增加多核苷酸的无模板酶促合成中长序列的产量的制作方法

增加多核苷酸的无模板酶促合成中长序列的产量
1.背景
2.最近人们对多核苷酸合成的酶促方法的兴趣有所增加，这不仅是因为许多领域诸如合成生物学、crispr-cas9应用和高通量测序对合成多核苷酸的需求增加，而且还因为多核苷酸合成的化学方法的局限性诸如产物长度的上限以及有机溶剂的使用和所需的处置，jensen等人,biochemistry,57:1821-1832(2018)。酶促合成因其特异性和效率以及其对温和水性反应条件的要求而具有吸引力。
3.目前，大多数酶促方法采用无模板聚合酶使3
’‑
o封闭的核苷三磷酸重复添加到附接至支持物的单链起始子或延长链，然后去封闭，直至获得具有期望的序列的多核苷酸。这种方法的一个目的是提供长合成核酸，其结构与天然对应物不可区分。然而，随着多核苷酸长度增加，形成二级结构(诸如，例如，链内或链间双链体)的可能性增加，其结果是合成试剂无法接近反应位点并且产物产量下降。
4.鉴于上述情况，如果有方法可用于减少降低期望的多核苷酸产物产量的二级结构的形成，则多核苷酸的无模板酶促合成将得到发展。
5.发明概述
6.本发明涉及用于多核苷酸的无模板酶促合成方法，该方法采用碱基类似物和碱基保护部分，目的是减少合成期间二级结构的形成。在一方面，这样的方法采用附接至腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤的环外胺的碱基保护部分。在另一方面，这样的碱基保护部分还可以包括提供另外的功能性的部分，诸如捕获部分、核酸酶阻断剂、报道物等。例如，捕获部分，诸如生物素，可用于在合成之后在去保护之前捕获多核苷酸。
7.在一些实施方案中，本发明涉及合成具有预定序列的多核苷酸的方法，该方法包括以下步骤：a)提供具有游离3
’‑
羟基的起始子；b)重复以下的循环直至所述多核苷酸完整：(i)在延长条件下使具有游离3
’‑
o-羟基的起始子或延长片段与3
’‑
o-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的dna聚合酶接触，从而使起始子或延长片段通过3
’‑
o-封闭的、碱基保护的核苷三磷酸的掺入被延长以形成3
’‑
o-封闭的延长片段，和(ii)将延长片段去封闭以形成具有游离3
’‑
羟基的延长片段，直至形成所述多核苷酸，其中选择延长条件以防止氢键键合或碱基堆积。在一些实施方案中，被选择以防止分子内或分子间氢键键合的条件包括提供具有碱基保护部分的3
’‑
o-封闭的核苷三磷酸单体，该碱基保护部分使被保护的基团不参与氢键键合。特别地，所述延长条件可以规定(provide)，至少一种3
’‑
o-封闭的核苷三磷酸具有附接至其碱基的碱基保护部分以防止氢键键合，优选地附接至其碱基的氮或氧，更优选地附接至氮。所述3
’‑
o-封闭的核苷三磷酸的所述碱基的所述氮可以是环外氮。在一些特定实施方案中，所述碱基保护部分可以附接至脱氧腺苷三磷酸的6-氮、脱氧鸟苷三磷酸的2-氮或脱氧胞苷三磷酸的4-氮。所述碱基保护部分可以是酰基保护基团。特别地，附接至所述脱氧腺苷三磷酸的6-氮的所述碱基保护部分可以选自由以下组成的组：苯甲酰基、邻苯二甲酰基、苯氧基乙酰基和甲氧基乙酰基；附接至所述脱氧鸟苷三磷酸的2-氮的所述碱基保护部分可以选自由以下组成的组：异丁酰基、异丁酰氧基乙烯、乙酰基、4-异丙基-苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基和甲氧基乙酰基；并且附接至所述脱氧胞苷三磷酸的4-氮的所述
碱基保护部分可以选自由以下组成的组：苯甲酰基、邻苯二甲酰基、乙酰基和异丁酰基。可选地，附接至所述脱氧腺苷三磷酸的6-氮的所述碱基保护部分可以是苯甲酰基或二甲基甲脒，优选地二甲基甲脒；附接至所述脱氧鸟苷三磷酸的2-氮的所述碱基保护部分可以是乙酰基或二甲基甲脒，优选地二甲基甲脒；并且附接至所述脱氧胞苷三磷酸的4-氮的所述碱基保护部分可以是乙酰基。在一些实施方案中，碱基保护部分可以是碱不稳定的，特别是可以是脒。该方法可以包括从多核苷酸的核苷酸中去除所述碱基保护部分。起始子可以附接至固体支持物。在一些特定实施方案中，所述起始子包含碱可裂解核苷并且所述碱基保护部分是碱不稳定的，并且所述去除步骤包括用碱处理所述多核苷酸，使得碱基保护部分和碱可裂解核苷在相同反应中裂解。在一些实施方案中，被选择以防止分子内或分子间氢键键合的条件可以包括存在变性剂，优选地选自由以下组成的组：介电常数小于水的水可混溶溶剂和离液剂，更特别地选自由以下组成的组：甲酰胺、胍、水杨酸钠、二甲亚砜(dmso)、丙二醇和脲。优选地，所述3
’‑
o-保护基团可以选自由以下组成的组：3
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o-甲基、3
’‑
o-(2-硝基苄基)、3
’‑
o-烯丙基、3
’‑
o-胺、3
’‑
o-叠氮甲基、3
’‑
o-叔丁氧基乙氧基、3
’‑
o-(2-氰乙基)和3
’‑
o-炔丙基。更优选地，所述3
’‑
o-保护基团是叠氮甲基或胺。当采用碱基保护部分时，在合成完成后，本发明的方法可以包括从最终产物的核苷酸中去除碱基保护部分的另外步骤。
8.在一些实施方案中，本发明涉及合成具有预定序列的多核苷酸的方法，该方法包括以下步骤：a)提供具有游离3
’‑
羟基的起始子；b)重复以下的循环直至合成所述多核苷酸：(i)在延长条件下使具有游离3
’‑
o-羟基的起始子或延长片段与3
’‑
o-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的dna聚合酶接触，从而使起始子或延长片段通过3
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o-封闭的、碱基保护的核苷三磷酸的掺入被延长以形成3
’‑
o-封闭的延长片段，和(ii)将延长片段去封闭以形成具有游离3
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羟基的延长片段，直至形成所述多核苷酸，其中选择延长条件以防止氢键键合或碱基堆积；其中最终循环仅包括步骤(i)并且其中3
’‑
o-封闭的、碱基保护的核苷三磷酸包含碱基保护部分，所述碱基保护部分包含捕获部分；以及c)用捕获部分的互补物捕获多核苷酸。所述方法还可以包括使所述捕获的多核苷酸去封闭的步骤。
9.附图简述
10.图1a图解说明多核苷酸的无模板酶促合成方法。
11.图1b图解说明可能形成的抑制合成试剂接近生长链的二级结构的类型。
12.图2显示合成一类碱基保护的3
’‑
o-氨基-2
’‑
脱氧核苷三磷酸的方案。
13.图3显示说明当使用包含3
’‑
o-nh2-n2-乙酰基-2
’‑
脱氧鸟苷三磷酸的单体合成时(dg)
10
产量增加的数据。
14.图4a-图4b说明示例性碱基保护部分，其包括具有另外的功能性的部分，诸如捕获部分。
15.发明详述
16.这里更详细地公开了本发明的一般原理，特别地通过实例的方式，诸如在附图中示出并详细描述的那些。然而，应该理解的是，意图并不是将本发明限制于所描述的特定实施方案。本发明适用于各种修改和替代形式，其细节在若干实施方案中示出。意图是覆盖落入本发明的原理和范围内的所有修改、等同物和替代物。
17.除非另外指出，本发明的实践可以采用有机化学、分子生物学(包含重组技术)、细
胞生物学和生物化学的常规技术和描述，这些都在本领域的技术内。这样的常规技术可以包括但不限于制备和使用合成肽、合成多核苷酸、单克隆抗体，核酸克隆、扩增、测序和分析以及相关技术。这样的常规技术的方案可在制造商的产品文献和标准实验室手册中找到，诸如genome analysis:a laboratory manual series(第i-iv卷)；pcr primer:a laboratory manual；和molecular cloning:a laboratory manual(全部来自cold spring harbor laboratory press)；lutz和bornscheuer,编辑,protein engineering handbook(wiley-vch,2009)；hermanson,bioconjugate techniques,第二版(academic press,2008)；以及类似的参考文献。
18.本发明涉及对多核苷酸尤其是dna的无模板酶促合成的改进，其通过提供抑制生长链中二级结构形成(诸如由氢键键合、碱基堆积等引起的)的合成条件，允许长多核苷酸的更高产率。不意图限于特定理论或假设，据信这样的二级结构的形成限制了对合成试剂诸如无模板聚合酶的接近，从而抑制链延伸并增加产物长度的可变性。部分地，本发明基于这样的认知和认识，即通过选择包括以下的延长条件可以减轻或抑制这样的二级结构对产物产量的负面影响：较高的反应温度，例如，通过使用热稳定的无模板聚合酶；变性剂的存在；和使用具有附接至基团(诸如环外胺)的碱基类似物或碱基保护部分的单体，以防止氢键键合。
19.在一些实施方案中，本发明包括使用碱基保护部分，该碱基保护部分不仅防止二级结构形成，例如通过阻止氢键键合，还提供另外的功能性，诸如阻断外切核酸酶活性、用作报告基团、用作捕获部分等的部分。例如，碱基保护部分可以包含允许容易分离多核苷酸产物的分子捕获部分，而多核苷酸产物继而可以通过去保护来释放，而不会在产物上留下非天然加合物或“结疤(scarring)”。
20.无模板酶促合成
21.通常，无模板(或等同地，“不依赖模板的”)酶促dna合成的方法包括步骤的重复循环，诸如图1a中示出的，其中在每个循环中，预定的核苷酸与起始子或生长链偶联。无模板酶促合成的一般要素在以下参考文献中描述：ybert等人,国际专利公布wo/2015/159023；ybert等人,国际专利公布wo/2017/216472；hyman,美国专利5436143；hiatt等人,美国专利5763594；jensen等人,biochemistry,57:1821-1832(2018)；mathews等人,organic&biomolecular chemistry,doi:0.1039/c6ob01371f(2016)；schmitz等人,organic lett.,1(11):1729-1731(1999)。
22.提供了例如，附接至固体支持物(102)的起始子多核苷酸(100)，所述起始子多核苷酸具有游离3
’‑
羟基基团(103)。在有效地将3
’‑
o-保护的-dntp酶促掺入到起始子多核苷酸(100)(或延长的起始子多核苷酸)的3’端上的条件(104)下，向起始子多核苷酸(100)(或后续循环中延长的起始子多核苷酸)添加3
’‑
o-保护的dntp和无模板聚合酶，诸如tdt或其变体(例如ybert等人,wo/2017/216472；champion等人,wo2019/135007)。(提及核苷酸单体上的基团的术语“保护的”和“封闭的”及其同源词可互换且同义地使用)。该反应产生其3
’‑
羟基被保护的延长的起始子多核苷酸(106)。如果延长的起始子多核苷酸含有完整的序列，那么3
’‑
o-保护基团可以被去除，或者去保护，并且期望的序列可以从原始起始子多核苷酸裂解。这样的裂解可以使用多种单链裂解技术中的任一种来进行，例如，通过在原始起始子多核苷酸内的预定位置处插入可裂解核苷酸来进行。示例性可裂解核苷酸可以是被尿嘧啶
dna糖基化酶裂解的尿嘧啶核苷酸。如果延长的起始子多核苷酸不包含完整的序列，那么3
’‑
o-保护基团被去除以暴露游离3
’‑
羟基(103)，并且使延长的起始子多核苷酸经历另一循环的核苷酸添加和去保护。
23.如本文使用的，“起始子”(或等同术语，诸如，“起始片段”、“起始子核酸”、“起始子寡核苷酸”等)通常是指可以被无模板聚合酶(诸如tdt)进一步延长的具有游离3
’‑
端的短寡核苷酸序列。在一种实施方案中，起始片段是dna起始片段。在另一种实施方案中，起始片段是rna起始片段。在一些实施方案中，起始片段具有3个与100个之间的核苷酸，特别地3个与20个之间的核苷酸。在一些实施方案中，起始片段是单链的。在可选的实施方案中，起始片段是双链的。在一些实施方案中，起始子可以包含具有游离羟基(tdt可以将3
’‑
o-保护的dntp偶联至该羟基)的非核酸化合物，例如baiga,美国专利公布us2019/0078065和us2019/0078126。
24.合成完成后，具有期望的核苷酸序列的多核苷酸可以通过裂解从起始子和固体支持物上释放。多种可裂解的连键或可裂解的核苷酸可用于此目的。在一些实施方案中，裂解期望的多核苷酸在裂解链上留下天然的游离5
’‑
羟基；然而，在可选的实施方案中，裂解步骤可以留下可以在后续步骤中去除(例如通过磷酸酶处理)的部分(moiety)，例如5
’‑
磷酸。裂解步骤可以通过化学、热、酶或光化学方法进行。在一些实施方案中，可裂解核苷酸可以是核苷酸类似物，诸如脱氧尿苷或8-氧代-脱氧鸟苷，它们被特定的糖基化酶(例如尿嘧啶脱氧糖基化酶，随后分别是核酸内切酶viii和8-氧代鸟嘌呤dna糖基化酶)识别。在一些实施方案中，裂解可以通过以下完成：为起始子提供脱氧肌苷作为倒数第二个3’核苷酸，脱氧肌苷可以在起始子的3’端被内切核酸酶v裂解，在释放的多核苷酸上留下5
’‑
磷酸。用于裂解单链多核苷酸的另外的方法在以下参考文献中公开，这些参考文献通过引用并入：美国专利第5,739,386号、第5,700,642号和第5,830,655号；和美国专利公布第2003/0186226号和第2004/0106728号；和在urdea和horn，美国专利5367066中。
25.在一些实施方案中，通过糖基化酶和/或核酸内切酶的裂解可能需要双链dna底物。
26.回到图1a，在一些实施方案中，在每个合成步骤中在存在3
’‑
o-保护的dntp的情况下使用无模板聚合酶(诸如tdt)将核苷酸的有序序列偶联至起始子核酸。在一些实施方案中，合成多核苷酸的方法包括以下步骤：(a)提供具有游离3
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羟基的起始子；(b)在延伸条件下使具有游离3
’‑
羟基的起始子或延伸中间体与无模板聚合酶在存在3
’‑
o-保护的核苷三磷酸的情况下反应，以产生3
’‑
o-保护的延伸中间体；(c)使延伸中间体去保护以产生具有游离3
’‑
羟基的延伸中间体；和(d)重复步骤(b)和(c)，直至合成所述多核苷酸。(有时术语“延伸中间体”和“延长片段”可互换且同义地使用)。在一些实施方案中，起始子以例如通过其5’末端附接至固体支持物的寡核苷酸提供。以上方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及在去保护步骤之后的洗涤步骤。例如，反应步骤可以包括在预定孵育时间段或反应时间之后去除未掺入的核苷三磷酸(通过例如洗涤)的子步骤。这样的预定孵育时间段或反应时间可以是几秒钟(a few seconds)，例如30秒，至数分钟(several minutes)，例如30分钟。
27.如图1b中示出的，当合成支持物(122)上的多核苷酸序列包括反向互补序列，例如(124)和(126)时，二级分子内(128)或分子间(130)结构可以通过在反向互补区域之间形成
氢键来产生。在本发明的一个方面，选择环外胺的碱基保护部分以使被保护的氮的氢不能参与氢键键合，从而防止形成二级结构，诸如图1b中示出的那些。也就是说，在本发明的一个方面，选择碱基保护部分以防止氢键的形成，诸如在正常碱基配对中(例如在核苷a和核苷t之间以及核苷g和核苷c之间)形成。在合成结束时，碱基保护部分可以被去除，并且多核苷酸产物可以从固体支持物裂解，例如通过将多核苷酸产物从其起始子裂解。
28.没有碱基保护的3
’‑
o-封闭的dntp可以从商业供应商处购买，或者使用公开的技术合成，例如美国专利7057026；guo等人,proc.natl.acad.sci.,105(27):9145-9150(2008)；benner,美国专利7544794和8212020；国际专利公布wo2004/005667、wo91/06678；canard等人,gene(在本文引用)；metzker等人,nucleic acids research,22:4259-4267(1994)；meng等人,j.org.chem.,14:3248-3252(3006)；美国专利公布2005/037991。具有碱基保护的3
’‑
o-封闭的dntp可以如下描述地合成。
29.当采用碱基保护的dntp时，图1a的以上方法还可以包括步骤(e)去除碱基保护部分，在酰基或脒保护基团的情况下，该步骤可以(例如)包括用浓氨处理。
30.以上方法还可以包括在反应或延伸步骤之后以及在去保护步骤之后的加帽步骤以及洗涤步骤。如以上提及的，在一些实施方案中，可以包括加帽步骤，其中非延伸的游离3
’‑
羟基与阻止加帽链任何进一步延伸的化合物反应。在一些实施方案中，这样的化合物可以是双脱氧核苷三磷酸。在其他实施方案中，具有游离3
’‑
羟基的非延伸链可以通过用3
’‑
外切核酸酶活性(例如exo i)处理它们来降解。例如，参见hyman，美国专利5436143。同样，在一些实施方案中，未能去封闭的链可以被处理以去除该链或使其对进一步的延伸呈惰性。
31.在一些实施方案中，用于延伸或延长步骤的反应条件可以包括以下：2.0μm纯化的tdt；125-600μm 3
’‑
o-封闭的dntp(例如3
’‑
o-nh
2-封闭的dntp)；约10至约500mm二甲胂酸钾缓冲液(6.5和7.5之间的ph)和约0.01mm至约10mm的二价阳离子(例如cocl2或mnc12)，其中延长反应可以在50μl的反应体积，在rt至45℃范围内的温度进行3分钟。在实施方案中，其中3
’‑
o-封闭的dntp是3
’‑
o-nh
2-封闭的dntp，用于去封闭步骤的反应条件可以包括以下：700mm nano2；1m乙酸钠(用乙酸调整ph至4.8-6.5的范围)，其中去封闭反应可以在50μl体积，在rt至45℃范围内的温度进行30秒至数分钟(several minutes)。
32.根据具体应用，去封闭和/或裂解的步骤可以包括多种化学或物理条件，例如光、热、ph、特定试剂诸如能够裂解指定的化学键的酶的存在。选择3
’‑
o-封闭基团和对应的去封闭条件的指导可见于以下参考文献中，这些参考文献通过引用并入：benner，美国专利7544794和8212020；美国专利5808045；美国专利8808988；国际专利公布wo91/06678；以及下文引用的参考文献。在一些实施方案中，裂解剂(有时也称为去封闭试剂或去封闭剂)是化学裂解剂，诸如，例如二硫苏糖醇(dtt)。在可选的实施方案中，裂解剂可以是酶促裂解剂，诸如，例如，可以裂解3
’‑
磷酸封闭基团的磷酸酶。本领域技术人员将理解，去封闭剂的选择取决于所使用的3
’‑
核苷酸封闭基团的类型、是使用一种还是多于一种封闭基团、起始子是否被附接至活细胞或生物体或固体支持物等，这些都需要温和的处理。例如，膦诸如三(2-羧乙基)膦(tcep)可以用于裂解3’o-叠氮甲基基团，钯络合物可以用于裂解3’o-烯丙基基团，或亚硝酸钠可以用于裂解3’o-氨基基团。在特定实施方案中，裂解反应包括tcep、钯络合物或亚硝酸钠。
33.如以上所述，在一些实施方案中，期望采用可以使用正交去封闭条件去除的两种或更多种封闭基团。以下示例性的封闭基团对可以用于平行合成实施方案中。应当理解，其他的封闭基团对，或者包含多于两种封闭基团的组可以可用于在本发明的这些实施方案中使用。
[0034]3’‑
o-nh23
’‑
o-叠氮甲基3
’‑
o-nh23
’‑
o-烯丙基、3
’‑
o-炔丙基3
’‑
o-nh23
’‑
o-磷酸3
’‑
o-叠氮甲基3
’‑
o-烯丙基、3
’‑
o-炔丙基3
’‑
o-叠氮甲基3
’‑
o-磷酸3
’‑
o-烯丙基、3
’‑
o-炔丙基3
’‑
o-磷酸
[0035]
在活细胞上合成寡核苷酸需要温和的去封闭或去保护条件，即不会破坏细胞膜、使蛋白变性、干扰关键细胞功能等的条件。在一些实施方案中，去保护条件在与细胞存活相容的生理条件范围内。在这样的实施方案中，酶促去保护是期望的，因为它可以在生理条件下进行。在一些实施方案中，特定的酶促可去除的封闭基团与特定的酶相关联以将其去除。例如，基于酯的或基于酰基的封闭基团可以用酯酶诸如乙酰酯酶或类似的酶去除，并且磷酸封闭基团可以用3’磷酸酶诸如t4多核苷酸激酶去除。通过实例的方式，3
’‑
o-磷酸可以通过用100mm tris-hcl(ph 6.5)、10mm mgc12、5mm 2-巯基乙醇和一个单位t4多核苷酸激酶的溶液处理来去除。反应在37℃的温度进行1分钟。
[0036]“3
’‑
磷酸封闭的”或“3
’‑
磷酸保护的”核苷酸是指其中3
’‑
位置的羟基基团被含磷酸部分的存在封闭的核苷酸。根据本发明，3
’‑
磷酸封闭的核苷酸的实例是核苷酸基-3
’‑
磷酸单酯/核苷酸基-2’,3
’‑
环磷酸酯、核苷酸基-2
’‑
磷酸单酯和核苷酸基-2’或3
’‑
烷基磷酸二酯，以及核苷酸基-2’或3
’‑
焦磷酸酯。也可以使用这样的化合物的硫代磷酸酯或其他类似物，条件是取代不阻止磷酸酶去磷酸化产生游离的3
’‑
oh。
[0037]3’‑
o-酯保护的dntp或3
’‑
o-磷酸保护的dntp的合成和酶促去保护的另外的实例在以下参考文献中描述：canard等人,proc.natl.acad.sci.,92:10859-10863(1995)；canard等人,gene,148:1-6(1994)；cameron等人,biochemistry,16(23):5120-5126(1977)；rasolonjatovo等人,nucleosides&nucleotides,18(4&5):1021-1022(1999)；ferrero等人,monatshefte fur chemie,131:585-616(2000)；taunton-rigby等人,j.org.chem.,38(5):977-985(1973)；uemura等人,tetrahedron lett.,30(29):3819-3820(1989)；becker等人,j.biol.chem.,242(5):936-950(1967)；tsien,国际专利公布wo1991/006678。
[0038]
在一些实施方案中，修饰的核苷酸包括包含嘌呤碱基或嘧啶碱基和以下核糖或脱氧核糖糖部分的修饰的核苷酸或核苷分子，所述核糖或脱氧核糖糖部分具有与其共价附接的可去除的3
’‑
oh封闭基团以使得3’碳原子已附接以下结构的基团：
[0039]-o-z
[0040]
其中-z是c(r’)
2-o-r”、-c(r’)
2-n(r”)2、-c(r’)
2-n(h)r”、-c(r’)
2-s-r”和c(r’)
2-f中的任一种，其中每个r”是可去除的保护基团或可去除的保护基团的一部分；每个r’独立地是氢原子、烷基(alkyl)、取代的烷基、芳基烷基、烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环、酰基、氰基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基或酰氨基(amido)基团或通过连接基团附接的可检测的标记
物；条件是在一些实施方案中，这样的取代基具有最多10个碳原子和/或最多5个氧或氮杂原子；或者(r’)2代表式＝c(r
”’
)2的基团，其中每个r
”’
可以是相同的或不同的并且选自包括氢原子和卤素原子以及烷基基团的组，条件是在一些实施方案中，每个r
”’
的烷基具有1个至3个碳原子；并且其中分子可以反应以产生中间体，在所述中间体中每个r”被交换为h，或当z是-(r’)
2-f时，f被交换为oh、sh或nh2，优选地oh，所述中间体在水性条件下解离以提供具有游离3
’‑
oh的分子；条件是，当z是-c(r’)
2-s-r”时，两个r’基团均不是h。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的r’是烷基或取代的烷基，条件是，这样的烷基或取代的烷基具有1个至10个碳原子和0至4个氧或氮杂原子。在某些实施方案中，修饰的核苷酸或核苷的-z是式-c(r’)
2-n3。在某些实施方案中，z是叠氮甲基基团。
[0041]
在一些实施方案中，z是具有200或更小分子量的具有或不具有杂原子的可裂解有机部分。在其他实施方案中，z是具有100或更小分子量的具有或不具有杂原子的可裂解有机部分。在其他实施方案中，z是具有50或更小分子量的具有或不具有杂原子的可裂解有机部分。在一些实施方案中，z是具有200或更小分子量的具有或不具有杂原子的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，z是具有100或更小分子量的具有或不具有杂原子的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，z是具有50或更小分子量的具有或不具有杂原子的酶促可裂解有机部分。在其他实施方案中，z是具有200或更小分子量的酶促可裂解酯基团。在其他实施方案中，z是可被3
’‑
磷酸酶去除的磷酸基团。在一些实施方案中，以下3
’‑
磷酸酶中的一种或更多种可以与制造商推荐的方案一起使用：t4多核苷酸激酶、牛小肠碱性磷酸酶、重组虾碱性磷酸酶(例如从new england biolabs,beverly,ma可得的)。
[0042]
在另外的实施方案中，3
’‑
封闭的核苷酸三磷酸被3
’‑
o-叠氮甲基、3
’‑
o-nh2或3
’‑
o-烯丙基基团封闭。
[0043]
在仍其他实施方案中，本发明的3
’‑
o-封闭基团包括3
’‑
o-甲基、3
’‑
o-(2-硝基苄基)、3
’‑
o-烯丙基、3
’‑
o-胺、3
’‑
o-叠氮甲基、3
’‑
o-叔丁氧基乙氧基、3
’‑
o-(2-氰乙基)和3
’‑
o-炔丙基。
[0044]
在一些实施方案中，3
’‑
o-保护基团是电化学不稳定基团。即，保护基团的去保护或裂解通过改变保护基团附近的电化学条件(其导致裂解)来实现。电化学条件的这样的改变可以通过改变或施加物理量(诸如电压差或光)来激活辅助物质而引起，这继而引起保护基团位置处的电化学条件的改变，诸如ph值的增加或减少。在一些实施方案中，电化学不稳定基团包括例如每当ph改变至预定值时被裂解的对ph敏感的保护基团。在其他实施方案中，电化学不稳定基团包括每当还原或氧化条件(例如通过增加或减少保护基团位置处的电压差)改变时被直接裂解的保护基团。
[0045]
碱基保护基团
[0046]
可以采用多种保护基团(或等同地，“碱基保护部分”)以减少或消除在多核苷酸链延伸过程中二级结构的形成。通常，用于去除碱基保护基团的条件与用于去除3
’‑
o-封闭基团的条件是正交的。特别地，当3
’‑
o-封闭基团的去除或去封闭条件为酸性时，则可以选择碱基保护基团为碱不稳定的。在这样的情况下，由于使用酸不稳定的5
’‑
o-三苯甲基-保护的单体，许多碱不稳定的保护基团已在亚磷酰胺合成化学中被开发出来，例如beaucage和iyer,tetrahedron letters,48(12):2223-2311(1992)。特别地，用于亚磷酰胺化学的酰基和脒保护基团可应用于本发明的实施方案(例如beaucage和iyer(上文引用)的表2和表3的
保护基团)。在一些实施方案中，碱基保护基团是脒，诸如在beaucage和iyer(上文引用)的表2中描述的。通常，碱基保护的3
’‑
o-封闭的核苷三磷酸单体可以通过文献中描述的方法的常规修改来合成，诸如在以下实施例中描述的。
[0047]
在一些实施方案中，碱基保护基团附接至脱氧腺苷三磷酸的6-氮、脱氧鸟苷三磷酸的2-氮和/或脱氧胞苷三磷酸的4-氮。在一些实施方案中，碱基保护基团附接至所有指定的氮。在一些实施方案中，附接至脱氧腺苷三磷酸的6-氮的碱基保护基团选自由以下组成的组：苯甲酰基、邻苯二甲酰基、苯氧基乙酰基和甲氧基乙酰基；附接至脱氧鸟苷三磷酸的2-氮的碱基保护基团选自由以下组成的组：异丁酰基、异丁酰氧基乙烯、乙酰基、4-异丙基-苯氧基乙酰基、苯氧基乙酰基和甲氧基乙酰基；并且附接至所述脱氧胞苷三磷酸的4-氮的碱基保护基团选自由以下组成的组：苯甲酰基、邻苯二甲酰基、乙酰基和异丁酰基。
[0048]
在一些实施方案中，附接至脱氧腺苷三磷酸的6-氮的保护基团是苯甲酰基；附接至脱氧鸟苷三磷酸的2-氮的碱基保护基团是异丁酰基或二甲基甲脒；并且附接至脱氧胞苷三磷酸的4-氮的碱基保护基团是乙酰基。
[0049]
在一些实施方案中，附接至脱氧腺苷三磷酸的6-氮的碱基保护基团是苯氧乙酰基；附接至脱氧鸟苷三磷酸的2-氮的碱基保护基团是4-异丙基-苯氧基乙酰基或二甲基甲脒；并且附接至脱氧胞苷三磷酸的4-氮的碱基保护基团是乙酰基。
[0050]
在一些实施方案中，碱基保护部分被去除(即产物被去保护)并且产物在同一反应中从固体支持物裂解。例如，起始子可以包括核糖尿苷，其可以通过用1m koh或类似试剂(氨、氢氧化铵、naoh等)处理被裂解以释放多核苷酸产物，该处理同时去除碱不稳定的碱基保护部分。
[0051]
延长条件的进一步修改
[0052]
除了提供具有碱基保护基团的3
’‑
o-封闭的dntp单体外，延长反应还可以使用热稳定的无模板聚合酶在更高的温度进行。例如，可以采用在40℃以上具有活性的热稳定无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以采用在40-85℃范围内具有活性的热稳定无模板聚合酶；或者，在一些实施方案中，可以采用在40-65℃范围内具有活性的热稳定无模板聚合酶。
[0053]
在一些实施方案中，延长条件可以包括向延长反应混合物添加抑制氢键键合或碱基堆积的溶剂。这样的溶剂包括具有低介电常数的水混溶性溶剂，诸如二甲亚砜(dmso)、甲醇等。同样，在一些实施方案中，延长条件可包括提供离液剂，其包括但不限于正丁醇、乙醇、氯化胍、高氯酸锂、乙酸锂、氯化镁、苯酚、2-丙醇、十二烷基硫酸钠、硫脲、脲等。在一些实施方案中，延长条件包括存在二级结构抑制量的dmso。在一些实施方案中，延长条件可以包括提供抑制二级结构形成的dna结合蛋白，其中这样的蛋白包括但不限于单链结合蛋白、解旋酶、dna糖基化酶等。
[0054]
碱基类似物
[0055]
在一些实施方案中，包含碱基类似物的3
’‑
o-保护的-核苷三磷酸单体可用于破坏增加了故障序列发生的可能性的某些二级结构，例如g-四链体。在许多情况下，合成产物中碱基类似物的存在是可以接受的；也就是说，在聚合酶链式反应(pcr)测定中，引物核苷酸中碱基类似物的存在可以是可接受的。在一些实施方案中，在待合成的多核苷酸中存在可能形成g-四链体结构的鸟苷(g)序段(tract)的情况下，该序段中的一个或更多个g可以被
脱氧肌苷和/或7-去氮杂-2
’‑
脱氧鸟苷取代以防止在合成期间形成g-四链体。在一些实施方案中，多核苷酸中g序段的g仅被7-去氮杂-2
’‑
脱氧鸟苷取代。在一些实施方案中，如果被7-去氮杂-2
’‑
脱氧鸟苷取代的g的数量将多核苷酸产物的解链温度降低到不可接受的程度，则一部分用于取代的类似物的可以包含8-氮杂-7-去氮杂鸟苷。g-四链体结构可以使用可用的算法来预测，例如lombardi等人,nucleic acids research,48(1):1-15(2020)，以及类似的参考文献。3
’‑
o-保护的核苷类似物的三磷酸单体可以按照文献中的技术合成，例如上文引用的和seela,美国专利5990303。在一些实施方案中，g序段是含有多于25％的g、或多于30％的g、或多于40％的g的多核苷酸中大于4个核苷酸的序列区段。在其他实施方案中，g序段是符合基序g
3 n1-7g3 n1-7g3 n1-7g3
的序列片段，其中“n”是任何核苷酸并且“3 ”意指连续3个或更多个g。在一些实施方案中，被7-去氮杂-鸟苷替换的g的数量可以是序段中g的1％至100％，或序段中g的1％至50％，或序段中g的1％至25％，或序段中g的1％至10％。在一些实施方案中，这样的取代百分比可以通过选择g序段中的特定g用于取代来完成，或者这样的取代百分比可以通过在正在合成的多核苷酸的g序段中的一个或更多个g的添加步骤中使用g和7-去氮杂-g的混合物来统计上地完成。
[0056]
在一些实施方案中，上述用于合成具有g序段的多核苷酸的方法可以通过以下步骤实施：a)提供具有游离3
’‑
羟基的起始子；以及b)重复以下的循环直至合成所述多核苷酸：(i)在延长条件下使具有游离3
’‑
o-羟基的起始子或延长片段与3
’‑
o-封闭的核苷三磷酸和不依赖模板的dna聚合酶接触，从而使起始子或延长片段通过3
’‑
o-封闭的、碱基保护的核苷三磷酸的掺入被延长以形成3
’‑
o-封闭的延长片段，和(ii)使延长片段去封闭以形成具有游离3
’‑
羟基的延长片段，直至形成所述多核苷酸，其中在所述多核苷酸的g序段中，至少一个g被肌苷或7-去氮杂鸟苷取代。每当多核苷酸是多脱氧核苷酸时，g序段的至少一个g被脱氧肌苷或7-去氮杂-2
’‑
脱氧鸟苷取代。在一些实施方案中，每当多核苷酸是dna时，g序段的至少一个g被7-去氮杂-2
’‑
脱氧鸟苷取代。
[0057]
具有另外的功能性的碱基保护部分
[0058]
在一些实施方案中，可以选择包括另外的功能性的碱基保护部分，诸如捕获部分、报道基团、外切核酸酶阻断剂等。报告基团可以包括荧光染料、质量标记、电化学标记等。在一些实施方案中，碱基保护部分可包括捕获部分，其可以用于从故障序列分离或富集全长多核苷酸。例如，在一些实施方案中，这样的碱基保护部分可用于dntp添加的最终循环中，然后在产物从合成支持物释放或裂解后，将产物在捕获条件下暴露于包含捕获部分的互补物的支持物(即实施捕获步骤)，使得具有捕获部分的多核苷酸可以与没有捕获部分的多核苷酸分离，从而产生全长多核苷酸产物的富集群体。可以实施任选的洗涤步骤，之后可以实施裂解或去保护步骤以释放富集全长多核苷酸的产物。如上所述，用捕获部分去保护或去除保护部分产生天然多核苷酸产物，即，具有无任何非天然加合物或保护部分残余物的环外胺的多核苷酸产物。
[0059]
在一些实施方案中，这样的碱基保护部分是连接至携带另外的功能性的部分的酰基保护基团，在图4a中指定为“q”。q可以代表捕获部分，诸如生物素、报道基团、核酸酶阻断剂等。在一些实施方案中，q代表捕获部分。捕获部分可以包括在捕获步骤诸如羟醛反应、diels-alder反应、friedel-crafts反应、炔烃复分解、环加成、硼酸缩合等中形成共价键的基团(例如，jin等人，chem.soc.rev.,42:6634(2013)中综述)，以及在捕获步骤中形成非共
价键的基团，诸如被链霉抗生物素蛋白捕获的生物素，和被抗体捕获的荧光素、二硝基苯酚、地高辛等。图4a提供了包含捕获部分的示例性碱基保护部分，并且下表1给出关于它们用于本发明的信息。
[0060]
表1
[0061][0062]
图4b说明了用于本发明方法的示例性3
’‑
o-封闭的、碱基保护的核苷三磷酸。在图4b的式中，“接头”可以是与聚合酶掺入相容的任何合适的接头，诸如1-4个碳的烃基(alkyl)等；q可以是生物素、desbiotin和生物素模拟物，例如liu等人,chem.soc.rev.,46(9):2391-2403(2017)；“碱基”通常是腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶(其中这样的碱基是dntp的一部分)；以及“封闭”可以如上所述，但特别是具有100或更少的分子量的具有或不具有杂原子的可裂解有机部分，或选自由以下组成的组：甲基、2-硝基苄基、烯丙基、胺、叠氮甲基、叔丁氧基乙氧基、2-氰乙基和炔丙基。
[0063]
无模板聚合酶
[0064]
多种不同的无模板聚合酶可用于本发明的方法。无模板聚合酶包括但不限于polx家族聚合酶(包括dna聚合酶β、λ和μ)、多(a)聚合酶(pap)、多(u)聚合酶(pup)、dna聚合酶θ等，例如，在以下参考文献中描述的：ybert等人,国际专利公布wo2017/216472；champion等人,美国专利10435676；champion等人,国际专利公布wo2020/099451；yang等人,j.biol.chem.,269(16):11859-11868(1994)；motea等人,biochim.biophys.acta,1804(5):1151-1166(2010)。特别是，末端脱氧核苷酸转移酶(tdt)及其变体可用在无模板dna合成中。
[0065]
在一些实施方案中，酶促合成方法采用对于3
’‑
o-修饰的核苷三磷酸显示出增加的掺入活性的tdt变体。例如，这样的tdt变体可以使用champion等人的美国专利10435676中描述的技术生产，该专利通过引用并入本文。在一些实施方案中，采用这样的tdt变体，所述tdt变体具有与具有seq id no:2-31中的任一种的氨基酸序列的tdt至少60％相同的氨基酸序列和表2中列出的取代中的一种或更多种，其中所述tdt变体(i)能够在没有模板的情况下合成核酸片段，并且(ii)能够将3
’‑
o-修饰的核苷酸掺入到核酸片段的游离3
’‑
羟基
上。在一些实施方案中，以上tdt变体包括在表2中列出的每个位置处的取代。在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的seq id no的至少80％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的seq id no的至少90％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是与所指示的seq id no的至少95％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少97％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少98％同一性；在一些实施方案中，以上同一性百分比值是至少99％同一性。如本文使用的，用于比较参考序列和变体序列的同一性百分比值不包括包含变体序列的取代的明确指定的氨基酸位置；即，同一性关系百分比是在参考蛋白序列和变体中包含取代的明确指定位置之外的变体蛋白序列之间的关系。因此，例如，如果参考序列和变体序列各自包含100个氨基酸，并且变体序列在位置25和81处具有突变，那么同源性百分比将是关于位置1-24、26-80和82-100。
[0066]
关于(ii)，这样的3
’‑
o-修饰的核苷酸可以包含3
’‑
o-nh2-核苷三磷酸、3
’‑
o-叠氮甲基核苷三磷酸、3
’‑
o-烯丙基核苷三磷酸、3’o-(2-硝基苄基)-核苷三磷酸或3
’‑
o-炔丙基核苷三磷酸。
[0067]
表2
[0068][0069]
在一些实施方案中，用于本发明方法的另外的tdt变体包括甲硫氨酸、半胱氨酸、精氨酸(第一位置)、精氨酸(第二位置)或谷氨酸中的一种或更多种的取代，如表2中示出的。
[0070]
如以上描述的本发明的tdt变体各自包含与指定seq id no具有序列同一性百分比的氨基酸序列，经历指示的取代的存在。在一些实施方案中，以这种方式描述的本发明的
tdt变体与指定的seq id no之间的序列差异的数目和类型可能是由于取代、缺失和/或插入，并且被取代、缺失和/或插入的氨基酸可以包含任何氨基酸。在一些实施方案中，这样的缺失、取代和/或插入仅包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，取代仅包含保守的或同义的氨基酸改变，如grantham,science,185:862-864(1974)中描述的。即，氨基酸的取代仅能够发生在其同义氨基酸集合的成员之间。在一些实施方案中，可以采用的同义氨基酸集合列于表3a中。
[0071]
表3a
[0072]
氨基酸的同义集合i
[0073][0074]
在一些实施方案中，可以采用的同义氨基酸集合列于表3b中。
[0075]
表3b
[0076]
氨基酸的同义集合ii
[0077][0078]
试剂盒
[0079]
用于实施本发明方法的试剂盒可以包含3
’‑
o-保护的-核苷三磷酸单体，其包含具有脒-或酰基-保护的环外胺的碱基或碱基类似物(其也可具有脒或酰基-保护的环外胺)。在一些实施方案中，试剂盒的具有碱基类似物的3
’‑
o-保护的dntp单体包含3
’‑
o-保护的-2
’‑
脱氧-7-去氮杂鸟苷三磷酸。
[0080]
实施例1
[0081]3’‑
o-氨基-保护的-2
’‑
脱氧核苷三磷酸的环外胺的脒和酰基保护
[0082]
脒和酰基保护基团可以使用图2的方案附接至3
’‑
o-氨基-保护的-2
’‑
脱氧核苷三磷酸。具有3
’‑
o-肟部分的化合物(200)如benner，美国专利8212020中描述获得，该专利通过引用并入本文(例如参见benner中的化合物3e)。这里“b”代表腺嘌呤、鸟嘌呤或胞嘧啶。使用常规方法例如ti等人,j.amer.chem.soc.,104:1316-1319(1982)；kierzek,nucleosides and nucleotides,4:641-649(1985)，将化合物(200)的5
’‑
羟基用三甲基甲硅烷基基团保护，得到化合物(204)。每当b是鸟嘌呤或腺嘌呤时，将化合物(204)与甲醇中的n,n-二甲基甲酰胺二甲基缩醛合并(208)，如vu等人,tetrahedron letters,31(50):7269-7272(1990)所教导的，得到具有5
’‑
tms-o-3
’‑
o-(n-丙酮-肟)-dg
dmf
和5
’‑
tms-o-3
’‑
o-(n-丙酮-肟)-da
dmf
的化合物(209)。每当b是胞嘧啶时，将化合物(204)与异丁酸酐合并，如vu等人(上文引用)所教导的，得到5
’‑
tms-o-3
’‑
o-(n-丙酮-肟)-dc
ibu
。在去除tms保护基团(210)后(例如用四丁基氟化铵处理)，所得的化合物可以被三磷酸化，并且3
’‑
o-n-丙酮-肟基团如benner所教导的转化为胺。
[0083]
实施例2
[0084]
使用3
’‑
o-氨基-保护的-n2-乙酰基-2
’‑
脱氧鸟苷三磷酸增加的(dg)
10
的产量
[0085]
在本实施例中，比较使用具有未保护碱基的dgtp单体和具有乙酰化n2氮的dgtp单
体在无模板酶促合成后的(dg)
10
的产量。除此以外，(dg)
10
寡核苷酸如上述合成。结果在图3的电泳图中示出。电泳图梯状物(300)显示使用非碱基保护的3
’‑
o-nh2-2
’‑
脱氧鸟苷三磷酸合成后的分离产物，并且电泳图梯状物(302)显示使用3
’‑
o-nh2-n2-乙酰基-2
’‑
脱氧鸟苷三磷酸合成后的分离产物。梯状物(302)中高分子量产物的主要条带(304)显示，使用碱基保护的单体产生更多全长产物。
[0086]
定义
[0087]
除非本文另外明确定义，否则本文使用的核酸化学、生物化学、遗传学和分子生物学的术语和符号遵循本领域的标准论文和教科书中的那些，例如kornberg和baker,dna replication,第二版(w.h.freeman,new york,1992)；lehninger,biochemistry,第二版(worth publishers,new york,1975)；strachan和read,human molecular genetics,第二版(wiley-liss,new york,1999)。
[0088]
提及两种或更多种不同tdt中的氨基酸位置时，“功能等同”意指(i)各自位置处的氨基酸在tdt的活性中发挥相同的功能作用，和(ii)氨基酸出现在各自tdt的氨基酸序列中的同源氨基酸位置处。基于序列比对和/或分子建模鉴定两种或更多种不同tdt的氨基酸序列中的在位置上等同或同源的氨基酸残基是可能的。在一些实施方案中，功能等同的氨基酸位置属于在进化相关物种(例如属、科等)的tdt的氨基酸序列中是保守的低效基序。这样的保守的低效基序的实例在motea等人,biochim.biophys.acta.1804(5):1151-1166(2010)；delarue等人,embo j.，21：427-439(2002)；和类似的参考文献中描述。
[0089]“试剂盒”是指用于递送材料或试剂以执行由本发明的系统或装置实施的方法的任何递送系统，诸如包装。在一些实施方案中，消耗品、材料或试剂以本文称为“试剂盒”的包装递送给本发明的系统或装置的使用者。在本发明的系统和装置的上下文中，这样的递送系统通常包括允许材料诸如3
’‑
o-保护的-dntp的储存、运输或递送的包装方法和材料。例如，试剂盒可以包含含有3
’‑
o-保护的-dntp和/或支持材料的一种或更多种外罩(例如盒子)。这样的内含物可以一起或单独地被递送到预期的接收者。例如，第一个容器可以含有具有保护基团的环外氮的3
’‑
o-保护的dntp，而第二个或更多个容器含有3
’‑
o-保护的-脱氧鸟苷三磷酸、无模板聚合酶(例如特定的tdt)和适当的缓冲液。
[0090]
可互换使用的“突变体”或“变体”是指来源于本文描述的天然或参考tdt多肽并且在一个或更多个位置处包含修饰或改变，即取代、插入和/或缺失的多肽。变体可以通过本领域熟知的各种技术获得。特别地，用于改变编码野生型蛋白的dna序列的技术的实例包括但不限于定点诱变、随机诱变、序列改组和合成寡核苷酸构建。诱变活性包括在蛋白或者在本发明的情况下聚合酶的序列中缺失、插入或取代一个或数个(several)氨基酸。以下术语用于指定取代：l238a表示参考序列或野生型序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，l)被改变为丙氨酸(a)。a132v/i/m表示亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，a)被以下氨基酸之一取代：缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)。取代可以是保守的或非保守的取代。保守取代的实例是在以下组内的取代：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
[0091]“多核苷酸”或“寡核苷酸”被可互换地使用并且均意指核苷酸单体的线性聚合物
或其类似物。构成多核苷酸和寡核苷酸的单体能够通过单体与单体相互作用的常规模式(诸如watson-crick类型的碱基配对、碱基堆积、hoogsteen或反向hoogsteen类型的碱基配对等)与天然多核苷酸特异性结合。这样的单体及其核苷间连键可以是天然存在的，或者可以是其类似物，例如天然存在的或非天然存在的类似物。非天然存在的类似物可以包括pna、硫代磷酸核苷间连键、含有允许标记物(诸如荧光团或半抗原等)附接的连接基团的碱基。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用要求酶促加工(例如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等)时，普通技术人员将理解，在那些实例中，寡核苷酸或多核苷酸会在任何或一些位置处不含有核苷间连键、糖部分或碱基的某些类似物。通常多核苷酸的尺寸范围为几个单体单元例如5-40(此时多核苷酸通常被称为“寡核苷酸”)至数千个单体单元。除非另外指定或从上下文明显的，每当多核苷酸或寡核苷酸以字母(大写或小写)序列诸如“atgcctg”表示时，应该理解的是该核苷酸从左至右是5
’→3’
的顺序，并且“a”表示脱氧腺苷，“c”表示脱氧胞苷，“g”表示脱氧鸟苷，并且“t”表示胸苷，“i”表示脱氧肌苷，“u”表示尿苷。除非另外说明，否则术语和原子编号惯例将遵循在strachan和read，human molecular genetics 2(wiley-liss,new york,1999)中公开的那些。通常多核苷酸包含由磷酸二酯键连接的四种天然核苷(例如，脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷、脱氧胸苷(对于dna)或它们的核糖对应物(对于rna))；然而，它们还可包含非天然的核苷酸类似物，例如包含修饰的碱基、糖或核苷间连键。本领域技术人员清楚，在酶的活性要求特定的寡核苷酸或多核苷酸底物(例如单链dna、rna/dna双链体等)的情况下，则选择用于寡核苷酸或多核苷酸底物的合适组成完全是在普通技术人员的知识范围内，特别是在来自专著，诸如sambrook等人,molecular cloning，第二版(cold spring harbor laboratory，new york，1989)以及类似的参考文献的指导下。同样，寡核苷酸和多核苷酸可以指单链形式或双链形式(即寡核苷酸或多核苷酸及其相应互补物的双链体)。根据术语使用的上下文，普通技术人员将清楚哪种形式是意图的或是否两种形式都是意图的。
[0092]“引物”意指能够在与多核苷酸模板形成双链体后充当核酸合成的起始点并且从其3’端沿模板延伸，使得形成延伸的双链体的天然或合成的寡核苷酸。引物的延伸通常用核酸聚合酶例如dna或rna聚合酶进行。在延伸过程中添加的核苷酸的顺序由模板多核苷酸的序列决定。通常引物通过dna聚合酶延伸。引物通常具有14个至40个核苷酸的范围内或者18个至36个核苷酸的范围内的长度。引物用于各种核酸扩增反应，例如使用单种引物的线性扩增反应，或采用两种或更多种引物的聚合酶链式反应。选择用于特定应用的引物的长度和序列的指导是本领域普通技术人员熟知的，如由以下参考文献表明的，这些参考文献通过引用并入本文：dieffenbach,编辑,pcr primer:a laboratory manual,第二版(cold spring harbor press,new york,2003)。
[0093]“序列同一性”是指两个序列(诸如两个多肽序列或两个多核苷酸序列)之间的匹配(例如相同的氨基酸残基)的数目(或分数，通常以百分比表示)。序列同一性可以通过将序列对齐使得重叠和同一性最大化同时使序列空位最小化时对序列进行比较来确定。特别地，序列同一性可以使用许多数学全局或局部比对算法中的任何一种来确定，这取决于两个序列的长度。相似长度的序列优选地使用全局比对算法(例如，needleman和wunsch算法；needleman和wunsch,1970)进行比对，该算法将序列在整个长度上最优地对齐，而具有明显不同长度的序列优选地使用局部比对算法(例如，smith和waterman算法(smith和
waterman，1981)或altschul算法(altschul等人,1997；altschul等人,2005))进行比对。以确定氨基酸序列同一性百分比为目的的比对可以以本领域的技术范围内的各种方式，例如，使用可在互联网网站诸如http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/或ttp://www.ebi.ac.uk/tools/emboss/上可得的公开可得的计算机软件来实现。本领域技术人员可以确定用于测量比对的合适参数，包括在被比较序列的全长上实现最大对齐所需的任何算法。出于本文的目的，％氨基酸序列同一性值是指使用逐对序列比对程序emboss needle生成的值，该程序使用needman-wunsch算法产生两个序列的最佳全局比对，其中所有检索参数被设置为默认值，即评分矩阵＝blosum62，空位开放＝10，空位延伸＝0.5，末端空位罚分＝假，末端空位开放＝10并且末端空位延伸＝0.5。
[0094]“取代”意指氨基酸残基被另一种氨基酸残基替代。优选地，术语“取代”是指氨基酸残基被选自以下的另一种氨基酸残基替代：天然存在的20种标准氨基酸残基、罕见的天然存在的氨基酸残基(例如羟脯氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、6-n-甲基赖氨酸、n-乙基甘氨酸、n-甲基甘氨酸、n-乙基天冬酰胺、别异亮氨酸、n-甲基异亮氨酸、n-甲基缬氨酸、焦谷氨酰胺、氨基丁酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸)和通常合成获得的非天然存在的氨基酸残基(例如环己基-丙氨酸)。优选地，术语“取代”是指氨基酸残基被选自天然存在的20种标准氨基酸残基的另一种氨基酸残基替代。符号“ ”指示取代的组合。在本文中氨基酸由它们的单字母或三字母代码根据以下命名法表示：a：丙氨酸(ala)；c：半胱氨酸(cys)；d：天冬氨酸(asp)；e：谷氨酸(glu)；f：苯丙氨酸(phe)；g：甘氨酸(gly)；h：组氨酸(his)；i：异亮氨酸(ile)；k：赖氨酸(lys)；l：亮氨酸(leu)；m：甲硫氨酸(met)；n：天冬酰胺(asn)；p：脯氨酸(pro)；q：谷氨酰胺(gln)；r：精氨酸(arg)；s：丝氨酸(ser)；t：苏氨酸(thr)；v：缬氨酸(val)；w：色氨酸(trp)和y：酪氨酸(tyr)。在本文件中，以下术语用于指定取代：l238a表示亲本序列的位置238处的氨基酸残基(亮氨酸，l)被改变为丙氨酸(a)。a132v/i/m表示亲本序列的位置132处的氨基酸残基(丙氨酸，a)被以下氨基酸之一取代：缬氨酸(v)、异亮氨酸(i)或甲硫氨酸(m)。取代可以是保守的或非保守的取代。保守取代的实例是在以下组内的取代：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺和苏氨酸)、疏水性氨基酸(甲硫氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸)。
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本公开内容不意图限于所阐述的特定形式的范围，而是意图涵盖本文描述的变化形式的替代、修改和等同物。此外，本公开内容的范围完全包含鉴于本公开内容对本领域技术人员可以变得明显的其他变化形式。本发明的范围仅由所附权利要求书限定。