一种用于临床样本检测的快速提取核酸方法与流程

1.本发明涉及临床样本检测技术领域，具体为一种用于临床样本检测的快速提取核酸方法。


背景技术：

2.核酸是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础，无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要从复杂多样的生物样本中迅速有效地分离和提取所需要的基因组核酸，而且抽提后的核酸质量及其完整性都会直接影响到随后的实验结果。
3.对于利用核酸扩增技术进行分子诊断的主要挑战是扩增前含核酸材料的预处理以及繁杂的核酸提取步骤，目前广泛使用的基于二氧化硅和基于磁珠的技术存在着诸多缺陷，包括效率过低(≤10％)；还有需要针对特定靶标类型进行优化，造成一种样品类型的提取过程通常与其他样品类型不相容；而利用酚氯仿的方法虽然回收率高，但是由于提取液组分的毒性高而限制了其适用范围；基于去污剂的方法溶解过程简单，但需要进行高温变性(95℃)处理，另外由于反转录酶不是热稳定的，因此不适用于单步骤rt-pcr。
4.目前现行的提取核酸的方法需要进行反复的离心，提取步骤繁杂、耗费时间长、需要特定的设备，无法快速提取。
5.综上所述，本发明提供一种用于临床样本检测的快速提取核酸方法来解决这一问题。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种用于临床样本检测的快速提取核酸方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.一种用于临床样本检测的快速提取核酸方法，包括以下步骤：
9.s1，取0.5ml-1ml临床生物样本，将临床生物样本加入装有混合磁珠的试管中，混合均匀后静置12min-15min，将试管置于磁力架上并静置3min-5min后，送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心3.5min，吸弃上清液；
10.s2，向试管中加入1.5ml生理盐水，在旋涡振荡器内振荡打散沉淀，送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心6min-9min，吸弃上清液，使用移液枪向试管中加入85ul-90ul第一处理液，等待试管内溶液变得清亮后再加入15ul-20ul的醋酸钾缓冲液，混合均匀，等待试管内出现白色絮状沉淀后，再次送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心6.5min-8.5min，吸弃上清液，并向试管中加入洗涤液，混合均匀后，置于磁力架上放置5.5min-6min，收集洗脱液，即得临床生物样本核酸溶液；
11.s3，将临床生物样本核酸溶液送入装有提取液的收集管中，混合均匀后，将吸附膜浸渍于提取溶液，静置15min-20min，将吸附膜取出，使用洗脱液缓慢清洗吸附膜，再将吸附膜置于pcr反应液，调节pcr反应液的ph为8.4，吸附膜向pcr反应液中释放核酸。
12.作为本发明优选的方案，所述s1中混合磁珠由免疫磁珠和核酸提取磁珠混合制成，免疫磁珠为病毒抗体或受体等通过与磁性微球表面的羟基、羧基、氨基或环氧基键合得到的mnp-ab，核酸提取磁珠为硅羟基磁珠、羧基磁珠或其他可在特定条件下结合病毒核酸的磁珠，病毒抗体包括囊膜病毒的外膜蛋白、不带囊膜病毒的外壳蛋白抗体或核衣壳蛋白抗体，囊膜病毒的外膜蛋白抗体为f蛋白、m蛋白、n蛋白或s蛋白的抗体，病毒受体为与病毒特异性结合的单体或多分子复合物。
13.作为本发明优选的方案，所述s2中使用移液枪加入第一处理液时，需要用移液枪温柔吹散试管内的沉淀细胞，并盖紧管盖缓慢地震荡试管，不要剧烈震荡。
14.作为本发明优选的方案，所述s2中第一处理液由chelex-100、mnaoh、sds以及生理盐水混合制成，chelex-100的浓度为11.5％-12％，naoh的浓度为0.45m-0.48m，sds的浓度为5.5％-5.8％，第一处理液的ph为13.5-13.9。
15.作为本发明优选的方案，所述s2中醋酸钾缓冲液的ph为5.8-5.9。
16.作为本发明优选的方案，所述s2中混合均匀的具体操作步骤为：盖紧管口，将试管颠倒数次混匀并用手指轻轻弹试管底数次。
17.作为本发明优选的方案，所述s3中提取液由异硫氰酸胍、tritonx100、tween-20、蛋白酶k、mnacl、medta、tween-20以及sds混合制成，异硫氰酸胍的浓度为2.2m-2.3m，tritonx100的浓度为0.52wt％，tween-20的浓度为1.3wt％，蛋白酶k的浓度为61μg/ml，mnacl的浓度为151m，medta的浓度为12m，sds的浓度为0.55％，提取液的ph值为8.1。
18.作为本发明优选的方案，所述s3中吸附膜是经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜。
19.作为本发明优选的方案，所述s3中的洗脱液为0.12wt％tween-20的tris缓冲液，洗脱液的ph值为8.2。
20.作为本发明优选的方案，所述s2中洗涤液由5.5m盐酸胍、56％无水乙醇以及80μg/ml蛋白酶k的混合制成，ph值为6-7。
21.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
22.1、本发明中，通过将临床生物样本加入装有混合磁珠的试管中，混合均匀后送入离心机中进行离心处理，吸弃上清液，向试管中加入生理盐水，在旋涡振荡器内振荡打散沉淀，送入离心机中进行离心处理，吸弃上清液，使用移液枪向试管中加入第一处理液和醋酸钾缓冲液，混合均匀，等待试管内出现白色絮状沉淀后，再次送入离心机中进行离心处理，取上清液往试管中加入洗涤液，收集洗脱液，即得临床生物样本核酸溶液，将临床生物样本核酸溶液送入装有提取液的收集管中，混合均匀后，将吸附膜浸渍于提取溶液，将吸附膜取出，使用洗脱液缓慢清洗吸附膜，再将吸附膜置于pcr反应液，吸附膜向pcr反应液中释放核酸，免疫磁珠和核酸提取磁珠可以对核酸进行特异性的吸附，并在洗涤液中被洗脱下来，从而达到对核酸进行提取纯化的目的，特异性吸附率高，病毒的回收率高，且可重复性强自动化操作步骤少，成本低，同时采用碱性的第一处理液来裂解样本，使细胞膜破裂，细胞中蛋白与十二烷基磺酸钠(sds)结合，sds中钠离子与钾离子置换后生成不溶于水的十二烷基磺酸钾(pds)，从而达到分离核酸的目的，整个提取过程花费时间较短，大大缩短了提取时间，再通过在弱碱性条件下，使带负电的核酸吸附于经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜，再通过洗脱液进行洗脱，以快速地获得核酸，提取过程快速、杂质少、对温度的限制性
小、核酸不易解离，从而能够快速地提取核酸样本。
具体实施方式
23.下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
24.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同，本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明，本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
25.本发明提供一种技术方案：
26.一种用于临床样本检测的快速提取核酸方法，包括以下步骤：
27.s1，取0.5ml-1ml临床生物样本，将临床生物样本加入装有混合磁珠的试管中，混合均匀后静置12min-15min，将试管置于磁力架上并静置3min-5min后，送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心3.5min，吸弃上清液；
28.s2，向试管中加入1.5ml生理盐水，在旋涡振荡器内振荡打散沉淀，送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心6min-9min，吸弃上清液，使用移液枪向试管中加入85ul-90ul第一处理液，等待试管内溶液变得清亮后再加入15ul-20ul的醋酸钾缓冲液，混合均匀，等待试管内出现白色絮状沉淀后，再次送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心6.5min-8.5min，吸弃上清液，并向试管中加入洗涤液，混合均匀后，置于磁力架上放置5.5min-6min，收集洗脱液，即得临床生物样本核酸溶液；
29.s3，将临床生物样本核酸溶液送入装有提取液的收集管中，混合均匀后，将吸附膜浸渍于提取溶液，静置15min-20min，将吸附膜取出，使用洗脱液缓慢清洗吸附膜，再将吸附膜置于pcr反应液，调节pcr反应液的ph为8.4，吸附膜向pcr反应液中释放核酸。
30.进一步的，所述s1中混合磁珠由免疫磁珠和核酸提取磁珠混合制成，免疫磁珠为病毒抗体或受体等通过与磁性微球表面的羟基、羧基、氨基或环氧基键合得到的mnp-ab，核酸提取磁珠为硅羟基磁珠、羧基磁珠或其他可在特定条件下结合病毒核酸的磁珠，病毒抗体包括囊膜病毒的外膜蛋白、不带囊膜病毒的外壳蛋白抗体或核衣壳蛋白抗体，囊膜病毒的外膜蛋白抗体为f蛋白、m蛋白、n蛋白或s蛋白的抗体，病毒受体为与病毒特异性结合的单体或多分子复合物。
31.进一步的，所述s2中使用移液枪加入第一处理液时，需要用移液枪温柔吹散试管内的沉淀细胞，并盖紧管盖缓慢地震荡试管，不要剧烈震荡。
32.进一步的，所述s2中第一处理液由chelex-100、mnaoh、sds以及生理盐水混合制成，chelex-100的浓度为11.5％-12％，naoh的浓度为0.45m-0.48m，sds的浓度为5.5％-5.8％，第一处理液的ph为13.5-13.9。
33.进一步的，所述s2中醋酸钾缓冲液的ph为5.8-5.9。
34.进一步的，所述s2中混合均匀的具体操作步骤为：盖紧管口，将试管颠倒数次混匀并用手指轻轻弹试管底数次。
35.进一步的，所述s3中提取液由异硫氰酸胍、tritonx100、tween-20、蛋白酶k、mnacl、medta、tween-20以及sds混合制成，异硫氰酸胍的浓度为2.2m-2.3m，tritonx100的浓度为0.52wt％，tween-20的浓度为1.3wt％，蛋白酶k的浓度为61μg/ml，mnacl的浓度为151m，medta的浓度为12m，sds的浓度为0.55％，提取液的ph值为8.1。
36.进一步的，所述s3中吸附膜是经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜。
37.进一步的，所述s3中的洗脱液为0.12wt％tween-20的tris缓冲液，洗脱液的ph值为8.2。
38.进一步的，所述s2中洗涤液由5.5m盐酸胍、56％无水乙醇以及80μg/ml蛋白酶k的混合制成，ph值为6-7。
39.具体实施案例：
40.取1ml临床生物样本，将临床生物样本加入装有混合磁珠的试管中，混合磁珠由免疫磁珠和核酸提取磁珠混合制成，免疫磁珠为病毒抗体或受体等通过与磁性微球表面的羟基、羧基、氨基或环氧基键合得到的mnp-ab，核酸提取磁珠为硅羟基磁珠、羧基磁珠或其他可在特定条件下结合病毒核酸的磁珠，混合均匀后静置12min，将试管置于磁力架上并静置3min后，送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心3.5min，吸弃上清液；
41.向试管中加入1.5ml生理盐水，在旋涡振荡器内振荡打散沉淀，送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心6min，吸弃上清液，使用移液枪向试管中加入85ul第一处理液，第一处理液由chelex-100、mnaoh、sds以及生理盐水混合制成，第一处理液的ph为13.5-，用移液枪温柔吹散试管内的沉淀细胞，并盖紧管盖缓慢地震荡试管，不要剧烈震荡，等待试管内溶液变得清亮后再加入15ul的醋酸钾缓冲液，醋酸钾缓冲液的ph为5.8，盖紧管口，将试管颠倒数次混匀并用手指轻轻弹试管底数次，混合均匀，等待试管内出现白色絮状沉淀后，再次送入离心机中进行离心处理，在12000rmp的条件下离心8.5min，吸弃上清液，并向试管中加入洗涤液，洗涤液由5.5m盐酸胍、56％无水乙醇以及80μg/ml蛋白酶k的混合制成，ph值为6.5，混合均匀后，置于磁力架上放置6min，收集洗脱液，即得临床生物样本核酸溶液；
42.将临床生物样本核酸溶液送入装有提取液的收集管中，s3中提取液由浓度为2.2m的异硫氰酸胍、浓度为0.52wt％的tritonx100、浓度为1.3wt％的tween-20、浓度为61μg/ml的蛋白酶k、浓度为151m的mnacl、浓度为12m的medta以及浓度为0.55％的sds混合制成，提取液的ph值为8.1，混合均匀后，将吸附膜浸渍于提取溶液，吸附膜是经含有季铵盐的阴离子树脂处理后的纤维素膜，静置15min-20min，将吸附膜取出，使用洗脱液缓慢清洗吸附膜，s3中的洗脱液为0.12wt％tween-20的tris缓冲液，洗脱液的ph值为8.2，再将吸附膜置于pcr反应液，调节pcr反应液的ph为8.4，吸附膜向pcr反应液中释放核酸。
43.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。