用于细胞培养肉的大豆蛋白纤维支架的规模化生产方法与流程

1.本发明细胞培养肉领域，具体涉及用于细胞培养肉的大豆蛋白纤维支架的规模化生产方法。


背景技术：

2.肉是人们日常生活中很重要的蛋白质来源之一，目前肉主要来源于传统畜牧业，但是随着人口增长，现有的耕地面积很难满足人类肉类需求，如据预测2050年，全球人口将攀升至97亿，到时候将面临巨大的肉类需求缺口。
3.大规模的传统畜牧业与一系列公共卫生问题有关，主要是由于动物农业中人畜密切接触的增加、野生动物栖息地的破坏、人口增长和全球流动性，75%的人类新传染病来自动物源（动物传染病）。集约化畜牧业需要使用大量抗生素，大约80%美国销售的抗生素和73%全球销售的抗生素用于牲畜，这在抗生素耐药性方面也发挥着重要作用。随着人口的进一步增加，对肉类的需求量也越来越大，传统的畜牧业、渔业将难以满足人们对肉类的需求。
4.细胞肉是利用组织工程技术，通过体外培养细胞控制其快速增殖、定向分化并收集加工而成的一种新型肉类食品。与动物肉相比，细胞肉能节约99％的土地和96％的水。另外，因此发展细胞肉，是解决未来人类蛋白质短缺问题的一个重要手段。
5.在细胞肉的培养过程中，支架扮演重要的作用，它为细胞提供了黏附、增殖和分化的空间，是细胞获取营养物质、气体交换、排泄废物和生长代谢的主要场所，有利于细胞外基质的形成。在细胞肉中，支架除了满足良好的生物相容性、易加工成型、适宜的结构等基本要求外，作为一种食品，其还应满足食品材料要求。在各种支架类型中，纤维支架作为重要的做成部分，其可以模拟细胞外基质，诱导细胞沿着纤维方向定向生长，这有利于后期细胞分化产生肌纤维，使其接近动物肉。同时，其本身也可以通过模拟动物肌纤维组织，使其具有动物肉纤维口感。因此开发纤维支架对细胞肉具有重要意义。
6.湿法纺丝是传统制备化学纤维主要方法之一，主要原理是将制备的纺丝液通过喷丝孔压出形成细流进入到凝固液中，在形成初生纤维的过程中进行拉伸以及后续清洗、交联等过程获得纤维状材料。作为一种比较成熟的纤维制备方式，湿法纺丝具备连续化、可规模化的优势。
7.大豆分离蛋白是以低温脱溶大豆粕为原料生产的一种全价蛋白类食品添加剂，其蛋白质含量在90%以上，氨基酸种类有近20种，包含有人体必需氨基酸，是一种优异的蛋白来源。目前已有一些报道使用湿法纺丝技术制备大豆蛋白纤维，主要通过将大豆蛋白与聚乙烯醇、粘胶、聚醋酸乙烯等其他物质混合配制成为纺丝液，以提高大豆蛋白的可纺性，制备得到的大豆蛋白纤维含有大量不可食用的组分，只能应用于纺织等非食品领域。大豆蛋白纺丝需要将大豆蛋白高级结构打开形成大豆蛋白链组成的纺丝液，在文献中为了打开大豆蛋白的二硫键，往往食用尿素溶液，但是尿素溶液在食品领域也是被禁止的，寻找合适的大豆蛋白、控制溶解条件以及与其他可食用材料进行复配是纺丝的关键和难点。
8.如何使用大豆蛋白制备得到可用于细胞培养肉的纤维支架并实现规模化生产，依然是一项具有挑战性的工作。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种用于细胞培养肉的大豆蛋白纤维支架的规模化生产方法。
10.本发明所采取的技术方案是：用于细胞培养肉的大豆蛋白纤维支架的规模化生产方法，包括如下步骤：配置大豆蛋白纺丝液，所述大豆蛋白纺丝液的组成为：大豆蛋白 5～50 wt.%、助溶剂 0～5wt.%、可食用的改性剂0～60 wt.%、矫味剂 0～10wt.%、食用色素0～5wt.%、ph 9～14；所述助溶剂选自半胱氨酸、亚硫酸钠中的至少一种；配置凝固液，所述凝固液的组成为：可食用的无机盐 0.01～20 wt.%、食用酒精0～70wt.%、醋酸1～8v/v%、余量为水；纺丝：将所述大豆蛋白纺丝液挤入所述凝固液中，进行湿浴牵伸，干热牵伸、后处理得到大豆蛋白纤维。
11.在一些规模化生产方法的实例中，所述大豆蛋白纺丝液的组成为：大豆蛋白 10～30 wt.%、助溶剂 0.01～1wt.%、可食用的改性剂0～60 wt.%、矫味剂 0～10wt.%、食用色素0～5wt.%、ph 10-13。
12.在一些规模化生产方法的实例中，所述可食用的无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠中的至少一种。
13.在一些规模化生产方法的实例中，所述大豆蛋白纺丝液中进一步添加有辅助蛋白和植物多糖中的至少一种。
14.在一些规模化生产方法的实例中，所述辅助蛋白为非动物来源的蛋白，包括但不限于植物蛋白、发酵蛋白、真菌蛋白。
15.在一些规模化生产方法的实例中，所述辅助蛋白的含量在0-15%之间。
16.在一些规模化生产方法的实例中，所述植物蛋白包括但不限于谷朊蛋白、玉米蛋白、土豆蛋白、豌豆蛋白、大米蛋白中的至少一种。
17.在一些规模化生产方法的实例中，所述发酵蛋白包括但不限于酵母蛋白。
18.在一些规模化生产方法的实例中，所述真菌蛋白包括但不限于蘑菇蛋白。
19.在一些规模化生产方法的实例中，所述植物多糖包括但不限于木薯淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸钠、结冷胶、卡拉胶、魔芋胶、甲基纤维素、葡聚糖、黄原胶、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、亚麻籽胶、可得然胶、果胶、刺槐豆胶、琼脂中的至少一种。
20.在一些规模化生产方法的实例中，所述植物多糖的含量在0-15%之间。
21.在一些规模化生产方法的实例中，所述凝固液的组成为：食盐4～15wt.%、氯化钙2～10wt.%，且二者的总量不超过25wt.%。
22.在一些规模化生产方法的实例中，所述凝固液中添加有风味物质和食用色素中的至少一种。
23.在一些规模化生产方法的实例中，所述风味物质和食用色素包括但不限于乙基麦芽酚、酵母提取物、呈味核苷酸二钠、肉味香精、猪肉味香精、午餐肉香精、鸡肉香精、牛肉香
精、烤牛肉香精、红烧肉香精、菜红色素、红甜菜根粉、红甜菜汁粉、高梁红色素、红曲红色素、红曲黄色素、红曲米粉、橙红色素、姜黄色素、焦糖色、番茄红色素、二氧化钛、胡萝卜粉、柠檬黄色素、栀子黄色素中的至少一种。
24.在一些规模化生产方法的实例中，所述风味物质和食用色素的添加量为0.001%-5%。
25.在一些规模化生产方法的实例中，所述相容性改性使用的功能物质为带正电荷的活性物质。
26.在一些规模化生产方法的实例中，所述带正电荷的活性物质包括但不限于壳聚糖、壳聚寡糖、赖氨酸、聚赖氨酸、组氨酸、乳链菌肽中的至少一种。
27.在一些规模化生产方法的实例中，所述相容性改性的添加量为0.001%-5%。
28.在一些规模化生产方法的实例中，所述的相容性改性的操作包括将大豆蛋白纤维浸入到浓度在0.001-5%之间的功能物质溶液中，在4-100℃条件下进行相容性改性。
29.在一些规模化生产方法的实例中，所述细胞包括但不限于多个肌细胞、多个成纤维细胞、多个成脂细胞、多个肝细胞、多个造血干细胞、多个肝造血干细胞、多个骨髓干细胞、多个脂肪的成纤维细胞、多个脂肪干细胞、多个间质干细胞、多个骨髓基质细胞、多个肌肉侧群细胞、多个血液来源的间质前体细胞、多个肌肉前体细胞、多个循环的骨骼干细胞、多个多潜能成体祖细胞、多个中胚层祖细胞、多个脊髓祖细胞多个混合及其任何组合所组成的一群组的多个培养肉细胞的至少一种。
30.本发明的有益效果是：本发明的一些实例，可以规模化生产得到用于细胞培养肉的大豆蛋白纤维支架，同时不含有不可食用的添加剂。
31.本发明一些实例制备得到的大豆蛋白纤维支架，具有良好的细胞相容性，可以很好地使细胞附着并得到细胞培养肉，该细胞培养肉更接近天然肉的口感。
附图说明
32.图1是实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架材料大体观；图2是实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架微观形貌图；图3是小鼠成肌细胞在实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架上生长形貌图；图4是鸡成纤维细胞（a）和猪成肌细胞（b）在实施例2制备大豆分离蛋白纤维支架上生长形貌图；图5是实施例3制备大豆分离纤维支架大体观和微观形貌图；图6是小鼠成肌细胞在实施例4制备木薯淀粉/大豆蛋白纤维支架上生长形貌图；图7是实施例5制备海藻酸钠/大豆蛋白纤维支架形貌图；图8是实施例5制备谷朊蛋白/大豆蛋白纤维支架形貌图。
具体实施方式
33.用于细胞培养肉的大豆蛋白纤维支架的规模化生产方法，包括如下步骤：配置大豆蛋白纺丝液，所述大豆蛋白纺丝液的组成为：大豆蛋白 5～50 wt.%、助溶剂 0～5wt.%、可食用的改性剂0～60 wt.%、矫味剂 0～10wt.%、食用色素0～5wt.%、ph 9
～14；所述助溶剂选自半胱氨酸、亚硫酸钠中的至少一种；配置凝固液，所述凝固液的组成为：可食用的无机盐 0.01～20 wt.%、食用酒精0～70wt.%、醋酸1～8v/v%、余量为水；纺丝：将所述大豆蛋白纺丝液挤入所述凝固液中，进行湿浴牵伸，干热牵伸、后处理得到大豆蛋白纤维。
34.为了提高大豆纤维支架的纺丝性能和稳定性，可以在纺丝液中复合其他材料，包括但不限于多糖、植物蛋白等食用材料。所述多糖包括但不限于海藻酸钠、结冷胶、卡拉胶、植物淀粉等食用材料的一种或者几种组合，可选蛋白包括但不限于谷朊粉、大豆蛋白、玉米蛋白等植物蛋白的一种或者几种组合，复合材料与大豆蛋白比例在0.01%-60%之间。
35.为了改善口感，赋予大豆纤维支架颜色，可在凝固液中添加风味物质、食用色素等食品添加剂。所述风味物质和食用色素包括但不限于乙基麦芽酚、肉味香精、甜菜红色素、高梁红色素等一种或者几种组合。其添加量可以根据具体的需要进行相应的调整。在一些实例中，添加剂比例在0.001%-5%之间。
36.为了提高大豆纤维蛋白纤维支架的生物相容性，可以使用功能物质对大豆纤维蛋白进行浸泡处理，所述功能物质包括但不限于壳聚糖、赖氨酸、聚赖氨酸等一种或者几种组合，添加比例在0.001%-5%之间。
37.在一些规模化生产方法的实例中，所述大豆蛋白纺丝液的组成为：大豆蛋白 10～30 wt.%、助溶剂 0.01～1wt.%、可食用的改性剂0～60 wt.%、矫味剂 0～10wt.%、食用色素0～5wt.%、ph 10-13。
38.在一些规模化生产方法的实例中，所述可食用的无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化钙、硫酸钠中的至少一种。
39.为了进一步改善大豆蛋白纤维支架的口感，提高其细胞相容性，在一些规模化生产方法的实例中，所述大豆蛋白纺丝液中进一步添加有辅助蛋白和植物多糖中的至少一种。
40.在一些规模化生产方法的实例中，所述大豆蛋白纺丝液中进一步添加有辅助蛋白和植物多糖中的至少一种。
41.在一些规模化生产方法的实例中，所述辅助蛋白为非动物来源的蛋白，包括但不限于植物蛋白、发酵蛋白、真菌蛋白。通过使用非动物来源的蛋白，可以完全摆脱细胞培养肉对动物饲养的依赖。
42.在一些规模化生产方法的实例中，所述辅助蛋白的含量在0～15%之间。其添加量可以根据具体的需要进行相应的调整。
43.在一些规模化生产方法的实例中，所述植物蛋白包括但不限于谷朊蛋白、玉米蛋白、土豆蛋白、豌豆蛋白、大米蛋白中的至少一种。
44.在一些规模化生产方法的实例中，所述发酵蛋白包括但不限于酵母蛋白。
45.在一些规模化生产方法的实例中，所述真菌蛋白包括但不限于蘑菇蛋白。
46.植物多糖可以调整大豆蛋白纤维的强度、弹性等，获得更接近天然肉的口感，同时也有助于提高纤维支架可纺性，在一些规模化生产方法的实例中，所述植物多糖包括但不限于木薯淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、海藻酸钠、结冷胶、卡拉胶、魔芋胶、甲基纤维素、葡聚糖、黄原胶、阿拉伯胶、瓜尔豆胶、亚麻籽胶、可得然胶、果胶、刺槐豆胶、琼脂中的至少一种。
47.在一些规模化生产方法的实例中，所述植物多糖的含量在0～15%之间。
48.在一些规模化生产方法的实例中，所述凝固液的组成为：食盐4～15wt.%、氯化钙2～10wt.%，且二者的总量不超过25wt.%。
49.在一些规模化生产方法的实例中，所述的相容性改性的操作包括将大豆蛋白纤维浸入到浓度在0.001-5%之间的功能物质溶液中，在4～100℃条件下进行相容性改性。
50.本发明一些制备规模化生产方法实施生产的大豆蛋白纤维可以应用于多种细胞的培养。在一些规模化生产方法的实例中，所述细胞选自多个肌细胞、多个成纤维细胞、多个成脂细胞、多个肝细胞、多个造血干细胞、多个肝造血干细胞、多个骨髓干细胞、多个脂肪的成纤维细胞、多个脂肪干细胞、多个间质干细胞、多个骨髓基质细胞、多个肌肉侧群细胞、多个血液来源的间质前体细胞、多个肌肉前体细胞、多个循环的骨骼干细胞、多个多潜能成体祖细胞、多个中胚层祖细胞、多个脊髓祖细胞多个混合及其任何组合所组成的一群组的多个培养肉细胞的至少一种。
51.下面结合实例，进一步说明本发明的技术方案。
52.实施例1：将食用碱溶解于蒸馏水中，调成ph=11碱性溶液，将大豆分离蛋白溶解于溶液中，得到15%质量分数的大豆蛋白纺丝液；通过将食用酒精、醋酸、氯化钙、食用盐等溶解于食用纯水中，得到食用酒精质量分数为50%、醋酸体积分数为4%、食用盐质量分数为8%、食用氯化钙质量分数为5%的凝固液；将纺丝液通过纺丝头挤出进入到凝固液中，通过将纤维进行拉伸，并通过清水清洗得到大豆分离蛋白纤维。
53.将纤维经过120℃湿热灭菌20min后接种细胞，培养细胞肉。
54.图1是实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架材料大体观；图2是实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架微观形貌图；从图1和图2可以看出，湿法纺丝大豆纤维呈现奶白色外观，显微形貌图发现纤维呈现圆形，纤维大小在200μm左右。
55.将小鼠成肌细胞接种在灭菌处理后的大豆分离蛋白纤维支架材料(实施例1)上，在材料上接种细胞数量为2*10^5细胞，将其放置于二氧化碳培养箱中静态条件下进行培养5d，取出材料使用磷酸缓冲液清洗3次，加入二乙酸荧光素（5μg/ml）避光染色5min，使用磷酸缓冲液清洗3次，在荧光倒置显微镜下拍照得到细胞在实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架。图3是小鼠成肌细胞在实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架上生长形貌图；从图3可以看出，细胞在纤维支架上生长良好，细胞基本都已经呈现铺展状态，细胞密度较大，说明制备纤维支架生物相溶性良好。
56.实施例2：配置0.01% 聚赖氨酸溶液，将实施例1制备纤维材料经过清洗后放入到赖氨酸溶液中，60℃下反应1h，再次进行清洗，120℃湿热灭菌20min后用于接种细胞，培养细胞肉。
57.将鸡成纤维细胞和猪成肌细胞接种在灭菌处理后的大豆分离蛋白纤维支架材料上，在材料上接种细胞数量为2*10^5细胞，将其放置于二氧化碳培养箱中静态条件下进行培养2d，取出材料使用磷酸缓冲液清洗3次，加入二乙酸荧光素（5μg/ml）避光染色5min，使用磷酸缓冲液清洗3次，在荧光倒置显微镜下拍照得到细胞在实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架。图4是鸡成纤维细胞（a）和猪成肌细胞（b）在实施例2制备大豆分离蛋白纤维支架上
生长形貌图。从图4可以看出，两种细胞在支架上均黏附良好，细胞都呈现铺展的状态，说明经过改性的纤维支架生物相溶性良好。
58.实施例3：配置1%食用氢氧化钠溶液，加入0.02%半胱氨酸，将大豆分离蛋白溶解于溶液中，得到20%质量分数的大豆蛋白纺丝液；通过将醋酸、氯化钙、食用盐等溶解于食用纯水中，得到醋酸体积分数为4%、食用盐质量分数为8%、食用氯化钙质量分数为5%的凝固液；将纺丝液通过纺丝头挤出进入到凝固液中，通过将纤维进行拉伸，并通过清水清洗得到大豆分离蛋白纤维。
59.图5是实施例3制备纤维大体观和微观形貌图。从图5可以看出，大豆分离蛋白材料得到良好溶解，大豆蛋白呈现圆形状，纤维大小在200μm左右。
60.实施例4将大豆分离蛋白溶解于0.05%食用碱中，得到15%质量分数的大豆分离蛋白溶液，在其中加入木薯淀粉溶解，木薯淀粉添加量为1%；通过将食用酒精、醋酸、氯化钙、食用盐等溶解于食用纯水中，得到食用酒精质量分数为50%、醋酸体积分数为4%、食用盐质量分数为8%、食用氯化钙质量分数为5%的凝固液；通过将纺丝液以30ml/min速度通过纺丝头，进入到纺丝液中，通过将纤维进行拉伸，使用清水清洗得到大豆分离蛋白纤维；将纤维经过120℃湿热灭菌20min后接种细胞，在材料上接种细胞数量为2*10^5细胞，将其放置于二氧化碳培养箱中静态条件下进行培养1d，取出材料使用磷酸缓冲液清洗3次，加入二乙酸荧光素（5μg/ml）避光染色5min，使用磷酸缓冲液清洗3次，在荧光倒置显微镜下拍照得到细胞在实施例1制备大豆分离蛋白纤维支架。。
61.图6是小鼠成肌细胞在实施例4制备木薯淀粉/大豆蛋白纤维支架上生长形貌图。从图6可以看出，细胞在材料上正常黏附，细胞呈现铺展状态，细胞生长情况良好，说明复合纤维材料的细胞相容性良好。
62.实施例5将大豆分离蛋白溶解于0.05%食用碱中，得到15%质量分数的大豆分离蛋白溶液，在其中加入海藻酸钠溶解，海藻酸钠添加量为1%；通过将食用酒精、醋酸、氯化钙、食用盐等溶解于食用纯水中，得到食用酒精质量分数为50%、醋酸体积分数为4%、食用盐质量分数为8%、食用氯化钙质量分数为5%的凝固液；通过将纺丝液以30ml/min速度通过纺丝头，进入到纺丝液中，通过将纤维进行拉伸，并通过清水清洗得到大豆分离蛋白纤维。
63.图7是实施例5制备海藻酸钠/大豆蛋白纤维支架形貌图。从图7可以看出，复合纤维纺丝性能仍良好，大豆蛋白呈现圆形状，纤维大小在200μm左右。
64.实施例6将谷朊粉溶解于1%氢氧化钠中，得到3%质量分数的谷朊蛋白溶液，在其中加入大豆分离蛋白继续溶解，大豆分离蛋白添加量为15%；通过将食用酒精、醋酸、氯化钙、食用盐等溶解于食用纯水中，得到食用酒精质量分数为50%、醋酸体积分数为4%、食用盐质量分数为8%、食用氯化钙质量分数为5%的凝固液；
通过将纺丝液以30ml/min速度通过纺丝头，进入到纺丝液中，通过将纤维进行拉伸，并通过清水清洗得到大豆分离蛋白纤维。
65.图8是实施例6制备谷朊蛋白/大豆蛋白纤维支架形貌图。从图8可以看出，纤维大小在200μm左右，呈现连续状，说明复合纤维纺丝性能仍良好。
66.以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。