仪拍照，并用酶标仪化学发光模块检测不同浓度梯度胶质瘤细胞的化学发光强度，绘制标准曲线。对照组及c1r干扰抑制组胶质瘤计数后接种于96孔板，分别于0、1、3、5天按照如上方法检测每孔的化学发光强度，结合标准曲线即可统计细胞的增殖情况。
53.7.干细胞成球检测：将gscs消化计数，向96孔板接种1、10、50、250、500个细胞/100μl干细胞培养基，每三天向体系中补充20μl新鲜的干细胞培养基，连续培养14天后，检测胶质瘤细胞的成球情况。
54.8.辐照处理条件(医用co60γ-射线辐照源)：
55.(1)细胞：剂量率为2.04gy/min,总剂量为20gy。
56.(2)动物：连续五天行全脑放疗，每天总剂量为2gy。
57.9.小鼠原位胶质瘤模型：向裸鼠颅腔原位注射1
×
105个gscs，利用异氟烷麻醉裸鼠后，向腹腔注射100μl荧光酶底物(d-lucierin)，利用活体成像仪监测7、14、28、35天体内成瘤情况。
58.10.小鼠胶质瘤混合原位移植模型：向裸鼠颅腔共注射1
×
105个间质亚型gscs以及等量具有间质样转换追踪功能的前神经亚型gscs混合液。利用异氟烷麻醉裸鼠后，向腹腔注射100μl nano luciferase底物furimazine，利用活体成像仪监测体内成瘤情况以及前神经亚型gscs间质亚型转换情况。
59.11.小鼠胶质瘤治疗模型：构建小鼠胶质瘤模型后，每天给予靶基因抑制剂sb290157、w54011(20u/kg)或替莫唑胺(75mg/m3)口服治疗，通过活体成像仪监测小鼠的成瘤情况。
60.12.annexin v法检测细胞凋亡：gscs辐照或药物处理后，继续培养五天，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1
×
105个/ml。用预冷pbs洗涤细胞一次，2000rpm离心5min,加入300μl 1
×
binding buffer重悬后，每管加入5μl annexin v-apc，轻轻颠倒混匀后避光室温孵育10min,上机前加入5μl pi孵育5min,补加1
×
binding buffer至500μl，流式细胞术检测凋亡细胞的比例。
61.13.atac-seq建库：将分选后的细胞用冷的pbs洗涤两次，快速加入50μl预冷lysis buffer，轻轻悬浮细胞，冰上孵育10min；4℃离心弃上清后，加入tn5转座酶(vazyme)，37℃孵育30min，将获得的dna纯化后，进行pcr反应扩增，将扩增产物利用磁珠(beckman coulter agencourt ampure xp)纯化后测序。
62.14.数据分析方法：本课题数据分析方法主要采用生存统计分析以及gsea富集分析。统计学意义采用标准偏差mean(
±
sd)表示，组间比较采用卡方检验或t检验。****p《0.0001，***p《0.01,**p《0.05,*p《0.1为差异有统计学意义。
63.15.生物信息学分析方法：
64.(1)转录组测序结果分析：测序所得fastq数据应用trim galore软件包及burrows-wheeler-alignment tool进行处理获得bam文件，通过samtools应用程序进行排序和筛选，最后利用featurecounts进行转录组定量分析，获得rna-seq矩阵，并对矩阵进行标准化处理。
65.(2)表观遗传学结果分析(atac-seq)：按照如(1)所示方法对bam文件进行排序筛选。可应用deeptools将bam文件转换为bigmig文件,即可通过igv全平台数据可视化工具进
行峰值富集分析。也可应用bedtobam将bam文件转换为bed文件,即可通过macs2软件进行callpeaks分析，最后利用hypergeometric optimization of motif enrichment对motif进行预测，获得候选转录因子。
66.与低级别胶质瘤相比，恶性gbm最大的特点是包含有少量具有持续自我更新能力的gscs细胞。为了探究高表达于恶性胶质瘤中的c1r是否影响胶质瘤的干细胞特性，首先对2个正常脑细胞株、6个分化胶质瘤细胞株以及8个原代gscs细胞株进行了转录组测序，结果显示c1r在正常脑细胞系中表达水平非常低，且在原代gscs中的表达水平远高于分化胶质瘤细胞系。利用fbs分别将胶质瘤干细胞mgsc3、pgsc5诱导分化为mdgc3、pdgc5，通过atac-seq检测，我们证实c1r在原代gscs中转录活跃。利用shrna慢病毒系统在c1r高表达的间质亚型原代胶质瘤干细胞株mgsc3中干扰抑制了c1r的表达，免疫荧光染色显示c1r的表达主要定位于胶质瘤细胞膜表面，且干扰抑制组中c1r的表达水平显著降低。在mgsc3中稳定表达firefly luciferase，通过化学发光检测量化了发光强度对应的胶质瘤细胞数，并通过该方法检测了c1r抑制表达对胶质瘤细胞增殖的影响。结果显示c1r抑制表达的gscs增殖能力显著降低，且在神经干细胞培养条件下形成神经细胞球状肿瘤细胞球的能力减弱。细胞免疫荧光染色结果显示，c1r表达抑制的胶质瘤细胞中分化标记物(s100b、tuj1、o4)的表达水平增高。这些结果说明c1r在胶质瘤干性维持中起关键作用。
67.本发明的研究结果不仅为理解间质亚型gscs开拓了新视野，而且为以c1r调控的间质亚型特性相关信号通路为靶标的放疗抵抗性胶质瘤的精准治疗提供新的理论基础。
68.在本发明中的提到的任何数值，如果在任何最低值和任何最高值之间只是有两个单位的间隔，则包括从最低值到最高值的每次增加一个单位的所有值。例如，如果声明一种组分的量，或诸如温度、压力、时间等工艺变量的值为50-90，在本说明书中它的意思是具体列举了51-89、52-88
……
以及69-71以及70-71等数值。对于非整数的值，可以适当考虑以0.1、0.01、0.001或0.0001为一单位。这仅是一些特殊指明的例子。在本技术中，以相似方式，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都被认为已经公开。
69.应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
技术领域
1.本发明涉及一种c1r蛋白酶类似物在制备胶质瘤放化疗药物方面的应用。
背景技术：
2.胶质母细胞瘤(glioblastoma,gbm)是颅内最常见的原发性肿瘤，脑胶质瘤占颅脑肿瘤的40％～50％，是最常见的原发性颅内肿瘤，年发病率为3～8人/10万人口。如同其他肿瘤一样，胶质瘤也是由于先天的遗传高危因素和环境的致癌因素相互作用所导致。一些已知的遗传疾病，例如神经纤维瘤病(i型)以及结核性硬化疾病等，为脑胶质瘤的遗传易感因素。有这些疾病的患者，其脑胶质瘤的发生机会要比普通人群高很多。
3.脑胶质瘤所导致的症状和体征，主要取决其占位效应以及所影响的脑区功能。胶质瘤由于其在空间的“占位”效应，可以使患者产生头痛、恶心及呕吐、癫痫、视物模糊等症状。此外，由于其对局部脑组织功能的影响，还可以使患者产生其他的症状。比如，视神经胶质瘤可以导致患者视觉的丧失；脊髓胶质瘤可以使患者产生肢体的疼痛、麻木以及肌力弱等症状；中央区胶质瘤可以引起患者运动与感觉的障碍；语言区胶质瘤可以引起患者语言表达和理解的困难。胶质瘤由于恶性程度不同，其所产生症状的速度也不同。例如，低级别胶质瘤患者的病史往往在几个月甚至上年，而高级别胶质瘤患者的病史往往在几个星期至几个月。根据患者的病史、症状以及体征，可以初步推断出病变的部位以及恶性程度。
4.目前的治疗方法包括手术、放疗、化疗及其结合等综合治疗方案。但是胶质瘤很难根治，往往会复发。因此，亟待研发一种新的药物，以提高胶质瘤的治疗效率，降低复发率。
技术实现要素：
5.针对现有技术中的上述问题，本发明提出了一种c1r蛋白酶类似物在制备胶质瘤放化疗药物中的应用，可以提高胶质瘤的治疗效率，降低复发率。
6.第一方面，本发明提出了一种c1r蛋白酶类似物，所述c1r蛋白类似物由702个氨基酸残基组成，在n端有440个～460个氨基酸残基，包含两个cub和egf结构域，在c端有240个～260个氨基酸残基的丝氨酸蛋白酶结构域。
7.本发明的c1r蛋白酶类似物为单链长形结构，分子量大约为85kda。
8.具体地，本发明的c1r蛋白酶类似物在c端的丝氨酸蛋白酶结构域，与非补体丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶，糜蛋白酶等)高度同源。
9.第二方面，本发明提出了所述的c1r蛋白酶类似物在制备胶质瘤放化疗药物中的应用。
10.作为本发明的具体实施方式，所述药物以c1r蛋白酶类似物作为活性成分，所述活性成分的重量百分含量为1％～99％。
11.作为本发明的具体实施方式，所述药物还包括药学上可接受的载体。
12.作为本发明的具体实施方式，所述载体至少选自填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润湿剂、香味剂或甜味剂中的一种。
13.作为本发明的具体实施方式，所述填充剂至少选自淀粉、蔗糖和乳糖中的一种；和/或，所述粘合剂至少选自纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮中的一种；和/或，所述润湿剂为甘油；和/或，所述崩解剂至少选自琼脂和碳酸钙中的一种；和/或，所述吸收促进剂为季铵化合物；和/或，表面活性剂为十六烷醇；和/或，所述吸附载体至少选自高岭土和蒙脱石中的一种；和/或，所述润滑剂至少选自滑石粉、硬脂酸钙和聚乙二醇中的一种。
14.作为本发明的具体实施方式，所述药物为片剂、颗粒剂或胶囊。
15.第三方面，本发明提出了一种药物组合物，包括治疗有效量的权利要求1所述的通式的化合物或其盐，以一种药学上可接受的载体或赋形剂。
16.第四方面，本发明提出了所述的药物组合物在制备胶质瘤放化疗药物中的应用。
17.本发明所述药物的使用剂量可随特定的给药方式、病症的严重程度等而相应调整。一般情况下，剂量水平在每天约0.01mg/kg-1mg/kg体重，可有效用于上述疾病。对于特殊的病人的特定计量水平将取决于许多因素，包括年龄、健康状况、性别、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度、药物组合和收到治疗的特定疾病及严重程度。
18.胶质母细胞瘤具有高度异质性，其中间质亚型gscs的存在导致了胶质瘤细胞的放化疗抵抗性，是抗癌治疗后复发的主要原因，然而间质亚型gscs的形成机制尚不清楚。本发明发现的补体c1r在间质亚型gscs形成和维持过程中的功能及潜在信号通路为依据，旨在利用体内外诱导转换模型揭示c1r调控胶质瘤间质亚型特性的相关信号通路及其作用靶点，并验证候选靶点对间质亚型gscs特性调控的作用，阐明间质亚型gscs形成与维持的分子机制。
具体实施方式
19.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但并不构成对本发明的任何限制。
20.实施例1
21.实施例1提出了一种胶质瘤放化疗药物，所述药物为片剂，每片100mg，c1r蛋白酶类似物的重量百分比为1％，其中，c1r蛋白酶类似物1mg，淀粉90mg，琼脂5mg，蒙脱石4mg。
22.实施例2
23.实施例2提出了一种胶质瘤放化疗药物，所述药物为颗粒剂，c1r蛋白酶类似物的重量百分比为99％，其中，c1r蛋白酶类似物99mg，藻酸盐1mg。
24.实施例3
25.实施例3提出了一种胶质瘤放化疗药物，所述药物为胶囊，c1r蛋白酶类似物的重量百分比为50％，其中，c1r蛋白酶类似物50mg，乳糖5mg，蔗糖5mg，琼脂10mg，淀粉25mg，高岭土5mg。
26.研究方法
27.(1)确认c1r依赖的间质亚型转换相关信号通路。
28.a、利用western blot技术，在c1r抑制表达的间质亚型gscs和c1r高表达的前神经亚型gscs中检测候选信号通路stat3、nfκb活化标记物的表达(phosphor-stat3，phosphor-iκb，phosphor-p65)，确认c1r对候选信号通路的调控作用。b、在c1r抑制表达的间质亚型gscs所形成的肿瘤组织中，通过免疫荧光染色确认间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神
经亚型标记物(sox2、olig2等)、c1r以及stat3、nfκb信号通路的相关性。
29.c、在胶质瘤患者样本乏氧坏死部位，通过免疫荧光染色检测间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)、c1r以及stat3、nfκb信号通路，确认c1r调控的下游信号通路与间质亚型胶质瘤的临床相关性。
30.d、分离不同亚型患者胶质瘤组织中的单细胞，通过流式细胞术分选不同亚型胶质瘤干细胞(mes型标记：cd44、ykl40；pn型标记：sox2、olig2)，并通过phos-flow技术确认stat3及nfκb信号通路。
31.(2)明确c1r调控胶质瘤干细胞间质表型的作用靶点。
32.a、分离胶质瘤细胞膜蛋白，并加入标记有生物素的重组蛋白c1r进行过夜孵育，通过偶联亲和素的磁珠捕捉c1r补体-受体复合物，利用磁极回收磁珠-补体-受体复合物，通过质谱分析确认c1r与候选靶点(c3ar1、c5ar1)的结合。
33.b、干扰抑制间质亚型gscs中靶点基因(c3ar1、c5ar1)的表达，并利用不同浓度c1r重组蛋白刺激靶点基因敲减后的gscs，通过western blot检测其对下游信号通路活化标记(phospho-stat3，phospho-iκb，phospho-p65)的影响。
34.c、在稳定表达firefly luciferase的间质亚型gscs中敲减靶点基因，利用化学发光法检测胶质瘤细胞的增殖情况，利用gscs成球实验检测胶质瘤细胞的自我更新能力；通过免疫荧光染色检测间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)的表达水平；对细胞进行辐照或替莫唑胺药物处理，通过annexinv凋亡试剂盒检测胶质瘤细胞对放化疗的抵抗性。
35.d、向裸鼠脑部注射10万个敲减靶点基因的gscs及对照组gscs(均稳定表达firefly luciferase)，通过活体成像监测肿瘤细胞的致癌性；对小鼠胶质瘤模型行全脑放疗或(及)替莫唑胺治疗，统计小鼠胶质瘤复发率及生存期；利用小鼠胶质瘤样本，通过免疫荧光检测间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)及下游信号通路的相关性。
36.(3)探讨靶点基因及其下游信号通路的临床应用方案。
37.a、在前期研究中，我们已收集了100例胶质瘤患者的组织样本，并统计了患者临床信息(包括年龄、性别、病理诊断、治疗方法、生存期等)。我们拟进一步通过免疫荧光染色，检测这些样本中间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)、c1r、靶点蛋白及下游信号通路表达水平，并进一步应用生存统计分析、单变量分析、多变量分析等生物统计分析法，探究这些蛋白的表达水平与患者预后的相关性。
38.b、利用靶点蛋白抑制剂(如c3ar1抑制剂sb290157，c5ar1抑制剂w54011)处理间质亚型胶质瘤干细胞，利用化学发光法检测胶质瘤细胞的增殖情况，利用gscs成球实验检测胶质瘤细胞的干性水平；通过免疫荧光染色检测间质亚型标记物(cd44、ykl40等)、前神经亚型标记物(sox2、olig2等)的表达水平；对细胞进行辐照或替莫唑胺药物处理，通过annexinv凋亡试剂盒检测胶质瘤细胞对放化疗的抵抗性。
39.c、在前期研究中，我们在前神经亚型干细胞中建立了间质亚型转换报告系统。将携带报告系统的前神经亚型gscs与间质亚型gscs各10万个，混合注射于小鼠颅内，以模拟临床胶质瘤组织中的高度异质性。利用靶点蛋白抑制剂对小鼠进行治疗，通过活体成像监测前神经亚型胶质瘤的间质亚型转换情况。
luciferase底物d-luciferin，室温反应5min后，用化学发光仪拍照，并用酶标仪化学发光模块检测不同浓度梯度胶质瘤细胞的化学发光强度，绘制标准曲线。对照组及c1r干扰抑制组胶质瘤计数后接种于96孔板，分别于0、1、3、5天按照如上方法检测每孔的化学发光强度，结合标准曲线即可统计细胞的增殖情况。
53.7.干细胞成球检测：将gscs消化计数，向96孔板接种1、10、50、250、500个细胞/100μl干细胞培养基，每三天向体系中补充20μl新鲜的干细胞培养基，连续培养14天后，检测胶质瘤细胞的成球情况。
54.8.辐照处理条件(医用co60γ-射线辐照源)：
55.(1)细胞：剂量率为2.04gy/min,总剂量为20gy。
56.(2)动物：连续五天行全脑放疗，每天总剂量为2gy。
57.9.小鼠原位胶质瘤模型：向裸鼠颅腔原位注射1
×
105个gscs，利用异氟烷麻醉裸鼠后，向腹腔注射100μl荧光酶底物(d-lucierin)，利用活体成像仪监测7、14、28、35天体内成瘤情况。
58.10.小鼠胶质瘤混合原位移植模型：向裸鼠颅腔共注射1
×
105个间质亚型gscs以及等量具有间质样转换追踪功能的前神经亚型gscs混合液。利用异氟烷麻醉裸鼠后，向腹腔注射100μl nano luciferase底物furimazine，利用活体成像仪监测体内成瘤情况以及前神经亚型gscs间质亚型转换情况。
59.11.小鼠胶质瘤治疗模型：构建小鼠胶质瘤模型后，每天给予靶基因抑制剂sb290157、w54011(20u/kg)或替莫唑胺(75mg/m3)口服治疗，通过活体成像仪监测小鼠的成瘤情况。
60.12.annexin v法检测细胞凋亡：gscs辐照或药物处理后，继续培养五天，制备单细胞悬液，调整细胞密度为1
×
105个/ml。用预冷pbs洗涤细胞一次，2000rpm离心5min,加入300μl 1
×
binding buffer重悬后，每管加入5μl annexin v-apc，轻轻颠倒混匀后避光室温孵育10min,上机前加入5μl pi孵育5min,补加1
×
binding buffer至500μl，流式细胞术检测凋亡细胞的比例。
61.13.atac-seq建库：将分选后的细胞用冷的pbs洗涤两次，快速加入50μl预冷lysis buffer，轻轻悬浮细胞，冰上孵育10min；4℃离心弃上清后，加入tn5转座酶(vazyme)，37℃孵育30min，将获得的dna纯化后，进行pcr反应扩增，将扩增产物利用磁珠(beckman coulter agencourt ampure xp)纯化后测序。
62.14.数据分析方法：本课题数据分析方法主要采用生存统计分析以及gsea富集分析。统计学意义采用标准偏差mean(
±
sd)表示，组间比较采用卡方检验或t检验。****p《0.0001，***p《0.01,**p《0.05,*p《0.1为差异有统计学意义。
63.15.生物信息学分析方法：
64.(1)转录组测序结果分析：测序所得fastq数据应用trim galore软件包及burrows-wheeler-alignment tool进行处理获得bam文件，通过samtools应用程序进行排序和筛选，最后利用featurecounts进行转录组定量分析，获得rna-seq矩阵，并对矩阵进行标准化处理。
65.(2)表观遗传学结果分析(atac-seq)：按照如(1)所示方法对bam文件进行排序筛选。可应用deeptools将bam文件转换为bigmig文件,即可通过igv全平台数据可视化工具进
行峰值富集分析。也可应用bedtobam将bam文件转换为bed文件,即可通过macs2软件进行callpeaks分析，最后利用hypergeometric optimization of motif enrichment对motif进行预测，获得候选转录因子。
66.与低级别胶质瘤相比，恶性gbm最大的特点是包含有少量具有持续自我更新能力的gscs细胞。为了探究高表达于恶性胶质瘤中的c1r是否影响胶质瘤的干细胞特性，首先对2个正常脑细胞株、6个分化胶质瘤细胞株以及8个原代gscs细胞株进行了转录组测序，结果显示c1r在正常脑细胞系中表达水平非常低，且在原代gscs中的表达水平远高于分化胶质瘤细胞系。利用fbs分别将胶质瘤干细胞mgsc3、pgsc5诱导分化为mdgc3、pdgc5，通过atac-seq检测，我们证实c1r在原代gscs中转录活跃。利用shrna慢病毒系统在c1r高表达的间质亚型原代胶质瘤干细胞株mgsc3中干扰抑制了c1r的表达，免疫荧光染色显示c1r的表达主要定位于胶质瘤细胞膜表面，且干扰抑制组中c1r的表达水平显著降低。在mgsc3中稳定表达firefly luciferase，通过化学发光检测量化了发光强度对应的胶质瘤细胞数，并通过该方法检测了c1r抑制表达对胶质瘤细胞增殖的影响。结果显示c1r抑制表达的gscs增殖能力显著降低，且在神经干细胞培养条件下形成神经细胞球状肿瘤细胞球的能力减弱。细胞免疫荧光染色结果显示，c1r表达抑制的胶质瘤细胞中分化标记物(s100b、tuj1、o4)的表达水平增高。这些结果说明c1r在胶质瘤干性维持中起关键作用。
67.本发明的研究结果不仅为理解间质亚型gscs开拓了新视野，而且为以c1r调控的间质亚型特性相关信号通路为靶标的放疗抵抗性胶质瘤的精准治疗提供新的理论基础。
68.在本发明中的提到的任何数值，如果在任何最低值和任何最高值之间只是有两个单位的间隔，则包括从最低值到最高值的每次增加一个单位的所有值。例如，如果声明一种组分的量，或诸如温度、压力、时间等工艺变量的值为50-90，在本说明书中它的意思是具体列举了51-89、52-88
……
以及69-71以及70-71等数值。对于非整数的值，可以适当考虑以0.1、0.01、0.001或0.0001为一单位。这仅是一些特殊指明的例子。在本技术中，以相似方式，所列举的最低值和最高值之间的数值的所有可能组合都被认为已经公开。
69.应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。
再多了解一些
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