一种特定HBV序列插入到特定基因区域的细胞模型及其构建方法与应用与流程

一种特定hbv序列插入到特定基因区域的细胞模型及其构建方法与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体地说是涉及一种细胞模型，更为具体地说是涉及一种特定hbv序列插入到特定基因区域的细胞模型，以及该细胞模型的构建方法与应用。


背景技术：

2.病毒整合与多种肿瘤发生关系密切，其中hpv病毒整合与宫颈癌的发生，hbv病毒整合与肝癌的发生具有直接关系。近年来随着高通量测序技术的普及，病毒整合规律特征逐渐显现，多项研究发现了病毒整合在人类基因组上具有热点区域，然而这些热点区域的病毒整合所造成的影响，功能并不明确。目前，亟需开发一种细胞模型(病毒整合)来对病毒整合功能开展研究。现今随机病毒整合的细胞虽已有较多模型，然而在关键基因组位置整合插入特定片段的细胞模型还有待于开发。


技术实现要素：

3.基于上述技术问题，本发明提出一种特定hbv序列插入到特定基因区域的细胞模型及其构建方法与应用。
4.本发明所采用的技术解决方案是：
5.一种特定hbv序列插入到特定基因区域的细胞模型，该细胞模型是采用hbv基因组特定的p序列，定点整合到hepg2细胞系或多类肝细胞系得到。
6.进一步的，所述定点整合是通过采用hbv基因组特定的p序列插入到hepg2细胞的chr5:1295920前后200bp范围内的位置。
7.进一步的，所述定点整合为利用crispr/cas9方法定点敲入。
8.进一步的，所述hbv基因组特定的p序列为序列表中序列1的第652-3263位所示的p序列。
9.一种特定hbv序列插入到特定基因区域的细胞模型的构建方法，步骤如下：
10.利用crispr/cas9方法定点敲入hbv的p序列使其整合到hepg2细胞的chr5:1295920位置200bp区域内，实现所述chr5:1295920位置发生切割，形成dna双链断裂；
11.同时将含有chr5:1295920目标位点上下游同源臂的dna片段p载体导入所述hepg2细胞中，实现hbv的p序列定点整合到hepg2细胞的chr5:1295920位置200bp区域内。
12.进一步的，将表达所述靶向目标位置chr5:1295920区域的grna与cas9二合一质粒载体和含有chr5:1295920目标位点上下游同源臂的hbv基因组特定p序列dna载体，记为dna片段p，导入所述hepg2细胞中；
13.所述grna的靶序列具体为序列2，所述含有chr5:1295920目标位点上下游同源臂的hbv基因组特定p序列dna载体具体为序列1；所述靶向目标位置chr5:1295920区域的grna与cas9二合一质粒载体中还含有puro抗性基因。
14.进一步的，所述grna与cas9的二合一质粒载为向grna克隆载体中通过同源重组连
接的方法整合入序列3所示的dna片段得到的重组载体。
15.进一步的，含有dna片段p的载体为将puc19克隆载体的kpni和sali识别序列间的dna片段替换为序列表中序列1的第415-3498位所示的dna片段得到的重组载体；该重组载体含有序列表中序列1的第415-634位所示的同源臂左臂和序列表中序列1的3279-3498位所示的同源臂右臂，同源臂左臂与同源臂右臂之间还含有序列表中序列1的第652-3263位所示的p序列。
16.进一步的，具体包括以下步骤：
17.a构建grna、cas9二合一表达质粒载体
18.构建用以切割chr5:1295920位置的grna、cas9二合一表达质粒载体，将设计好的grna序列连入grna、cas9克隆载体；
19.根据人类基因组chr5:1295920位置基因组数据查找分析，设计靶向chr5:1295920位置左右的grna序列，然后稀释；将grna、cas9克隆载体用bamhi酶切，回收后的载体片段与稀释的grna-ssdna序列进行同源重组连接，得到序列正确的重组载体；
20.b构建含有chr5:1295920目标位点上下游同源臂的hbv基因组特定p序列dna载体
21.依据grna位置设计同源臂，同时使用pcr的方法获得hbv基因组特定p序列；将同源臂序列先与hbv基因组特定p序列同源重组，再将重组序列构建入puc19载体中；
22.具体地，先对hepg2细胞基因组dna进行pcr扩增，得到同源臂左臂；然后对hepg2细胞基因组dna进行pcr扩增，得到同源臂右臂；再对hbv病毒基因组dna进行扩增获得病毒序列；
23.c获得p序列定点整合hepg2细胞模型
24.采取基于crispr/cas9的基因打靶技术在hepg2细胞中进行特异性切割chr5:1295920目标位点并利用细胞dna的同源重组修复方式定点插入hbv基因组的p序列；
25.c1培养hepg2细胞系；
26.c2将处于对数期增殖的hepg2细胞，pbs清洗一次，消化3-5分钟后，轻轻吹打成单细胞；
27.c3将步骤c2得到的5
×
105个hepg2单细胞，接种于6孔板培养板中；
28.c4待hepg2细胞培养至细胞密度为80％-85％，进行细胞转染；
29.c5转染72h后，进行筛选培养5天；筛选存活的多克隆细胞中可能存在p序列定点整合的hepg2细胞系；
30.c6药筛存活的细胞系pbs清洗一次，消化3-5分钟后，轻轻吹打成单细胞，进行细胞计数，按照每孔1个细胞将细胞悬液接种于96孔细胞培养板；
31.c7待7-10天后，培养板中长出新的克隆，将单克隆进行扩大培养进行p序列定点整合hepg2细胞系的鉴定，获得p序列定点整合hepg2细胞系。
32.本发明还提供了下述x1)-x6)中任一产品：
33.x1)利用所述细胞模型的制备方法得到的细胞模型；
34.x2)细胞特定位点插入hbv基因组特定序列(p)模型，为所述细胞模型；
35.x3)用于构建所述细胞模型的系统，由靶向hepg2细胞的chr5:1295920位置的grna和cas9组成；
36.x4)用于构建所述细胞模型的系统，由表达x3)所述grna和cas9的二合一的载体组
成；
37.x5)用于构建所述细胞模型的系统，由靶向目标位置chr5:1295920的grna与cas9二合一质粒载体和含有chr5:1295920目标位点上下游同源臂的hbv基因组特定p序列dna载体(所述dna片段p)组成；
38.x6)用于所述细胞模型的系统，由所述grna和cas9的二合一的载体和含有所述chr5:1295920目标位点上下游同源臂的hbv基因组特定p序列dna载体(所述dna片段p)组成的载体。
39.如上所述的一种特定hbv序列插入到特定基因区域的细胞模型在下述y1-y4中的任一应用：
40.y1在作为定点整合细胞模型的应用；
41.y2在作为hbv病毒特定基因片段转录细胞模型中的应用；
42.y3在筛选抑制整合病毒转录的应用；
43.y4在确定hbv整合序列空间调控研究中的应用。
44.本发明的有益技术效果是：
45.本发明首先确定了病毒整合热点区域上的位点，进而进行了特定序列的病毒整合(频繁的片段序列p序列)，建立了一株具有特殊性质及基因组特征的病毒整合细胞株或者说细胞模型，这一细胞株的建立可以广泛应用在肝癌与hbv病毒关系研究，抗病毒药物筛选，病毒整合研究等领域，具有非常广阔的市场前景。
46.本发明建立了hbv特定序列的特定整合位点的细胞模型，这一细胞模型能够稳定传代，整合区域及片段稳定存在的特征，可以保证长期稳定使用。
47.本发明建立的细胞模型的增殖能力降低、停留在g2期细胞增多、侵袭及转移能力降低，成球能力提高，病毒序列转录水平增高，细胞基因组空间结构产生明显变化。因此本发明所建立的细胞模型能够用于建立筛选抑制病毒转录化合物的个性化药物筛选平台，并且可以作为病毒基因组定点整合的模型来使用。
48.本发明细胞模型构建方法通过扩增同源臂左臂和同源臂右臂等顺序步骤，可尽量避免引入额外基因组序列。
附图说明
49.图1为p序列及引物设计图；
50.图2示出本发明涉及的pcr鉴定基因组结果；
51.图3示出细胞周期特征；
52.图4示出细胞成球特征；
53.图5为细胞迁移图；
54.图6为病毒基因组转录本丰度图。
具体实施方式
55.下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法步骤，如无特殊说明，均为常规方法步骤。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均可从商业途
径得到。
56.以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
57.下述实施例中的细胞培养条件如无特殊说明，均为37摄氏度，5％co2。
58.下述实施例中用于将grna、cas9的二合一的载体和dna片段p载体导入到细胞中的转染试剂，x-tremegene hp dna transfection reagent(roche,06 366 546 001)。
59.下述实施例中的hepg2细胞系，武汉普诺赛生命科技有限公司(货号：cl-0103)。
60.下述实施例中的细胞培养基配方如下：
61.hepg2细胞培养基配方：
62.mem basic 1x培养基(gibco，c11095500bp)；
63.1％青霉素/链霉素(gibco，15140-122)；
64.10％(体积百分含量)胎牛血清(gibco，10270-106)。
65.本实施例涉及在hepg2细胞中靶向切割位点chr5:1295920，并在切割位点200bp区域定点整合一段hbv基因组特定序列，得到hbv病毒特定基因片段定点整合的hepg2细胞。
66.本发明首先设计并通过分子克隆方法获得靶向人类基因组中chr5:1295920位置两侧的同源臂序列，以及hbv基因组p序列。然后将其构建进入puc19载体(载体为擎科dh5α感受态产品中附赠的puc19通用载体)，获得hbv基因组特定p序列dna载体。再构建靶向人类基因组中chr5:1295920位置的grna、cas9二合一载体(鼓润(武汉)医疗科技有限公司提供)。接着将hbv基因组特定p序列dna载体、grna、cas9二合一载体使用x-tremegene hp dna转染试剂导入hepg2细胞中(图2中a)。其中，质粒转染导入hepg2细胞后，还包括用puro抗生素进行克隆筛选的步骤；在克隆筛选之后还包括对挑选的克隆用基因组pcr的方法对其同源重组的情况进行确认的步骤。
67.具体方法如下：
68.1、构建grna、cas9二合一表达质粒载体
69.构建用以切割chr5:1295920位置的grna、cas9二合一表达载体，将设计好的grna序列连入鼓润(武汉)医疗科技有限公司公司的grna、cas9克隆载体(plasmid#px260-u6-cmv-cas9-puro)中。
70.具体步骤如下：
71.根据人类基因组chr5:1295920位置基因组数据查找分析，设计靶向chr5:1295920位置左右的grna序列。目标序列信息为：cggggcggtcccgtcgagaa(序列2)。合成的单链寡聚核苷酸序列如下：
72.1)hepg2-sg1-ssdna:
73.ttcgattcccggccaatgcacggggcggtcccgtcgagaagttttagagctagaaatagc(序列3)。
74.2)将hepg2-sg1-ssdna稀释到10um。
75.3)将稀释的grna-ssdna序列与grna、cas9克隆载体连接。
76.将grna、cas9克隆载体用bamhi酶切，回收后的载体片段与稀释的grna-ssdna序列进行同源重组连接，反应体系(20μl)如下表1：
77.表1
78.2x multif seamless assembly mix10ulgrna、cas9酶切回收后的载体片段x ul(100ng)
grna-ssdna序列y ul(30um)ddh2o补足至20ul
79.反应温度50℃，反应时间1小时。
80.注：x，y的值根据grna酶切载体和grna-ssdna的浓度决定。一般grna酶切回收后的载体片段和grna序列的摩尔比为1:3-1:10。2x multif seamless assembly mix为abclonal产品(货号，rk21020)。
81.将得到的序列正确的重组载体命名为hepg2-sg1-cas9-puro，hepg2-sg1-cas9-puro含有序列表中序列3所示的dna片段。
82.2、构建含有chr5:1295920目标位点上下游同源臂的hbv基因组特定p序列dna载体(所述dna片段p)
83.依据grna位置设计同源臂，同时使用pcr的方法获得hbv基因组特定p序列。将同源臂序列先与hbv基因组特定p序列同源重组，再将重组序列构建入puc19载体中。具体步骤如下：
84.利用hepg2-donor-left arm primer f和hepg2-donor-left arm primer r对hepg2细胞基因组dna进行pcr扩增，得到同源臂左臂；利用hepg2-donor-right arm primer f和hepg2-donor-right arm primer r对hepg2细胞基因组dna进行pcr扩增，得到同源臂右臂；利用hepg2-p primer f和hepg2-p primer r对hbv病毒基因组dna进行扩增。(最后得到的重组序列为序列1)。用于pcr扩增的酶为kapa hifi hotstart readymix(2x)(kapa biosystems code：km2612)。
85.合成的引物序列如下表2：
86.表2
87.hepg2-donor-left arm primer fctcggtacctgcggcgaggggtccccaccathepg2-donor-left arm primer ratctagatgcattcgcgccctccaccctgtgcgggcghepg2-donor-right arm primer fcatcggatcccgggccgcggcgaggggtccccaccahepg2-donor-right arm primer rgcagtcgacgccctccaccctgtgcgggcghepg2-p primer fcgcgaatgcatctagataggtctcaatcgccgcgtcghepg2-p primer rggcccgggatccgatgtgaaaaagttgcatggtgc
88.将合成的引物均稀释到10um，使用kapa hifi hotstart readymix(2x)进行pcr扩增。反应体系如下表3：
89.表3
90.kapa hifi hotstart readymix(2x)25ulf primer(10um)2.5ulr primer(10um)2.5uldna100ngddh2o补足至50ul
91.反应条件如下：
92.反应温度98℃，反应时间3min；32周期(其中98℃反应15s，65℃反应30s，72℃下60s/kb)，72℃反应10min；16℃反应1min。
93.反应完成后，用pcr回收试剂盒(qiaquick，cat.no.28106)回收目的片段。
94.将puc19克隆载体使用apaⅰ和xhoⅰ酶切，酶切反应完成后，用pcr回收试剂盒(qiaquick，cat.no.28106)回收。
95.将pcr扩增得到的同源臂左臂、右臂以及hbv-p序列以同源重组无缝克隆连接方式连接至puc19载体。反应体系(20μl)如下表4：
96.表4
97.2x multif seamless assembly mix10ulhepg2-donor-left序列x ulhepg2-donor-right序列y ulhepg2-p序列z ulpuc19酶切回收序列m ulddh2o补足至20ul
98.注：x，y，z，m的值根据对应回收产物的片段大小和浓度决定。dna总入量为10pmol。2x multif seamless assembly mix为abclonal产品(货号，rk21020)。
99.3、获得p序列定点整合hepg2细胞系
100.采取基于crispr/cas9的基因打靶技术在hepg2细胞中进行特异性切割chr5:xxxx目标位点并利用细胞dna的同源重组修复(hdr)方式定点插入hbv基因组的p序列。具体步骤如下：
101.1)培养hepg2细胞系，培养方法如下：
102.将冻存的hepg2细胞复苏接种至6cm培养板中，使用mem basic 1x培养基(gibco，c11095500bp) 10％胎牛血清(gibco，10270-106) 1％青霉素/链霉素(gibco，15140-122)培养。
103.2)将处于对数期增殖的hepg2细胞，pbs清洗一次，0.25％trypsin-edta(gibco)消化3-5分钟后，轻轻吹打成单细胞。
104.3)将步骤2)得到的5
×
105个hepg2单细胞，接种于6孔板培养板中。
105.4)待hepg2细胞培养至细胞密度为80％左右，进行细胞转染。具体步骤如下：
106.准备1个干净无菌的1.5ml ep管，依次加入400ul无血清的mem培养基、1ug hepg2-sg1-cas9-puro、3ug hbv基因组特定p序列dna载体(所述dna片段p)、12ul x-tremegene hp dna transfection reagent(roche，06 366 546 001)，轻轻吹打混匀室温静置孵育20min后逐滴加入6孔板培养的hepg2细胞培养板中；轻轻晃动培养板使转染复合物均匀分布在培养基中。
107.5)转染72h后，将hepg2细胞培养基换成puro终浓度为0.5ug/ml的mem完全培养基进行筛选培养5天。筛选存活的多克隆细胞中可能存在p序列定点整合的hepg2细胞系。
108.6)药筛存活的细胞系pbs清洗一次，0.25％trypsin-edta(gibco)消化3-5分钟后，轻轻吹打成单细胞，进行细胞计数，按照每孔1个细胞将细胞悬液接种于96孔细胞培养板。
109.7)7-10天后，待培养板中长出新的克隆，将单克隆进行扩大培养进行下一步p序列定点整合hepg2细胞系的鉴定，以获得p序列定点整合hepg2细胞系。
110.对上述p序列定点整合hepg2细胞系进行鉴定，具体如下：
111.通过pcr、sanger测序、ngs高通量捕获测序等手段鉴定药筛存活的克隆是否存在p序列定点整合的hepg2细胞系，具体分别从如下几个方面进行检测：hbv的p序列插入基因组
位置是否正确、hbv的p序列是否完整。
112.(1)pcr测序鉴定hepg2细胞基因组
113.提取野生型hepg2细胞以及生长起来的单克隆细胞dna，分别检测基因组中hbv的p序列是否插入(hbv-p-f1 hbv-p-r1)、hbv的p序列插入基因组位置是否正确(hepg2-pcik-f1 hepg2-pick-r1)、hbv的p序列是否完整(hepg2-gene-f hepg2-gene-r)。
114.其扩增引物序列如下：
115.hbv-p-f1：5
’‑
accaatcgccagtcaggaag-3’116.hbv-p-r1：5
’‑
tgaggcatagcagcaggatg-3’117.hepg2-pcik-f1：5
’‑
ggcccgtcatttctctttgc-3’118.hepg2-pick-r1：5
’‑
gtgacccacaaaatgaggcg-3’119.hepg2-gene-f：5
’‑
gacttgggctccttgacaca-3’120.hepg2-gene-r：5
’‑
gacctcagctacagcatccc-3’121.其中，hbv-p-f1，hbv-p-r1均位hbv-p序列上，hepg2-pcik-f1位于人类基因组chr5:1295920上游，hepg2-pick-r1位于hbv-p序列上，hepg2-gene-f和hepg2-gene-r分别位于人类基因组chr5:1295920上游和下游。
122.各引物位置如图2中所示。pcr鉴定结果如图2中a、b所示，hbv-p全长序列测序结果如图2中d所示。
123.图1为本发明涉及的pcr引物说明：hbv-p-f1，hbv-p-r1均为hbv-p序列上，只有插入了hbv-p序列的hepg2细胞才能扩增出目的片段(目的片段大小为508bp)。hepg2-pcik-f1位于人类基因组chr5:1295920上游，hepg2-pick-r1位于hbv-p序列上，只有hbv-p序列定点整合到chr5:1295920位置区域内的hepg2细胞才能扩增出目的片段(目的片段大小为689bp)；hepg2-gene-f和hepg2-gene-r分别位于人类基因组chr5:1295920上游和下游，未整合p序列的hepg2细胞只能扩增出512bp的条带，hbv-p序列完整定点整合的细胞可扩增出3376bp的目的片段。
124.图2为本发明涉及的pcr鉴定基因组结果。其中a为鉴定p序列是否插入到hepg2细胞基因组结果(只有8号单克隆细胞检测到目的片段)；b为鉴定8号单克隆细胞种的p序列插入基因组位置是否正确(只有定点插入到chr5:1295920位置200bp区域的hepg2细胞才能扩增出目的片段)；c为鉴定定点整合的p序列是否序列完整，并进行了三代测序的验证，确定插入序列完整性及准确性。
125.hbv-p基因序列(2612bp)：
126.aggtctcaat cgccgcgtcg cagaagatct caatctcggg aatctcaatg 50
127.ttagtattcc ttggactcat aaggtgggga actttactgg gctttattct 100
128.tctactgtac ctgtctttaa tcctcattgg aaaacaccat cttttcctaa 150
129.tatacattta caccaagaca ttatcaaaaa atgtgaacag tttgtaggcc 200
130.cactcacagt taatgagaaa agaagattgc aattgattat gcctgccagg 250
131.ttttatccaa aggttaccaa atatttacca ttggataagg gtattaaacc 300
132.ttattatcca gaacatctag ttaatcatta cttccaaact agacactatt 350
133.tacacactct atggaaggcg ggtatattat ataagagaga aacaacacat 400
134.agcgcctcat tttgtgggtc accatattct tgggaacaag atctacagca 450
135.tggggcagaa tctttccacc agcaatcctc tgggattctt tcccgaccac 500
136.cagttggatc cagccttcag agcaaacacc gcaaatccag attgggactt 550
137.caatcccaac aaggacacct ggccagacgc caacaaggta ggagctggag 600
138.cattcgggct gggtttcacc ccaccgcacg gaggcctttt ggggtggagc 650
139.cctcaggctc agggcatact acaaactttg ccagcaaatc cgcctcctgc 700
140.ctccaccaat cgccagtcag gaaggcagcc taccccgctg tctccacctt 750
141.tgagaaacac tcatcctcag gccatgcagt ggaattccac aaccttccac 800
142.caaactctgc aagatcccag agtgagaggc ctgtatttcc ctgctggtgg 850
143.ctccagttca ggaacagtaa accctgttct gactactgcc tctcccttat 900
144.cgtcaatctt ctcgaggatt ggggaccctg cgctgaacat ggagaacatc 950
145.acatcaggat tcctaggacc ccttctcgtg ttacaggcgg ggtttttctt 1000
146.gttgacaaga atcctcacaa taccgcagag tctagactcg tggtggactt 1050
147.ctctcaattt tctaggggga actaccgtgt gtcttggcca aaattcgcag 1100
148.tccccaacct ccaatcactc accaacctct tgtcctccaa cttgtcctgg 1150
149.ttatcgctgg atgtgtctgc ggcgttttat catcttcctc ttcatcctgc 1200
150.tgctatgcct catcttcttg ttggttcttc tggactatca aggtatgttg 1250
151.cccgtttgtc ctctaattcc aggatcctca acaaccagca cgggaccatg 1300
152.ccggacctgc atgactactg ctcaaggaac ctctatgtat ccctcctgtt 1350
153.gctgtaccaa accttcggac ggaaattgca cctgtattcc catcccatca 1400
154.tcctgggctt tcggaaaatt cctatgggag tgggcctcag cccgtttctc 1450
155.ctggctcagt ttactagtgc catttgttca gtggttcgta gggctttccc 1500
156.ccactgtttg gctttcagtt atatggatga tgtggtattg ggggccaagt 1550
157.ctgtacagca tcttgagtcc ctttttaccg ctgttaccaa ttttcttttg 1600
158.tctttgggta tacatttaaa ccctaacaaa acaaagagat ggggttactc 1650
159.tctaaatttt atgggttatg tcattggatg ttatgggtcc ttgccacaag 1700
160.aacacatcat acaaaaaatc aaagaatgtt ttagaaaact tcctattaac 1750
161.aggcctattg attggaaagt atgtcaacga attgtgggtc ttttgggttt 1800
162.tgctgcccct tttacacaat gtggttatcc tgcgttgatg cctttgtatg 1850
163.catgtattca atctaagcag gctttcactt tctcgccaac ttacaaggcc 1900
164.tttctgtgta aacaatacct gaacctttac cccgttgccc ggcaacggcc 1950
165.aggtctgtgc caagtgtttg ctgacgcaac ccccactggc tggggcttgg 2000
166.tcatgggcca tcagcgcatg cgtggaacct tttcggctcc tctgccgatc 2050
167.catactgcgg aactcctagc cgcttgtttt gctcgcagca ggtctggagc 2100
168.aaacattatc gggactgata actctgttgt cctatcccgc aaatatacat 2150
169.cgtttccatg gctgctaggc tgtgctgcca actggatcct gcgcgggacg 2200
170.tcctttgttt acgtcccgtc ggcgctgaat cctgcggacg acccttctcg 2250
171.gggtcgcttg ggactctctc gtccccttct ccgtctgccg ttccgaccga 2300
172.ccacggggcg cacctctctt tacgcggact ccccgtctgt gccttctcat 2350
173.ctgccggacc gtgtgcactt cgcttcacct ctgcacgtcg catggagacc 2400
174.accgtgaacg cccaccaaat attgcccaag gtcttacata agaggactct 2450
175.tggactctca gcaatgtcaa cgaccgacct tgaggcatac ttcaaagact 2500
176.gtttgtttaa agactgggag gagttggggg aggagattag gttaaaggtc 2550
177.tttgtactag gaggctgtag gcataaattg gtctgcgcac cagcaccatg 2600
178.caactttttc ac
179.图3示出细胞周期特征。从图3中可看出，定点整合后的细胞出现了定点整合的hepg2细胞较未整合的hepg2细胞，s期增多(p＜0.05)，g2期减少(p＜0.05)。
180.图4示出细胞成球特征，a代表hepg2；b代表定点整合后hepg2。从图中可看出，病毒整合后成球特征更为明显。
181.图5为细胞迁移图，a代表hepg2；b代表定点整合后hepg2。从图中可看出迁移特征减弱。
182.图6为病毒基因组转录本丰度图(三个重复样本，检测病毒序列转录丰度)。
183.总体来说病毒整合进入特定位点的hepg2细胞系(hepg2-ly8)，此细胞系拥有稳定的病毒整合位点，形成病毒转录本并且具有细胞周期特征明显改变、迁移能力降低、成球能力增强的特征。
184.本发明一方面在人类基因组关键基因区域内的位点(chr5:1295920的200bp区域内)进行定点敲入；另一方面敲入了特定的较长序列(hbv基因组p序列)；而且hepg2在定点敲入后具有了自身特有特征，比如病毒序列转录，增殖活力改变，细胞周期变化，成球状态明显等特征。
185.本发明建立了hbv特定序列的特定整合位点的模型，这一模型能够稳定传代，整合区域及片段稳定存在的特征，可以保证长期稳定使用。
186.序列1全长序列：
187.tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg 50
188.gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg 100
189.tcagggcgcg tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg 150
190.cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata 200
191.ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc attcgccatt 250
192.caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
193.tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta 350
194.acgccagggt tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt 400
195.cgagctcggt acctgcggcg aggggtcccc accatgagca aaccacccca 450
196.aatctgttaa tcacccaccg gggcggtccc gtcgagaaag ggtgggaaat 500
197.ggagccaggc gctcctgctg gccgcgcacc gggcgcctca caccagccac 550
198.aacggccttg accctgggcc ccggcactct gtctggcaga tgaggccaac 600
199.atctggtcac atcccgcccg cacagggtgg agggcgcgaa tgcatctaga 650
200.taggtctcaa tcgccgcgtc gcagaagatc tcaatctcgg gaatctcaat 700
201.gttagtattc cttggactca taaggtgggg aactttactg ggctttattc 750
202.ttctactgta cctgtcttta atcctcattg gaaaacacca tcttttccta 800
203.atatacattt acaccaagac attatcaaaa aatgtgaaca gtttgtaggc 850
204.ccactcacag ttaatgagaa aagaagattg caattgatta tgcctgccag 900
205.gttttatcca aaggttacca aatatttacc attggataag ggtattaaac 950
206.cttattatcc agaacatcta gttaatcatt acttccaaac tagacactat 1000
207.ttacacactc tatggaaggc gggtatatta tataagagag aaacaacaca 1050
208.tagcgcctca ttttgtgggt caccatattc ttgggaacaa gatctacagc 1100
209.atggggcaga atctttccac cagcaatcct ctgggattct ttcccgacca 1150
210.ccagttggat ccagccttca gagcaaacac cgcaaatcca gattgggact 1200
211.tcaatcccaa caaggacacc tggccagacg ccaacaaggt aggagctgga 1250
212.gcattcgggc tgggtttcac cccaccgcac ggaggccttt tggggtggag 1300
213.ccctcaggct cagggcatac tacaaacttt gccagcaaat ccgcctcctg 1350
214.cctccaccaa tcgccagtca ggaaggcagc ctaccccgct gtctccacct 1400
215.ttgagaaaca ctcatcctca ggccatgcag tggaattcca caaccttcca 1450
216.ccaaactctg caagatccca gagtgagagg cctgtatttc cctgctggtg 1500
217.gctccagttc aggaacagta aaccctgttc tgactactgc ctctccctta 1550
218.tcgtcaatct tctcgaggat tggggaccct gcgctgaaca tggagaacat 1600
219.cacatcagga ttcctaggac cccttctcgt gttacaggcg gggtttttct 1650
220.tgttgacaag aatcctcaca ataccgcaga gtctagactc gtggtggact 1700
221.tctctcaatt ttctaggggg aactaccgtg tgtcttggcc aaaattcgca 1750
222.gtccccaacc tccaatcact caccaacctc ttgtcctcca acttgtcctg 1800
223.gttatcgctg gatgtgtctg cggcgtttta tcatcttcct cttcatcctg 1850
224.ctgctatgcc tcatcttctt gttggttctt ctggactatc aaggtatgtt 1900
225.gcccgtttgt cctctaattc caggatcctc aacaaccagc acgggaccat 1950
226.gccggacctg catgactact gctcaaggaa cctctatgta tccctcctgt 2000
227.tgctgtacca aaccttcgga cggaaattgc acctgtattc ccatcccatc 2050
228.atcctgggct ttcggaaaat tcctatggga gtgggcctca gcccgtttct 2100
229.cctggctcag tttactagtg ccatttgttc agtggttcgt agggctttcc 2150
230.cccactgttt ggctttcagt tatatggatg atgtggtatt gggggccaag 2200
231.tctgtacagc atcttgagtc cctttttacc gctgttacca attttctttt 2250
232.gtctttgggt atacatttaa accctaacaa aacaaagaga tggggttact 2300
233.ctctaaattt tatgggttat gtcattggat gttatgggtc cttgccacaa 2350
234.gaacacatca tacaaaaaat caaagaatgt tttagaaaac ttcctattaa 2400
235.caggcctatt gattggaaag tatgtcaacg aattgtgggt cttttgggtt 2450
236.ttgctgcccc ttttacacaa tgtggttatc ctgcgttgat gcctttgtat 2500
237.gcatgtattc aatctaagca ggctttcact ttctcgccaa cttacaaggc 2550
238.ctttctgtgt aaacaatacc tgaaccttta ccccgttgcc cggcaacggc 2600
239.caggtctgtg ccaagtgttt gctgacgcaa cccccactgg ctggggcttg 2650
240.gtcatgggcc atcagcgcat gcgtggaacc ttttcggctc ctctgccgat 2700
241.ccatactgcg gaactcctag ccgcttgttt tgctcgcagc aggtctggag 2750
242.caaacattat cgggactgat aactctgttg tcctatcccg caaatataca 2800
243.tcgtttccat ggctgctagg ctgtgctgcc aactggatcc tgcgcgggac 2850
244.gtcctttgtt tacgtcccgt cggcgctgaa tcctgcggac gacccttctc 2900
245.ggggtcgctt gggactctct cgtccccttc tccgtctgcc gttccgaccg 2950
246.accacggggc gcacctctct ttacgcggac tccccgtctg tgccttctca 3000
247.tctgccggac cgtgtgcact tcgcttcacc tctgcacgtc gcatggagac 3050
248.caccgtgaac gcccaccaaa tattgcccaa ggtcttacat aagaggactc 3100
249.ttggactctc agcaatgtca acgaccgacc ttgaggcata cttcaaagac 3150
250.tgtttgttta aagactggga ggagttgggg gaggagatta ggttaaaggt 3200
251.ctttgtacta ggaggctgta ggcataaatt ggtctgcgca ccagcaccat 3250
252.gcaacttttt cacatcggat cccgggccgc ggcgaggggt ccccaccatg 3300
253.agcaaaccac cccaaatctg ttaatcaccc accggggcgg tcccgtcgag 3350
254.aaagggtggg aaatggagcc aggcgctcct gctggccgcg caccgggcgc 3400
255.ctcacaccag ccacaacggc cttgaccctg ggccccggca ctctgtctgg 3450
256.cagatgaggc caacatctgg tcacatcccg cccgcacagg gtggagggcg 3500
257.tcgactgcag aggcctgcat gcaagcttgg cgtaatcatg gtcatagctg 3550
258.tttcctgtgt gaaattgtta tccgctcaca attccacaca acatacgagc 3600
259.cggaagcata aagtgtaaag cctggggtgc ctaatgagtg agctaactca 3650
260.cattaattgc gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg 3700
261.tgccagctgc attaatgaat cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg 3750
262.tattgggcgc tcttccgctt cctcgctcac tgactcgctg cgctcggtcg 3800
263.ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt aatacggtta 3850
264.tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 3900
265.gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata 3950
266.ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg 4000
267.tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 4050
268.ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 4100
269.ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt 4150
270.aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4200
271.cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 4250
272.ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact 4300
273.ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 4350
274.gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 4400
275.gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga 4450
276.tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 4500
277.gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 4550
278.ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 4600
279.gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 4650
280.atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 4700
281.gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt 4750
282.cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg 4800
283.ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 4850
284.gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc 4900
285.gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 4950
286.ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 5000
287.acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt 5050
288.atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc 5100
289.ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 5150
290.tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg 5200
291.cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 5250
292.tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 5300
293.gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact 5350
294.ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag 5400
295.gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 5450
296.actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa 5500
297.acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 5550
298.ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 5600
299.gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa 5650
300.caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgacgtcta 5700
301.agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg cgtatcacga 5750
302.ggccctttcg tc