油菜秸秆降解真菌YQ-A15及其菌剂与应用的制作方法

油菜秸秆降解真菌yq-a15及其菌剂与应用
技术领域
1.本发明涉及农业微生物领域，特别是涉及一株油菜秸秆降解真菌yq-a15及其菌剂与应用。


背景技术：

2.农作物秸秆是自然界中丰富且廉价的生物质资源，相较于煤炭、石油、天然气等化石能源具有可再生性。我国是一个农业大国，秸秆资源十分丰富，全国秸秆总年产量高达10亿吨左右，占世界秸秆总年产量的20％-30％。因此，秸秆资源的高效利用在缓解能源危机、提高土壤肥力、实现农业绿色发展等方面具有重要意义。
3.纤维素作为农作物秸秆的重要组成部分，物质结构复杂，其由成千上万个d-吡喃型葡萄糖残基通过β-1,4-糖苷键连接而成，是一种不溶于水的天然高分子多糖类聚合物。相较物理、化学等处理方法而言，利用微生物分泌纤维素酶降解纤维素类生物质具有反应条件温和、成本低、污染小、可重复利用等优点，已被广泛应用于农业、饲料加工、纺织工业等领域。纤维素酶是一个多酶体系，通过协同作用将天然纤维素水解生成低聚糖并最终转化成葡萄糖。按照其催化模式以及结构特征的不同，将纤维素酶系中的酶组分分为3类，分别是内切葡聚糖酶(endo-β-1,4-glucanase，ec 3.2.1.4)又称c
x
酶或cmc酶、外切葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase，ec 3.2.1.91)又称c1酶、以及β-葡萄糖苷酶(β-glucosidases，ec 3.2.1.21)又称cb酶。在自然界中，纤维素酶来源广泛，真菌、细菌、放线菌均可产生并已被大量报道。其中，真菌所产纤维素酶多为胞外酶，菌丝可穿过细胞壁插入胞内，由内而外降解纤维素，较细菌和放线菌更具降解优势。国内外研究表明，在降解纤维素的真菌中，丝状真菌最具代表性，木霉属(trichoderma)、曲霉属(aspergillus)、青霉属(penicillium)等均具备良好的纤维素降解效果，其中对于木霉属系列菌种的纤维素降解机制研究最为深入。
4.油菜是我国五大油料作物之首，我国油菜生产面积和产量常年位居世界首位，而江苏省作为长江下游油菜优势种植区，油菜秸秆年产量巨大。油菜秸秆本身过高的木质纤维素含量使秸秆内各组分通过不同的结合力而紧密交联，导致油菜秸秆的利用效率远不及水稻、小麦、玉米等主要粮食作物秸秆。同时，由于油菜秸秆“体积大、重量轻”的特点以及收获后抢种水稻等原因，其在农村的主要处置方式仍为直接废弃或露天焚烧，这不仅造成了资源的大量浪费，同时诱发严重的环境污染问题。
5.202110823946.8的发明《秸秆高效速腐菌株、筛选工艺及其应用》公开了一种秸秆高效速腐菌株，微生物保藏编号为cctcc no：m 2021509，分类命名为：绿色木霉trichoderma viride。该菌株有效提高了秸秆的降解率，解决了秸秆难降解的难题。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是提供一种油菜秸秆降解真菌yq-a15及其菌剂与应用。本发明从腐烂油菜秸秆田中筛选出一株高效降解油菜秸秆的菌株，探究菌株对油菜秸秆的
降解特性，为农业废弃物的资源转化与能源转化领域提供依据和方法。
7.为解决上述技术问题，本发明提供一种绿色木霉(trichoderma viride)yq-a15，其保藏编号为cgmcc no：23829。
8.本发明还提供了含有上述绿色木霉(trichoderma viride)yq-a15的菌剂，该菌剂中绿色木霉(trichoderma viride)yq-a15的孢子浓度为1.0
×
10
6～
1.0
×
108cfu
·
ml-1
，优选1.0
×
107cfu
·
ml-1
。
9.本发明还提供了绿色木霉(trichoderma viride)yq-a15在油菜秸秆降解中的应用。
10.本发明从江苏省内腐烂油菜秸秆田筛选出一株绿色木霉(trichoderma viride)yq-a15，其生物学特性为：在pda平板上生长迅速，初期产生絮状白色菌丝体，3-4天后表面变绿，产生孢子，菌丝内部有隔，可形成二级、三级分枝，分枝末端形成瓶状小梗，小梗顶端簇生分生孢子，孢子多为椭圆形，无色或绿色。
11.绿色木霉(trichoderma viride)yq-a15能在羧甲基纤维素钠(cmc-na)培养基上生长，并经刚果红染色及氯化钠脱色后可产生透明圈；且透明圈直径与菌落直径的比值为3.0。
12.本发明具有以下技术优势：
13.添加1ml浓度为1.0
×
107cfu
·
ml-1
的菌株a15孢子悬液于油菜秸秆固体发酵培养基中，置于28℃培养箱内静置培养7天，测得其滤纸酶活力和纤维素内切酶活力分别达到16.13u
·
g-1
及8.16u
·
g-1
。接种菌株a15固体发酵28天后，油菜秸秆的失重率可达29.17％，纤维素、半纤维素含量分别降至29.41％和17.18％。设置模拟秸秆还田盆栽试验，接入菌株a15菌剂降解30天后，油菜秸秆失重率可达57.50％。试验表明，油菜秸秆降解真菌a15可加速油菜秸秆的降解，在油菜秸秆资源化利用方面具备良好的应用前景。
14.绿色木霉(trichoderma viride)yq-a15滤纸酶活力(fpa)远远优于cctcc no：m2021509。
15.综上，本发明从腐烂油菜秸秆田土样中分离筛选出一株可以高效降解油菜秸秆的真菌绿色木霉(trichoderma viride)a15，研究了菌株a15对油菜秸秆的降解特性，旨在为油菜秸秆的高效利用提供科学技术手段。
附图说明
16.下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
17.图1为不同菌株的纤维素酶活力测定结果；
18.图2为菌株a15(yq-a15)的菌落特征及刚果红-透明圈示意图；
19.图2中：a.菌落正面形态；b.菌落反面形态；c.孢子及菌丝形态；d.菌株在刚果红平板上的透明圈；
20.图3为菌株a15(yq-a15)的系统发育分析；
21.图4为菌株a15固体发酵油菜秸秆扫描电镜图；
22.图4中：a.菌株a15的菌丝及孢子囊；b、c、d分别为固体发酵第1、14、28天的油菜秸秆扫描电镜图像；
23.图5为盆栽模拟秸秆还田过程中油菜秸秆形态变化。
具体实施方式
24.下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
25.实施例1：油菜秸秆高效降解菌的分离筛选
26.在油菜田(南京市江宁区世凹桃园)采集腐烂秸秆及其土壤样品以供菌株筛选。
27.新鲜油菜秸秆采集于当季油菜田间(南京市江宁区世凹桃园)，用自来水反复冲洗以去除其表面的泥土与杂质，烘干并用粉碎机进行粉碎后，将样品置于阴凉干燥处保存备用，作为培养基用油菜秸秆粉。
28.称取10g采集的腐烂油菜秸秆及其土壤的混合物作为样品置于250ml锥形瓶中，加入90ml无菌水，在28℃，170r
·
min-1
条件下震荡60min，吸取5ml悬浊液转接至新鲜的富集培养基中，28℃，170r
·
min-1
条件下培养48h，如此重复转接共3次。采用稀释涂布平板法，利用无菌水将富集液分别进行10-4
、10-5
、10-6
梯度稀释，取100μl稀释液涂布到pda平板上，每个浓度梯度设置三个重复，28℃培养7d。观察平板中菌落的生长情况，挑取不同形态的单菌落进行纯培养。
29.将分离纯化后得到的菌株分别点接在羧甲基纤维素钠固体平板上，28℃静置培养3d，随后用1mg
·
ml-1
的刚果红染液染色30min，使其完全浸没菌株表面，弃掉染液，采用1mol
·
l-1
nacl脱色20min。观察透明圈直径(d)与菌落直径(d)的比值(d/d)来初步判断该菌株降解纤维素的能力。
30.随后，添加1ml浓度为1.0
×
107cfu
·
ml-1
的菌株孢子悬液于秸秆固体发酵培养基(2.0g油菜秸秆粉 5ml无机盐培养基)中，28℃条件下静置发酵7d后进行破坏性取样，即，取1g发酵后产物于锥形瓶中，并加入10ml去离子水，在28℃、170r
·
min-1
条件下震荡60min。最后在4℃、12000rpm条件下离心10min，上清液即为粗酶液。采用3,5-二硝基水杨酸比色法(gb/t 23881-2009)测定菌株滤纸酶(fpa)活力及纤维素内切酶(cmc)活力。
31.富集培养基：在250ml锥形瓶中加入油菜秸秆粉5g，nacl 0.9g，(nh4)2so
4 0.3g，0.1mol
·
l-1
pbs缓冲液(ph为7.4)90ml。
32.羧甲基纤维素钠(cmc-na)培养基：kh2po
4 1g，nh4no
3 1g，mgso4·
7h2o 0.5g，cmc-na 15g，酵母粉1g，琼脂粉20g，蒸馏水定容到1l。
33.无机盐培养基：kh2po
4 18g，(nh4)2so
4 5.9g，mgso4·
7h2o 0.5g，cac1
2 0.8g，feso4·
7h2o 5mg，mnso4·
h2o 1.6mg，znso4·
7h2o 1.4mg，coc12·
6h2o 2mg，蒸馏水定容到1l。
34.油菜秸秆固体发酵培养基：在50ml锥形瓶中加入2.0g油菜秸秆粉，5ml无机盐培养基。
35.上述所有的培养基均需要于115℃、灭菌30min后备用，此为常规技术。
36.从腐烂的油菜秸秆土样中分离纯化出的8株真菌(如图1所述)，刚果红-透明圈筛选试验显示不同菌株之间的透明圈现象差异较大，其中菌株a15的d/d值最大为3.0。d/d值在一定程度上反映了纤维素酶活力的高低，但并不是唯一标准。
37.将初筛得到的8株真菌接种于以油菜秸秆为唯一碳源的固体发酵培养基中，测定其发酵7天后的滤纸酶(fpa)活力和纤维素内切酶(cmc)活力。试验结果如图1所示：结果表明菌株a15的滤纸酶活力和内切酶活力均显著高于其他菌株，分别达到16.13u
·
g-1
及
8.16u
·
g-1
。综合初筛以及复筛试验结果，最终获得油菜秸秆高效降解菌株yq-a15。
38.实施例2：菌株a15的鉴定
39.将菌株yq-a15接种于pda平板中央，周围插放盖玻片使菌丝能够向盖玻片上生长，28℃培养3d后，用无菌镊子夹取布满菌丝的盖玻片，置于载破片上，在显微镜下对菌株菌落特征、菌丝、分生孢子梗和分生孢子进行观察。以菌株a15基因组dna为模板，采用its通用引物进行pcr扩增。将扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序分析，并将its测序结果在ncbi上进行相似性比对分析，最后用软件mega7.0构建系统发育树。
40.结果如图2、图3所示：
41.菌株yq-a15在pda平板上生长迅速，初期产生絮状白色菌丝体，3-4天后表面变绿，产生孢子。在显微镜下进行进一步观察，可以明显看到菌丝内部有隔，可形成二级、三级分枝，分枝末端形成瓶状小梗，小梗顶端簇生分生孢子，孢子多为椭圆形，无色或绿色。依据《真菌鉴定手册》，可初步判定菌株yq-a15为木霉属真菌。将菌株yq-a15的its序列(seq id no:1)在ncbi上进行blast比对分析，结果表明菌株yq-a15与绿色木霉发育距离最近。结合菌株的形态学特征和its序列比对分析，鉴定菌株yq-a15为绿色木霉。
42.将该菌株进行了保藏，保藏信息如下：
43.本发明的菌株yq-a15，保藏名称为绿色木霉trichoderma viride，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号：cgmcc no.23829，保藏时间2021年12月02日。
44.实施例3：菌株yq-a15降解油菜秸秆过程中组分变化分析
45.菌株a15孢子悬液的制备方法为：
46.将保存于-80℃冰箱内的菌株yq-a15甘油管在超净工作台内吸取10μl并将其用无菌水稀释104倍，再吸取100μl稀释液，涂布于pda固体培养基上，28℃恒温培养箱培养2天，将有萌发菌丝的培养基用无菌蓝色枪头切割菌块或刮取少量菌丝，转接到新鲜的pda固体平板中央，置于28℃恒温光照培养箱中培养7天后，从而获得布满菌丝及产满孢子的真菌平板。
47.吸取少量无菌水滴至布满菌丝及产满孢子的真菌平板上，用无菌涂布棒轻轻刮取平板表面，并将菌液转移至4层无菌纱布内进行过滤，以去除菌丝和孢子囊；随后，利用血球计数板统计孢子悬液内孢子浓度，并统一稀释至1.0
×
107cfu
·
ml-1
，从而获得浓度为1.0
×
107cfu
·
ml-1
的菌株yq-a15孢子悬液。
48.添加1ml浓度为1.0
×
107cfu
·
ml-1
的菌株yq-a15孢子悬液于油菜秸秆固体发酵培养基(2.0g油菜秸秆粉 5ml无机盐培养基)中，置于28℃培养箱内静置培养，分别于培养的第1、3、7、14、21、28天对发酵产物样品进行破坏性取样。利用差重法计算秸秆失重率，所述测定方法为发酵后产物样品用去离子水反复冲洗后，放入烘箱，调节温度为105℃，烘干至恒重，通过公式计算发酵前后样品的重量变化。
49.失重率计算公式：
[0050][0051]
其中：p为发酵后进行冲洗并烘干后秸秆的质量(g)
[0052]
q为发酵前添加的秸秆初始质量(g)
[0053]
采用改进后的范式洗涤法(van soest)对发酵产物样品中的纤维素、半纤维素、木质素含量进行测定，测定方法为：
[0054]
(1)将经过发酵并高温烘干后的发酵产物样品进行粉碎，过40目筛备用。将空滤袋(ankom，美国)提前放入105℃烘箱内烘干至恒重，在干燥器内冷却至室温后进行称重(质量记为a)。准确称取1g粉碎后的发酵产物样品于滤袋中，用封口机进行密封，做好标记。
[0055]
(2)将装有样品的滤袋放置于全自动纤维分析仪内托盘上，加入2l中性洗涤剂和4mlα-高温淀粉酶，消煮一小时，随后，用水反复冲洗滤袋直至无泡沫为止。
[0056]
(3)将滤袋用丙酮洗涤两次，用乙醚洗涤一次，直至溶液澄清透明。
[0057]
(4)将滤袋放入105℃烘箱内烘干至恒重，在干燥器内冷却至室温后进行称重(质量记为b)。
[0058]
ndf(中性洗涤纤维％)＝(b-a)
×
100％
[0059]
(5)将(4)中烘干后的滤袋放入全自动纤维分析仪内，加入2l酸性洗涤剂和4mlα-高温淀粉酶，消煮一小时。随后，用水反复冲洗滤袋直至无泡沫为止。
[0060]
(6)将滤袋用丙酮洗涤两次，直至溶液澄清透明。
[0061]
(7)将滤袋放入105℃烘箱内烘干至恒重，在干燥器内冷却至室温后进行称重(质量记为c)。
[0062]
adf(酸性洗涤纤维％)＝(c-a)
×
100％
[0063]
(8)预先将g2玻璃砂芯漏斗放入105℃烘箱内烘干至恒重，在干燥器内冷却至室温后进行称重(质量记为d)。漏斗内铺1g预处理后的酸洗石棉，将滤袋中固体物质倒入漏斗内，加入15℃12.0mol
·
l-1
硫酸溶液至半满，用玻璃棒将固体块状物打散并搅拌均匀，消解3小时(根据液体流出量及时用12.0mol
·
l-1
硫酸补足)。随后，应当马上进行抽滤并用热水反复冲洗，直至其变为中性。
[0064]
(9)将漏斗及残余物放入105℃烘箱内烘干至恒重，在干燥器内冷却至室温后进行称重(质量记为e)。
[0065]
(10)再将漏斗放入500℃马弗炉内灼烧3小时，待温度降至100℃左右时将其放入干燥器内进行冷却，称重(质量记为f)。
[0066]
通过公式分别计算纤维素、半纤维素和木质素的含量：
[0067]
纤维素含量(％)＝(d 1 c-a-e)
×
100％
[0068]
半纤维素含量(％)＝ndf-adf
[0069]
木质素含量(％)＝(e-f)
×
100％
[0070]
取1g发酵产物样品于三角瓶中并加入10ml去离子水，室温下震荡一小时后，将样品放入离心机内，12000rpm离心10min，转移上清并过0.45μm滤膜，使用总有机碳/总氮分析仪对样品的水溶性碳、水溶性氮含量进行测定，利用碳氮元素分析仪对样品的总碳、总氮含量进行测定。
[0071]
试验结果如表1所示：
[0072]
表1、菌株a15降解油菜秸秆过程中的组分变化
[0073][0074]
注：不同字母表示处理间在0.05水平差异显著。
[0075]
note:different letters indicate that there is significant difference between treatments at the level of 0.05。
[0076]
随着菌株yq-a15发酵油菜秸秆的时间增加，秸秆的失重率不断上升，28天时可达29.17％，且在发酵初期秸秆的降解速率明显高于发酵后期。同时，秸秆的纤维素含量和半纤维素含量分别下降至29.41％和17.18％，而木质素的相对含量则略微上升至15.47％，表明菌株a15对纤维素及半纤维素均有良好的分解能力。伴随着发酵过程的持续，秸秆中总碳及水溶性氮的含量不断下降，至发酵结束时，总碳的含量下降至456.16g
·
kg-1
，水溶性氮的含量下降至62.17mg
·
l-1
。而秸秆中总氮及水溶性碳的含量则先下降后上升，总氮含量在发酵第7天时达到最小值37.17g
·
kg-1
，发酵第28天时上升为40.91g
·
kg-1
，而水溶性碳含量在发酵第7天时达到最小值460.89mg
·
l-1
，发酵第28天时上升至473.25mg
·
l-1
。
[0077]
实施例4：菌株yq-a15降解油菜秸秆过程中表面结构的变化
[0078]
将在第1、3、7、14、21、28天取出的固体发酵样品分别进行如下操作：浸泡在全新配制的2.5％戊二醛溶液内，4℃固定8h以上。经pbs清洗、乙醇梯度脱水、叔丁醇置换、冷冻干燥后，将样品用双面胶粘贴至样品观察台上(观察面朝上)，进行镀膜，随后利用扫描电镜对
秸秆样品的微观结构进行观察。
[0079]
试验结果如图4所示：
[0080]
发酵第1天时(图4-b)，秸秆木质纤维结构完整，表面平滑，仅出现少许细小圆形孔洞，菌丝开始附着在秸秆表面。当发酵14天时(图4-c)，秸秆表层结构出现明显破裂，由初始的完整平滑状态裂解为无定形松散状态，并伴随出现大量不规则孔洞。当发酵28天时(图4-d)，明显可见秸秆结构被严重破坏，整体呈现出断裂状的碎片状态且秸秆结构变得更加纤细化，出现大量条状裂纹，菌丝体侵入秸秆内部，通过其分泌的水解酶系来有效降解秸秆的木质纤维素结构。
[0081]
实施例5：菌株yq-a15盆栽模拟秸秆还田试验
[0082]
菌株yq-a15进行为期30天的盆栽试验模拟秸秆还田：将油菜秸秆与浓度为1.0
×
107cfu
·
ml-1
菌株a15孢子悬液1g/1ml混匀，装入尼龙网袋，埋入盛有油菜田的盆栽装置，培养30天后，测定秸秆失重率。
[0083]
具体如下：
[0084]
本试验于2021年6-7月在南京农业大学校园进行，试验期间室外温度为20-35℃，供试土壤采集于校白马实验基地当季收获后的油菜田土壤，对供试土壤基本理化性质进行测定(方法参考：《土壤农化分析》鲍士旦)。每个盆栽装置称取3kg土样，用100目尼龙网带装入4g油菜秸秆(长度约为2-3cm)埋入土内约3cm处。设置处理组(使秸秆与浓度为1.0
×
107cfu
·
ml-1
菌株a15孢子悬液按照1g/1ml混匀)以及对照组(秸秆与等量无菌水充分混匀)，试验过程中不断补充水分，以保证盆栽含水率处于60％-80％。分别在培养的第10d、20d、30d进行取样，测量秸秆失重率。
[0085]
试验结果如表2、表3、图5所示：
[0086]
表2、供试土壤理化性质
[0087][0088]
表3、盆栽模拟秸秆还田过程中油菜秸秆失重率变化
[0089][0090]
注：不同字母表示处理间在0.05水平差异显著。“*”表示显著水平(p＜0.05)；“**”表示极显著水平(p＜0.01)
[0091]
note:different letters indicate that there is significant difference between treatments at the level of 0.05.“*”p＜0.05；“**”p＜0.01.
[0092]
随着菌株a15降解油菜秸秆的时间增加，秸秆的腐解程度不断加剧。在初始状态下，秸秆呈现亮黄色，质地坚硬，光泽度良好，而伴随发酵时间的推移，秸秆的颜色发生明显变化，颜色由起初的亮黄色，不断变深变黑逐渐失去光泽，与此同时，秸秆的体积在不断缩小，硬度也持续下降，变得松散柔软易碎，至30天时秸秆失重率达到57.50％，显著高于不接菌对照组的43.88％。试验结果表明，菌株a15可有效降解油菜秸秆，具备良好的应用前景。
[0093]
将目前现有的绿色木霉(trichoderma viride)cctcc no：m 2021509按照上述实施例5所述方法进行检测，所得结果为：30天的培养时间后，秸秆失重率仅仅为48～49％。
[0094]
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。