一种枯草芽孢杆菌前蛋白酶9靶向结合蛋白的筛选方法与应用与流程

1.本发明属于生物医药技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌前蛋白酶9(pcsk9)靶向结合蛋白的制备及其在高胆固醇血症、动脉粥样硬化性心血管病(ascvd)中的应用。


背景技术：

2.高胆固醇血症是动脉粥样硬化性疾病的重要病理生理基础。降脂指南中推荐大剂量他汀类药物作为高危患者(如ascvd)的血胆固醇管理办法，但存在治疗目标与不适反应之间的矛盾，包括：(一)指南要求ascvd患者血清ldl-胆固醇《1.8mmol/l，对于基线ldl-胆固醇水平较高且采用单药治疗的患者而言这一目标极其严格；(二)大剂量他汀类药物多有造成肝功能损害、横纹肌损害等不良反应的风险，部分患者难以耐受；(三)中等剂量他汀 胆固醇摄取抑制剂/胆酸促排剂效果有限。基于以上现实困难，针对新靶点的治疗方法日益得到重视。随着人们逐渐明确肝细胞合成分泌的pcsk9通过降解ldlr在高脂血症发挥作用，pcsk9单克隆抗体(mab)治疗药物为高胆固醇血症甚至ascvd的治疗与管理提供了新的重要途径。但mab疗法存在一定的固有缺陷，包括：mab含fc段，无论是否人源化，都可能与免疫细胞产生交联交互，甚至有非目的性免疫反应发生的可能；mab在体内有诱导抗药抗体(ada)可能(依洛尤单抗、bococizumab均见报道)；且bococizumab的ada因能与其他同类药物产生交叉抗药成为上市失败的重要原因之一；mab制备依赖真核生物细胞，制备工艺复杂，费用昂贵，导致此类药物临床推广不足，使学界中出现了对mab药效/支出比的质疑。因此，开发一种便捷、高效、稳定、低成本的pcsk9靶向结合蛋白有利于高胆固醇血症、ascvd管理，势在必行。


技术实现要素：

3.本发明的目的是通过噬菌体展示肽技术，筛选并制备一种pcsk9靶向结合蛋白，并对其进行功能验证。本发明将为高胆固醇血症与ascvd的治疗与管理提供一种便捷、高效、稳定、低成本的选择。
4.本发明采用的技术方案：一种枯草芽孢杆菌前蛋白酶9靶向结合蛋白的筛选方法，其特征在于：所述的枯草芽孢杆菌前蛋白酶9为pcsk9；所述的筛选方法为：通过噬菌体展示技术、基因测序、质粒稳转大规模表达技术，自噬菌体展示文库中筛选出一种与pcsk9靶向结合蛋白，所述的噬菌体展示肽筛选技术，将噬菌体展示文库在包被pcsk9蛋白的培养皿孵育，使用含0.5％吐温的磷酸盐缓冲液冲洗，所述的含0.5％吐温的磷酸盐缓冲液即为pbst；使用0.5％pbst将非结合性克隆洗脱，保留的结合性克隆经侵染大肠杆菌后以充分扩增、使用vcsm13辅助噬菌体营救发酵后沉淀以提取、聚乙二醇沉降后反复冲洗以纯化，获得筛选后收集的结合性噬菌体；所述的基因测序、质粒稳转表达技术为：将筛选后收集的结合性噬菌体行dna测序，并将测序所得的核苷酸序列转换为蛋白氨基酸序列并比对，将合适序列制备为质粒，借助大肠杆菌体系表达合成；所述的pcsk9靶向结合蛋白，本蛋白是一种线性结
构的蛋白质，由153个氨基酸残基组成，不含二硫键；可特异性的结合由细胞合成、分泌的pcsk9蛋白。所述的枯草芽孢杆菌前蛋白酶9靶向结合蛋白其应用，其特征在于：所述的pcsk9靶向结合蛋白在治疗高胆固醇血症与动脉粥样硬化性心血管病中的应用。
5.与现有技术相比，本发明的有益效果是：本靶向结合蛋白通过原核细胞即可制备，与富含二硫键的mab存在明显不同，克服了现有mab制备方法中构建杂交瘤的复杂工艺、依赖真核生物细胞培养体系的昂贵费用、4℃及以上温度环境中易变性降解所致的储存困难；具有工艺简便、成本低廉、易于储存、避免反复冻融的特点。
6.本靶向结合蛋白不含mab的fc段，分子量远小于mab，与免疫细胞产生交联交互、发生非目的性免疫反应、诱导ada的可能性均低于mab，避免了在临床研究中所报道的mab类药物诱导非目的性免疫反应的固有难题。
7.同时本靶向结合蛋白易于通过现有的各种分子生物学技术进行改造，包括偶联小分子药物、偶联小分子标记物、偶联自身或其他蛋白，使之应用于临床与基础研究的多种用途。
附图说明
8.图1为；噬菌体展示技术筛选pcsk9靶向结合蛋白流程图
9.图2为；筛选获得的pcsk9特异性优势序列
10.图3为；采用酶联免疫吸附实验(elisa)法验证靶向结合蛋白与pcsk9结合能力
11.图4为：使用hepg2、huh7等人肝细胞系验证pcsk9靶向结合蛋白功能
具体实施方式
12.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
13.如图1至4所示，本发明的操作过程如下：
14.一、噬菌体展示文库中筛选pcsk9靶向结合蛋白：
15.(1)将100ug/ml的重组人pcsk9蛋白溶液2ml加入已经开口放置、紫外照射1h后的小皿中，以包被过夜；包被后充分吸除皿内液体，用含0.5％牛血清白蛋白(bsa)的0.5％吐温的磷酸盐缓冲液(0.5％pbst)于37度封闭1h。
16.(2)用2ml 0.5％pbst反复清洗多次后，向小皿中加入2ml噬菌体展示肽库，室温孵育2h，完成孵育过程。
17.(3)小心吸出小皿中的噬菌体溶液，并用2ml 0.5％pbst反复清洗、拍板多次后，加入3ml酸性洗脱液，置于脱色摇床，4度洗20min后加入碱性中和液500ul，摇晃混匀，完成洗脱过程，得到“筛选后扩增前噬菌体液”。可取少量噬菌体液测定滴度。
18.(4)将“筛选后扩增前噬菌体液”全部加入对数生长期大肠杆菌种子液中，置于37度220rpm摇床上侵染1h后，涂布大琼脂培养板中37度过夜形成菌落后，再次将菌落刮入100ml液体2yt培养基中至对数期，完成扩增过程。
19.(5)加入vcsm13噬菌体(10^9pfu/ml)后37℃静置30min营救发酵，离心弃上清，换用新2yt培养基以去除杂菌后，再次离心后去除培养基，并按照原体积1/5加入peg，剧烈震荡后，4度沉降噬菌体过夜后，再次以3000-10000rpm、4度离心15-30min后弃上清，完成提取过程。
20.(6)重复上述离心步骤，充分去除水分；后用pbs2ml吹打溶解沉淀，分装于ep管中，在台式离心机中以10000-15000rpm离心5min后吸出上清，吸出、置于2ml ep管中得到“扩增后噬菌体液”，完成纯化过程。可取200ul测滴度，其余4度保存。
21.(7)可根据需要，将“扩增后噬菌体液”再次重复上述操作2-3个循环。
22.二、大规模合成pcsk9靶向结合蛋白：
23.(1)将“扩增后噬菌体液”侵染大肠杆菌，涂布于小琼脂板中生长过夜后，选取20-40个单菌落各自加入含液体培养基的离心管中扩增、营救发酵、去除杂菌。
24.(2)将发酵液普速离心、高速离心以去除菌体沉淀，后将每个离心管的液相移入各自的新ep管中，得到数个“单克隆噬菌体液”。
25.(3)使用peg沉降“单克隆噬菌体液”中的噬菌体，高速离心后获得固相的噬菌体，并在避光条件下与碘化物、无水乙醇纯化，离心后再次用4摄氏度的70％乙醇纯化，离心后使乙醇挥发后，加入双蒸水吹洗并进行基因测序。
26.(4)使用软件将基因测序结果翻译为蛋白序列，其中能有效合成蛋白质的称为“有效序列”。将有效序列用于合成质粒转染大肠杆菌，充分生长与发酵后，裂解菌体并分选、提取蛋白，即可获得目标靶向结合蛋白。
27.三、酶联免疫吸附实验(elisa)法验证靶向结合蛋白与pcsk9结合能力：
28.(1)使用大肠杆菌表达系统合成编码如下的靶向结合蛋白靶向结合蛋白#3、7、8、11、15、16，并表达阴性对照靶向结合蛋白#0，使用镍柱纯化，使用金斯瑞内毒素去除试剂盒去除内毒素至《0.1eu/μg：
29.靶向结合蛋白#3(n端含有his tag的seq#3)
30.靶向结合蛋白#7(n端含有his tag的seq#7)
31.靶向结合蛋白#8(n端含有his tag的seq#8)
32.靶向结合蛋白#11(n端含有his tag的seq#11)
33.靶向结合蛋白#15(n端含有his tag的seq#15)
34.靶向结合蛋白#16(n端含有his tag的seq#16)
35.靶向结合蛋白#0(n端含有his tag的seq#0)
36.(2)将去除内毒素的重组人pcsk9蛋白溶液2ml包被96孔板，随后加入含有0.5％吐温的磷酸盐缓冲液(0.5％pbst)清洗，并用封闭液封闭。
37.(3)封闭后与靶向结合蛋白#3、7、8、11、15、16、0共孵育2h，使用含有0.5％吐温20的pbs(0.5％pbst)洗去各组靶向结合蛋白后，加入稀释的抗his tag二抗，继续孵育1h后，使用0.5％pbst清洗。随后在室温避光环境下，每孔加入tmb工作液，反应45-90秒后，溶液由无色变为蓝色。加入1mmol/l稀盐酸终止反应，可见溶液由蓝变黄。
38.(4)使用酶标仪，以od450测量吸光度。
39.四、靶向结合蛋白在人肝细胞系中的功能验证：
40.(1)将hepg2、huh7细胞按每孔5x10^3个细胞在24孔板中布板，完全培养基培养24h保证贴壁后，用无血清培养基饥饿过夜；
41.(2)第一列加入完全培养基，第二列加入含野生型pcsk9蛋白的完全培养基，第三列加入含靶向结合蛋白的完全培养基，第四列加入含pcsk9蛋白以及靶向结合蛋白的完全培养基。37℃培养箱中孵育24h后。
42.(3)移除原有培养基后，加入含dii偶联的低密度脂蛋白(dii-ldl)，37℃培养箱中避光孵育4h后。pbs清洗三次后直接荧光镜检，使用罗丹明通道可见摄取的dii-ldl呈红光。
43.(4)加入4％多聚甲醛固定，封闭液封闭后加入兔源抗ldlr一抗孵育过夜；pbs清洗后，加入alexaflour488偶联抗兔igg二抗孵育1小时；pbs清洗后，加入dapi，荧光镜检，使用fitc通道可见胞膜ldlr呈绿光且阳性信号模式明显异于红光信号。
44.综上，本实施例提供了如何是通过噬菌体展示肽技术，筛选并制备一种与pcsk9靶向结合蛋白，以及该蛋白功能鉴定的实验结果。
45.以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的普通技术人员应该了解，上述实施例不以任何形式限制本发明的保护范围，凡采用等同替换等方式所获得的技术方案，均落于本发明的保护范围内。
46.本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。