一种与苦瓜全雌性相关的KASP分子标记及其应用

一种与苦瓜全雌性相关的kasp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于生物分子标记技术领域，尤其涉及一种与苦瓜全雌性相关的kasp分子标记及其应用。


背景技术：

2.苦瓜(momordica charantia l.)属葫芦科苦瓜属，在我国是一种深受消费者喜爱的特色蔬菜作物。苦瓜富含维生素、苦瓜素、皂苷、多肽、生物碱、黄酮等物质，具有祛湿、降血糖、抗肿瘤及提高免疫力等多种药用功效。
3.商品苦瓜由雌花的子房部位发育而成，因此，全雌株具有熟性早、产量高的优点，符合设施栽培对苦瓜品种的要求。此外，以全雌株为母本进行杂交制种时利用蜜蜂授粉代替人工去雄杂交，可有效降低制种成本，并且在理论上可使杂交率达到100％，提高制种质量。因此，全雌性在苦瓜新品种创制及配套的制种过程中具有巨大的应用价值和广阔的应用前景。
4.利用分子标记辅助选择手段对苦瓜全雌性进行早期筛选鉴定可大大提高育种选择效率，加速育种进程。尽管目前已经有苦瓜全雌性相关分子标记的报道，但要么遗传距离较远，筛选准确率不高，要么操作复杂，难以满足当前高通量快速育种的需求。kasp(kompetitive allele-specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)技术具有准确性高、位点适应性强、成本低、适合检测大量样本snp位点等优势，因此，开发与苦瓜全雌性紧密连锁的kasp分子标记对于提高我国苦瓜全雌育种效率和育种水平具有重要意义。


技术实现要素：

5.为了克服现有技术的缺点，本发明的首要目的在于提供一种与苦瓜全雌性相关的kasp分子标记。
6.本发明的再一目的在于提供上述与苦瓜全雌性相关的kasp分子标记的应用。
7.本发明是这样实现的，一种与苦瓜全雌性相关的kasp分子标记，所述分子标记位于苦瓜基因组1号染色体上的24645998位，在24645998位发生t向c的点突变；该位置及上下游各200bp的核苷酸序列如seq id no:1所示；
8.其中，用于扩增所述分子标记的kasp引物组包括正向引物f1、正向引物f2和反向引物r；所述正向引物f1的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述正向引物f2的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述反向引物r的核苷酸序列如seq id no:4所示；
9.所述正向引物f1为kasp24645998-f1及其5’端与荧光接头序列连接构成，kasp24645998-f1的核苷酸序列如seq id no:2所示，所连接的荧光接头为fam荧光接头，fam荧光接头的核苷酸序列如seq id no:5所示；
10.所述正向引物f2为kasp24645998-f2及其5’端与又一荧光接头序列连接构成，kasp24645998-f2的核苷酸序列如seq id no:3所示，所连接的荧光接头为hex荧光接头，hex荧光接头的核苷酸序列如seq id no:6所示；
11.所述反向引物r为kasp24645998-r，核苷酸序列如seq id no:4所示。
12.本发明进一步公开了一种与苦瓜全雌性相关的kasp引物组，该引物组包括上述正向引物f1、正向引物f2和反向引物r；其中，所述正向引物f1的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述正向引物f2的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述反向引物r的核苷酸序列如seq id no:4所示。
13.本发明进一步公开了一种用于鉴定苦瓜性型的试剂盒，该试剂盒包含权上述kasp引物组，该引物组包括上述正向引物f1、正向引物f2和反向引物r；其中，所述正向引物f1的核苷酸序列如seq id no:7所示，所述正向引物f2的核苷酸序列如seq id no:8所示，所述反向引物r的核苷酸序列如seq id no:4所示。
14.本发明进一步公开了上述kasp分子标记、上述kasp引物或上述试剂盒在苦瓜性别的鉴定、苦瓜全雌株的筛选或者在育种中的应用。
15.本发明进一步公开了一种利用kasp分子标记来鉴定苦瓜性别的方法，该方法包括以下步骤：
16.(1)以待测样品基因组dna为模板，利用上述kasp引物组进行pcr扩增反应，获得扩增产物；
17.(2)对扩增产物进行检测与分析。
18.优选地，在步骤(1)中，所述pcr扩增反应为touchdownpcr扩增，其中，pcr反应体系总体积为10μl，包括2*kasp mastermix 5μl，primermix 2.5μl，模板dna(30ng/μl)2.5μl；
19.pcr扩增程序为：94℃预变性10min；94℃变性20s；61℃～56℃退火延伸60s，共10个touchdown循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；第二轮循环，94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。
20.优选地，在步骤(2)中，所述检测为对扩增产物进行荧光检测，其中，t/t为表现为全雌株基因型，t/c为表现为雌雄同株的杂合基因型；c/c为表现为纯合的雌雄同株基因型。
21.相比于现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明kasp标记对苦瓜性别进行鉴定，具有操作简便、成本低廉、特异性强、稳定性高的特点，可十分准确和高效的检测出待测苦瓜植株是纯合雌雄同株、杂合雌雄同株还是纯合全雌株，检测结果与田间的吻合率达到100％；利用本发明的方法辅助鉴定苦瓜性型，在幼苗期就可筛选出目标株系，可用于筛选大批量样本，大大缩短了苦瓜育种周期，提高了育种效率，具有重要的应用前景。
附图说明
22.图1为本发明实施例1中全雌苦瓜材料mb和雌雄同株苦瓜材料gyh的表型观察图；
23.图2为本发明实施例1中利用分子标记kasp24645998检测52份f2测试群体的分型图；其中，圆圈表示基因型为(t/t)的全雌纯合单株，方框表示基因型为(c/c)的纯合雌雄同株，三角表示基因型为(t/c)的杂合雌雄同株，井号表示无模板对照ntc。
具体实施方式
24.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并
不用于限定本发明。
25.本发明利用bsa定位的方法，定位到一个控制苦瓜全雌性状的区间，在区间内开发标记进行精细定位，找到了完全连锁的突变位点，基于此位点开发了与苦瓜全雌基因相关的kasp分子标记。
26.一、群体的构建
27.全雌苦瓜材料mb为江苏省农业科学院蔬菜研究所选育的苦瓜高代自交系。雌雄同株苦瓜材料gyh为江苏省农业科学院蔬菜研究所选育的苦瓜高代自交系。
28.上述mb和gyh的性状图如图1所示，以mb为母本，gyh为父本进行杂交获得f1，并对f1植株进行自交获得了f2分离群体。
29.二、苦瓜性别的鉴定
30.将f2群体定植于大棚内，在盛花期时调查苦瓜的性别。性状调查的标准为：盛花期植株所有枝蔓上的花均为雌花的算作全雌，出现1个及以上的雄花算作雌雄同株。调查结果如下表1所示：
31.表1苦瓜f2群体性别调查统计表
[0032][0033]
调查结果显示，f1均为雌雄同株，f2分离群体中全雌株和雌雄同株的个体数都符合1:3的分离比例，表明苦瓜全雌性受隐性单基因控制。
[0034]
三、苦瓜全雌基因的定位
[0035]
从f2群体中分别选取全雌株和雌雄同株的子代各30株，利用ctab法提取叶片组织dna，每单株取等量dna混合，分别构建g池和m池。此外，分别选取mb和gyh各5株，提取叶片组织dna并进行等量混合，分别构建p1池和p2池。利用truseq dna lt sample prep kit(illumina)对4个池进行dna建库，利用illumina hiseqtm pe150平台对文库进行测序，测序深度为30
×
。通过计算g池和m池之间的
△
(snp-index)值，最终将苦瓜全雌基因初步定位在苦瓜1号染色体末端21.18～24.74mb的区间内。
[0036]
为进一步缩小候选区间，将双亲的重测序数据比对到苦瓜三代测序参考基因组上(matsumura et al.,2020,pnas)，分析双亲间的dna序列变异，开发kasp标记，利用开发的kasp分子标记对f2群体的单株进行基因分型，确定交换单株。基于苦瓜性别表型调查数据和确定的交换单株的基因型，将全雌基因定位在苦瓜1号染色体24098153～24745000区间内。
[0037]
四、苦瓜全雌基因连锁的分子标记的开发
[0038]
在苦瓜基因组1号染色体24645998的位置的上游和下游方向各选取200bp长度的序列得到401bp的序列，该401bp的核苷酸序列如seq id no:1所示。分子标记位于苦瓜基因组1号染色体上的24645998位对应于seq id no:1的第201位，该核苷酸为t或c。
[0039]
针对该处snp位点变异，按照kasp设计原则，在poly marker网站设计kasp引物，设计得到两条正向引物kasp24645998-f/kasp24645998-f2和一条通用反向引物
kasp24645998-r，其核苷酸序列如下：
[0040]
kasp24645998-f1：5
’‑
gtattctcgcacgtttgttctatt(seq id no:2)；
[0041]
kasp24645998-f2：5
’‑
gtattctcgcacgtttgttctatc(seq idno:3)；
[0042]
kasp24645998-r：5
’‑
actaattggtttaatgttttgaaacatac(seq id no:4)。
[0043]
所述kasp引物是根据全雌株和雌雄同株在1号染色体24645998的位置的基因型设计，全雌株基因型为t/t，杂合雌雄同株基因型为t/c，纯合雌雄同株基因型为c/c。
[0044]
五、本发明开发的kasp标记与苦瓜性别相关性验证
[0045]
(1)提取基因组dna
[0046]
利用ctab(十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyl trimethyl ammonium bromide)方法提取mb、gyh、f1及f2群体单株的苦瓜叶片基因组dna。
[0047]
(2)kasp标记对苦瓜材料进行基因型分型检测
[0048]
kasp24645998-f1引物的5’端连接fam荧光接头序列，kasp24645998-f2引物的5’端连接hex荧光接头序列，连接荧光接头后的引物序列如下：
[0049]
正向引物f1：gaaggtgaccaagttcatgctgtattctcgcacgtttgttctatt(seq id no:7，其中下划线部分为fam荧光标签序列)；
[0050]
正向引物f2：gaaggtcggagtcaacggattgtattctcgcacgtttgttctatc(seq id no:8，其中下划线部分为hex荧光标签序列)；
[0051]
反向引物r：actaattggtttaatgttttgaaacatac(seq id no:4)。
[0052]
用te(ph 8.0)将合成的正向引物f1、正向引物f2及反向引物r溶解至10μm，然后按照f1：f2：r＝1:1:3的比例配制成引物混合液(即kasp primer mix)。以步骤(1)中得到的各苦瓜材料基因组dna为模板，按照下列反应体系和反应程序进行pcr反应。其中，阴性对照采用ddh2o代替模板dna进行反应。
[0053]
pcr反应体系总体积为10μl，包括2*kasp mastermix 5μl，primermix 2.5ul，模板dna(30ng/μl)2.5μl。pcr扩增程序为：94℃预变性10min；94℃变性20s；61℃-56℃退火延伸60s，共10个touchdown循环，每个循环退火延伸温度降0.8℃；第二轮循环，94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。
[0054]
对扩增产物进行荧光检测时，如果样品pcr产物只检测到连接了荧光接头序列的正向引物f1对应的荧光信号，则检测位点基因型为t/t，判定为纯合的全雌单株；如果样品pcr产物只检测到连接了荧光接头序列的正向引物f2对应的荧光信号，则检测位点基因型为c/c，判定为纯合的雌雄同株单株；若同时检测到连接了荧光接头序列的引物f1和f2对应的两种荧光信号，则检测位点基因型为t/c，判定为表现雌雄同株的杂合单株。
[0055]
结果如图2和表2所示，将标记kasp24645998用于苦瓜材料扩增时，所有全雌株均检测到t/t基因型，所有纯合的雌雄同株单株均检测到c/c基因型，所有杂合的雌雄同株单株均检测到t/c基因型。
[0056]
表2检测结果
[0057]
[0058][0059]
上述实验数据表明，每一种基因型在分型图上都能聚在一起，并且均能和表型对应起来。因此，本发明提供的kasp24645998标记可用于准确鉴定苦瓜性别或筛选全雌苦瓜植株。
[0060]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。