一种Bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法与流程

一种bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法
【技术领域】
1.本发明属于生物安全和转基因作物生态风险评价技术领域，特别是涉及一种bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法。


背景技术：

2.将苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis,简称bt)中的抗虫基因转入植物基因组后，培育的抗虫转基因植物品种，不仅显著降低虫害对作物产量的影响，增加农民收入，还避免了大量使用化学农药带来的环境污染、害虫产生抗药性等各种弊端，保护人类健康和生态环境平衡。转基因抗虫植物的利用是害虫防治史上一次巨大的绿色变革，已成为害虫防治重要的措施之一。
3.虽然抗虫转基因植物可以产生很大的经济效益，但也存在很多环境风险和食品安全问题。由于抗虫转基因作物在整个生育期都能表达杀虫蛋白，可能会对直接取食或者间接接触到杀虫蛋白的动物产生影响。与转基因抗虫植物生长的农田环境相邻的沟渠、池塘、湖泊、等自然水域中生活着众多水生生物，转基因抗虫植物在生产过程中可能会使邻近水域中的非靶标水生生物接触到转基因植物及其组织器官；另外，抗虫转基因作物产品已作为饲料原料用于水产养殖，使得水体中的生物暴露于转基因产品之中，因此需要科学的评价转基因作物对水生生物的安全性。
4.大型蚤(daphnia magna)作为重要的水生浮游动物，具有生活周期短、繁殖快、易于实验室培养、且实验项目使用的参数在个体间相对恒定等特点，因此常作为模式生物用于水生生态环境评价。目前，评价bt蛋白对大型蚤的影响通常以表达bt蛋白的转基因作物为材料(如种子或果实、花粉、叶片)，将转基因作物材料充分粉碎至大型蚤可滤食粒径，随后将粉剂制品添加至大型蚤培养液中，再来调查大型蚤的生物学特性是否发生变化，这种方法至少存在以下不足：(1)转基因作物在营养成分、潜在致敏性、代谢产物等方面存在一些不确定因素，导致评价结果不能直接反应bt蛋白对大型蚤的影响；(2)需要把转基因作物器官粉粹至大型蚤可以摄食的粒径，材料处理过程中温度过高会导致杀虫蛋白降解；(3)转基因作物受试物容易黏附于大型蚤的触角、壳刺等部位，使大型蚤浮游能力下降甚至死亡，影响评价结果的准确性；(4)转基因作物材料为有机物，加入大型蚤培养液后容易引起水质恶化，增加了培养液的更新频率和大型蚤转移时的机械性损伤。
5.因此，有必要提供一种新的bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法来解决上述技术问题。


技术实现要素：

6.本发明的主要目的在于提供一种bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法，能够更高效、更准确的体现bt蛋白对水生生物大型蚤的安全性。
7.本发明通过如下技术方案实现上述目的：一种bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法，其包括以下步骤：
8.s1)获取大型蚤：选取培养3代以上遗传背景相同的6～24h孤雌生殖的幼蚤，该幼蚤20℃时重铬酸钾溶液的24h-ec
50
为0.5～1.2mg/l；
9.s2)配制受试溶液：分别配置受试杀虫蛋白溶剂溶液a、重铬酸钾溶液b和受试杀虫蛋白溶液c三种受试溶液；其中，所述受试杀虫蛋白溶剂溶液a为阴性对照组，所述重铬酸钾溶液b为阳性对照组，所述受试杀虫蛋白溶液c为处理组；具体包括：
10.s21)所述杀虫蛋白溶剂溶液a为灭菌蒸馏水或pbs(ph7.4)溶剂(即ph值为7.4的磷酸缓冲盐溶剂)；
11.s22)所述重铬酸钾溶液b的配置方法为：准确称取设定剂量的重铬酸钾，使用纯蒸水溶解后定容；
12.s23)所述受试杀虫蛋白溶液c的配置方法为：将受试杀虫蛋白(即bt蛋白)溶解或均匀悬浮于灭菌蒸馏水或pbs(ph7.4)溶剂中；所述受试杀虫蛋白可直接从转基因植物中提取纯化获得；也可经微生物表达、提取、纯化获得，但需要确保所获得的杀虫蛋白与植物组织中表达的杀虫蛋白具有实质等同性。
13.s3)配置大型蚤培养液：其包括取cacl2·
2h2o溶液d、mgso4·
7h2o溶液e、nahco3溶液f、kcl溶液g四种储备液，充分混合，然后用蒸馏水稀释至1l得到大型蚤培养液，其中cacl2·
2h2o浓度为11.76g/l、mgso4·
7h2o浓度为4.93g/l、nahco3浓度为2.59g/l、kcl浓度为0.25g/l。
14.所述大型蚤培养液的ph为7.8
±
0.2，硬度为250
±
25mg/l(以caco3计)，ca/mg比例约为4:1，溶解氧浓度在空气饱和值的80％以上。
15.s4)培养大型蚤：
16.s41)将步骤s1)中获取的大型蚤单只置于100ml小烧杯中，每器皿添加50ml所述大型蚤培养液，将步骤s2)中的每一种受试溶液作为一个处理，每个处理不少于30个大型蚤。
17.测试时，将三种受试溶液分别添加至大型蚤培养液中，其中，
①
所述重铬酸钾在大型蚤培养液中浓度为500μg/l，该浓度下受试大型蚤存活率和产新生幼蚤总数有显著抑制作用，低于该浓度可能会导致作用效果不明显；
②
所述受试杀虫蛋白在大型蚤培养液中的浓度为大型蚤在自然条件下可能暴露的受试杀虫蛋白最高浓度的10倍以上。
18.s42)大型蚤在培养温度为20
±
1℃，光周期16h:8h(l:d)的人工气候室内进行，测试过程中，每日添加斜生栅藻饵料至烧杯中，使斜生栅藻饵料在培养液中的浓度约为105个/l，每天观察、记录试验蚤死亡头数、新生幼蚤数；新生幼蚤产出后，从试验器皿中移出；每隔2～3d更换所述大型蚤培养液，试验持续时间为21d，通过对比处理组和对照组大型蚤存活率、产新生幼蚤数等指标来评价bt杀虫蛋白对大型蚤的影响。
19.与现有技术相比，本发明一种bt杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法的有益效果在于：将自然条件下大型蚤能接触到的bt蛋白的浓度提高至少10倍，再将bt蛋白直接加入到大型蚤培养液中，使大型蚤通过体表接触、取食(滤食)吸收杀虫蛋白等多种方式在21天内连续暴露于bt蛋白溶液中，记录大型蚤的存活率、产新生幼蚤数是否发生变化，此方法能更高效、更准确的体现bt蛋白对大型蚤的安全性，提高了评价方法的科学性与可靠性，保障了评价结果的有效性，为后续的研究或决策制定提供了有力的支撑。。
【附图说明】
20.图1为本发明实施例一中不同处理组中大型蚤存活率曲线图；
21.图2为本发明实施例一中不同处理组中新生幼蚤总数曲线图；
22.图3为本发明实施例二中不同处理组中大型蚤存活率曲线图；
23.图4为本发明实施例二中不同处理组中新生幼蚤总数曲线图。
【具体实施方式】
24.苏云金芽孢杆菌已广泛运用于生物农药和转基因技术中，其主要作用的杀虫蛋白包含两种：一种是芽胞形成过程中产生的伴胞晶体蛋白(insecticidal crystal proteins，icps)；另一种是在营养生长阶段产生并分泌到胞外的营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins，vips)，这两种杀虫代表分别以cry与vip3a为代表，cry与vip3a毒素氨基酸同源性低，杀虫谱和作用靶标等也不相同，在害虫防治和抗性治理方面均表现出广阔的应用前景。
25.下面结合实施例，对本发明进一步加以说明。
26.实施例1：
27.本实施例为一种mvip3aa杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法，其包括以下步骤：
28.s1)大型蚤获取：选用的大型蚤均为培养3代以上遗传背景相同的6～24h孤雌生殖的幼蚤。试验蚤20℃时重铬酸钾溶液的24h-ec
50
为1.106mg/l，符合大型蚤感性要求(0.9～1.7ppm)，可以作为标准试验生物进行实验。
29.s2)获取受试蛋白mvip3aa：经微生物表达、提取、纯化获得，由北京大北农生物技术有限公司提供。
30.s3)配置大型蚤培养液：其包括取cacl2·
2h2o溶液d、mgso4·
7h2o溶液e、nahco3溶液f、kcl溶液g四种储备液，充分混合，然后用蒸馏水稀释至1l得到大型蚤培养液，其中cacl2·
2h2o浓度为11.76g/l、mgso4·
7h2o浓度为4.93g/l、nahco3浓度为2.59g/l、kcl浓度为0.25g/l。
31.所述大型蚤培养液的ph为7.8
±
0.2，硬度为250
±
25mg/l(以caco3计)，ca/mg比例约为4:1，溶解氧浓度在空气饱和值的80％以上。
32.s4)制作阴性对照组、阳性对照组以及受试蛋白组：
33.1)阴性对照组：在大型蚤培养液中混入等质量的mvip3aa蛋白pbs溶剂(ph7.4)；
34.2)阳性对照组：重铬酸钾浓度为500μg/l的大型蚤培养液；
35.3)受试蛋白组：含有500μg/l mvip3aa蛋白的大型蚤培养液。其配置方法为将1mg受试mvip3aa蛋白均匀悬浮于1ml pbs(ph7.4)溶剂中，随后吸取该溶液25μl均匀混入大型蚤培养液中。
36.s5)随机选择的受试大型蚤单只置于100ml小烧杯中，每烧杯添加50ml培养液。所述阴性对照组、所述阳性对照组以及所述受试蛋白组三个处理组，每个处理组配置3个重复，每个重复10只大型蚤进行实验观察。测试过程中，每日添加斜生栅藻至培养烧杯中，使斜生栅藻在培养液中的浓度约为105个/l。每2～3d更换培养液。试验在温度22
±
1℃，光强为60μmol/m2·
s，光暗比为16h:8h的恒温培养室中持续21天。
37.实验过程中，每天上午9：00定时观察记录试验蚤的生长繁殖情况，记录试验蚤死亡数和产新生幼蚤数，统计完毕后将新生幼蚤移出。
38.使用spss20.0软件中的anova程序对各处理组大型蚤的存活率、新生幼蚤总数指标进行显著性差异分析(α＝0.05)。
39.实验结果分别见图1和图2。由图1和图2可知，与pbs溶剂对照组(无mvip3aa)相比，重铬酸钾阳性对照组的大型蚤的存活率显著降低，产幼蚤总数显著下降，符合阳性对照的实验预期。与pbs溶剂对照组(无mvip3aa)相比，mvip3aa蛋白溶液处理组在存活率和产幼蚤总数指标上均没有显著性差异。该结果表明，本试验选用的mvip3aa对大型蚤的存活和繁殖没有造成不利影响。
40.实施例2：
41.本实施例为一种cry1ab杀虫蛋白对大型蚤安全性影响的评价方法，其包括以下步骤：
42.s1)大型蚤获取：选用培养3代以上遗传背景相同的6～24h孤雌生殖的幼蚤为试验蚤。试验蚤20℃时重铬酸钾溶液的24h-ec
50
为0.962mg/l，符合大型蚤感性要求(0.9～1.7ppm)。
43.s2)获取受试蛋白cry1ab：经微生物表达、提取、纯化获得，购自佑隆生物公司。
44.s3)配置大型蚤培养液：其包括取cacl2·
2h2o溶液d、mgso4·
7h2o溶液e、nahco3溶液f、kcl溶液g四种储备液，充分混合，然后用蒸馏水稀释至1l得到大型蚤培养液，其中cacl2·
2h2o浓度为11.76g/l、mgso4·
7h2o浓度为4.93g/l、nahco3浓度为2.59g/l、kcl浓度为0.25g/l。
45.所述大型蚤培养液的ph为7.8
±
0.2，硬度为250
±
25mg/l(以caco3计)，ca/mg比例约为4:1，溶解氧浓度在空气饱和值的80％以上。
46.s4)制作阴性对照组、阳性对照组以及受试蛋白组：
47.1)阴性对照组：在大型蚤培养液中混入等质量的cry1ab杀虫蛋白pbs溶剂(ph7.4)；
48.2)阳性对照组：将重铬酸钾溶液均匀混入大型蚤培养液中，所述重铬酸钾在培养液中的浓度为500μg/l；
49.3)受试蛋白组：含有1000μg/l cry1ab蛋白的大型蚤培养液。其配置方法为将1mgcry1ab均匀溶解于1mlpbs(ph7.4)溶剂中，随后吸取该溶液50μl均匀混入大型蚤培养液中，所述cry1ab杀虫蛋白在培养液中的浓度即为1000μg/l。
50.s5)随机选择的受试大型蚤单只置于100ml小烧杯中，每烧杯添加50ml培养液。所述阴性对照组、所述阳性对照组以及所述受试蛋白组三个处理组，每个处理组配置3个重复，每重复10只大型蚤进行实验观察。测试过程中，每日添加斜生栅藻至培养烧杯中，使斜生栅藻在培养液中的浓度约为105个/l。每2～3d更换培养液。试验在温度22
±
1℃，光强为60μmol/m2·
s，光暗比为16h:8h的恒温培养室中持续21天。
51.实验过程中，每天上午9：00定时观察记录试验蚤的生长繁殖情况，记录试验蚤死亡数和产幼蚤数，统计完毕后将新生幼蚤移出。
52.使用spss20.0软件中的anova程序对各处理组大型蚤的存活率、新生幼蚤总数指标进行显著性差异分析(α＝0.05)。
53.实验结果分别见图3和图4。由图3和图4可知，与pbs溶剂对照组(无cry1ab)相比，重铬酸钾阳性对照组的大型蚤的存活率显著下降，产幼蚤总数显著下降，符合阳性对照的实验预期。与pbs溶剂对照组(无cry1ab)相比，cry1ab蛋白溶液处理组在存活率和产幼蚤总数指标上均没有显著性差异。该结果表明，本试验选用的cry1ab对大型蚤的存活和繁殖没有造成不利影响。
54.以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。