使用抗原结合片段治疗免疫性血小板病症的制作方法

1.本发明涉及免疫学和医学领域。更具体地，本发明涉及血栓形成相关疾病和病症的治疗和预防。


背景技术：

2.肝素诱导的血小板减少症(hit)是肝素疗法的危及四肢和生命的并发症，影响1-5％的接受普通肝素的患者。hit和血栓形成是对普通(uf)或低分子量(lmw)肝素的免疫反应的结果。该反应主要由hit抗体介导，所述抗体是针对肝素-血小板因子4(pf4)复合物的igg抗体。抗体-抗原复合物结合并交联血小板fc
γ
riia受体，从而导致强烈的血小板活化和血栓形成。免疫复合物还诱导血小板-嗜中性粒细胞相互作用和net形成。这些有效的促血栓形成过程(血小板活化、血小板-嗜中性粒细胞相互作用和net形成)驱动hit中的血栓形成。毫不奇怪，hit中的血栓形成通常是广泛而严重的，从而导致破坏性的临床后遗症，诸如危及生命的动脉血栓形成(例如心脏病发作和中风)、肺凝块(肺栓塞)、腿部坏疽和截肢、多器官衰竭和死亡。hit相对常见，因为uf和lmw肝素在临床实践中被广泛使用。由于破坏性的临床后遗症，它是全球许多临床医生都害怕的药物并发症。
3.治疗hit的第一步是停用肝素。然而，这并不能停止强烈的血栓形成过程，并且因此不能防止严重的临床后遗症，诸如肢体坏疽和血栓性死亡。hit的抗凝治疗，特别是达那肝素(danaparoid)、来匹卢定(lepirudin)和阿加曲班(argatroban)在治疗hit中的血栓形成方面仅部分有效。最近，其他抗凝剂诸如磺达肝素(fondaparinux)和新型口服抗凝剂(例如达比加群(dabigatran))也已被用于尝试抑制fc
γ
riia依赖性血栓形成引发事件下游的凝血事件，所述事件驱动有效的促血栓形成过程链(血小板活化、血小板-白细胞相互作用和net形成)，从而导致严重的血栓形成。在不消除起始/驱动事件的情况下，单独使用抗凝剂抑制下游凝血途径事件已被证明是不够的，因为这些药物能够适度减少血栓事件，但不能显著降低肢体坏疽和死亡率。此外，这些药物经肾脏排泄并倾向于积聚在血浆中并引起出血。单独的抗凝疗法不抑制或消除hit抗体诱导的血小板活化和凝血酶生成，这两者共同驱动hit中的血栓形成。
4.免疫性血小板减少症(itp)通常是由对血小板受体gpiib-iiia或gpib-ix具有特异性的致病性igg抗体介导的病状。这些抗体导致外周血血小板破坏，从而导致循环血小板的减少、血小板减少症和出血。在一些患者中，这些抗体可以激活血小板并导致血栓形成。itp可以主要被认为是原因不明的自身免疫性疾病或继发于其他自身免疫性疾病(例如系统性红斑狼疮)、对药物(例如药物诱导的itp)或感染[感染相关的itp，例如与人免疫缺陷病毒(hiv)、eb病毒(ebv)、麻疹和其他感染相关的itp]的免疫反应。
[0005]
由抗gpib-ix igg抗体介导的严重itp通常非常严重，并且难以用常规免疫抑制疗法进行治疗。一线治疗包括糖皮质激素、ivig、抗d或其任何组合。二线治疗由硫唑嘌呤、环磷酰胺、达那唑(danazol)、长春花生物碱、利妥昔单抗(rituximab)、tpor激动剂、脾切除术等组成。除tpor激动剂外，抗gpib-ix igg抗体介导的itp似乎对常规免疫抑制疗法没有反
应。即使使用tpor激动剂，血小板反应的发生通常也需要长达2周的时间，因为这些药物通过刺激骨髓中的巨核细胞前体(血小板产生细胞)起作用，并且巨核细胞前体成熟到可以产生血小板的阶段需要大约2周。在此期间，如果患者出血，如果患者已经变得用免疫抑制性药物难以治疗，则没有有效的治疗方法。即使使用tpor激动剂，20-30％的患者也没有反应。三线治疗包括联合疗法(一线和二线药剂)、联合化疗和同种异体骨髓移植。一线、二线和三线治疗均有严重的不良反应并且耐受性不佳。itp(特别是由抗gpib-ix抗体介导的那些)的反应的缺乏目前尚不清楚，但我们目前的研究已表明，潜在机制可能是fc
γ
riia依赖性的。
[0006]
目前的药物疗法在控制hit和itp中的血栓形成方面并不是有效的，因为它们无法消除驱动血栓形成的有效促血栓形成过程，诸如fc
γ
riia依赖性血小板活化、血小板-嗜中性粒细胞相互作用和net形成。迫切需要用于hit和itp的更有效的治疗。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供结合fc
γ
riia受体或血小板因子4(pf4)以预防或治疗hit和itp的抗原结合片段。本发明减轻目前hit和itp治疗的至少一个缺点。
[0008]
根据本发明的第一实施方案，提供一种抗原结合片段，其通过阻断血小板上的fc
γ
riia结合或中和pf4来防止血小板的活化。
[0009]
根据本发明的一个更具体的实施方案，提供一种与fc
γ
riia特异性结合的抗原结合片段，任选地scfv，其中抗原结合片段包含：
[0010]
重链可变区，其包含：
[0011]
根据seq id no:3的重链cdr1序列；
[0012]
根据seq id no:4的重链cdr2序列；
[0013]
根据seq id no:5的重链cdr3序列；
[0014]
其中所述重链可变区与seq id no:13包含至少90％的序列同一性，
[0015]
以及轻链可变区，其包含：
[0016]
根据seq id no:6的轻链cdr1序列；
[0017]
根据seq id no:7的轻链cdr2序列；以及
[0018]
根据seq id no:8的轻链cdr3序列；
[0019]
其中所述轻链可变区与seq id no:14包含至少90％的序列同一性，并且
[0020]
其中重链和轻链可变区通过柔性接头区连接。
[0021]
根据本发明的另一个具体实施方案，提供一种与pf4特异性结合的抗原结合片段，任选地scfv，其中抗原结合片段包含：
[0022]
重链可变区，其包含：
[0023]
根据seq id no:16的重链cdr1序列；
[0024]
根据seq id no:17的重链cdr2序列；
[0025]
根据seq id no:18的重链cdr3序列；
[0026]
其中所述重链可变区与seq id no:22包含至少90％的序列同一性，
[0027]
以及轻链可变区，其包含：
[0028]
根据seq id no:19的轻链cdr1序列；
[0029]
根据seq id no:20的轻链cdr2序列；以及
[0030]
根据seq id no:21的轻链cdr3序列；
[0031]
其中所述轻链可变区与seq id no:23包含至少90％的序列同一性，并且
[0032]
其中重链和轻链可变区通过柔性接头区连接。
[0033]
根据另一个实施方案，柔性接头区包含10与30个之间的氨基酸的寡肽序列。寡肽可包含甘氨酸和丝氨酸残基的组合，并且根据一个具体实施方案，柔性接头区可包含具有如seq id no:9所示的氨基酸序列的寡肽。
[0034]
根据一个具体实施方案，根据本发明的抗原结合片段包含如seq id no:2所示的氨基酸序列或如seq id no:12所示的氨基酸序列。根据一个实施方案，根据本发明的抗原结合片段包含如seq id no:12所示的氨基酸序列。
[0035]
根据另一个具体实施方案，根据本发明的抗原结合片段包含如seq id no:15所示的氨基酸序列。
[0036]
根据本发明的另一个实施方案，抗原结合片段可与抗凝剂缀合。在某些实施方案中，抗凝剂可选自由以下组成的组：因子xa、因子iia、因子viia/组织因子、fxii抑制剂、地西芦丁、蜱抗凝血肽、因子xa抑制肽、凝血酶原抑制肽、达那肝素、比伐卢定、来匹卢定、阿加曲班和其他抗凝剂。在另外的实施方案中，抗凝剂包括有效防止凝块形成的抑制剂，例如net形成抑制剂和dna酶。根据具体实施方案，抗原结合片段与比伐卢定或来匹卢定缀合。根据某些实施方案，抗原结合片段可包含seq id no:10的氨基酸序列或seq id no:11的氨基酸序列，或任一序列的在框架区中具有1、2或3个氨基酸取代的变体。
[0037]
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种编码根据本发明的抗体结合片段的核酸分子。本发明还提供了包含根据本发明的核酸分子的载体，以及包含所述载体或核酸分子的宿主细胞，任选地哺乳动物或昆虫细胞。
[0038]
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种包含本发明的抗原结合片段的药物组合物。
[0039]
根据本发明的另一个实施方案，提供了一种治疗患有血栓形成相关疾病(任选地为itp或hit)的受试者(任选地为人受试者)的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本发明的至少一种抗原结合片段或本发明的药物组合物。
[0040]
根据本发明的另一个实施方案，提供了本发明的抗原结合片段用于制造用于治疗血栓形成相关疾病(任选地为itp或hit)的药品的用途。
附图说明
[0041]
图1示出hru1、hru2、hru3和hru4的蛋白质表达。(a)sds-page考马斯染色(c)和蛋白质印迹(w)。还示出分子量标志物。箭头指示与hru分子对应的蛋白质条带。(b)hru1、hru2、hru3和hru4与人血小板一起孵育并洗涤。使用抗c-myc-af-488检测结合的scfv。填充直方图代表阴性对照(不存在scfv)，而空心直方图代表hru scfv的结合。(c)血小板聚集由患者igg p1至p4或hit样抗体kko诱导(黑色条柱)，并被hru1-3(左图)或hru4(右图)抑制。(d)血清素释放由患者igg p1至p4或hit样抗体kko诱导(黑色条柱)，并被hru1-3(左图)或hru4(右图)抑制。h，hru。
[0042]
图2示出(a)在不存在(黑色条柱)和存在hru2或hru3的情况下由0.3u凝血酶诱导的血小板聚集。(b)hru2和hru3的凝血酶时间延迟测定。将浓度逐渐增加的hru1-3与由acd
抗凝的血液制备的未稀释血浆一起孵育。凝血时间以秒为单位示出。
[0043]
图3示出微流体室中hit条件的重建。(a)血管性血友病因子(von willebrand factor，vwf)涂布的微流体室上的血小板聚集的时间过程。血栓形成图像，其使用经指定时间积聚在涂布有vwf的表面上的dioc6标记的全血。图像示出在来自hit患者的hit igg加肝素的存在下的血栓形成以及在hru1-4的存在下血栓沉积的抑制。(b)该图示出对于患者样品p4，使用和不使用hru1的情况下相对于时间的面积覆盖百分比。iv.3moab用于比较。数据为平均
±
sd(n≥3)。(c)该图示出对于患者样品p1-3或hit样抗体kko，使用和不使用hru4的情况下相对于时间的面积覆盖百分比。数据为平均
±
sd(n≥3)。p，患者；sec或s，秒；hep，肝素。
[0044]
图4(a)示出hru1在体内结合tg小鼠血小板。(bf)人hit igg在fc riia/hpf4转基因小鼠中重现血小板减少症γ。向小鼠注射hit igg加肝素(n＝4)并在处理前(设置为100％)和该图中所示的时间确定血小板数量。在这些动物中，hru1、hru2、hru3或hru4显著抑制血小板减少症。*p《0.05；**p《0.01；****p《0.0001。
[0045]
图5-hru1、hru2、hru3或hru4抑制小鼠的血栓形成。(a)小鼠血小板在体内用抗cd42c-dylight649进行标记。用对照igg或hit igg或者hit igg加hru1对动物进行处理(均在肝素的存在下)。在ivis spectrum ct扫描仪上扫描处理后收集的肺。比例尺表示荧光的水平(上图)。肺荧光的定量在图中示出。肺切片用苏木精和伊红染色。在hit igg处理的动物中血栓丰富(黄色箭头)。在用hit igg hru1处理的动物的肺制备物中检测不到血栓(下图)(b)并且(c)hru4抑制小鼠的血栓形成。在使用或不使用hru4和肝素的情况下，用对照hit igg或kko处理动物。在ivis spectrum ct扫描仪上扫描固定的肺。肺中的绿色指示荧光的水平。肺荧光的定量在图中示出。肺切片用苏木精和伊红染色。在hit igg处理的动物中血栓丰富(黄色箭头)。(d和e)示出在使用或不使用hru2或hru3的情况下，用hit igg处理的小鼠肺中肺荧光的定量的图。在用hit igg hru处理的动物的肺制备物中检测不到血栓。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001。
[0046]
图6-hru1在抗gpix处理的小鼠中抑制血小板减少症。(a)抗gpix抗体在fc riia/hpf4双转基因小鼠中诱导血小板减少症γ(蓝线)。hru1有效抑制血小板减少症(红线)。(b)hru1在抗gpix处理的小鼠中抑制血栓形成。肺切片用苏木精和伊红染色。用对照igg处理的动物中不存在血栓，但在抗gpix抗体处理的动物中血栓丰富(黄色箭头)。在用抗gpix抗体 hru1处理的动物的肺制备物中检测不到血栓。(c)在体内用抗cd42c-dylight649标记小鼠血小板。用对照igg或抗gpix或抗gpix hru1处理动物。在抗gpix处理的小鼠中观察到富含血小板的血栓(红色)，但在hru1处理的动物中未观察到。****p《0.0001
[0047]
图7示出ctbr1与患者hit igg竞争结合pf4(使用荧光标记蛋白进行的elisa测定)。(a)增加ctbr1浓度减少hit igg与固定化的pf4的结合(示出来自两名患者1和2的hit igg)。gmf，几何平均荧光。(b)ctbr1fab(蓝线)抑制由hit igg加肝素(红线)诱导的血小板聚集。
[0048]
图8示出ctbr1fab的协同活性。ctbr1与次优浓度的hru3协同作用并且保护动物免于(a)hit igg诱导的血小板减少症和(b)hit igg诱导的小鼠肺部血栓形成。左图，小鼠肺的白光图像；中图，荧光(绿色)代表来自肺中凝块的信号；右图，与用红色显示的荧光叠加。(c)该图示出b中所示的肺荧光的定量(辐射效率)。*p《0.05；**p《0.01；ns，不显著。
[0049]
定义
[0050]
如在本技术中所使用的，单数形式“一个(a)”，“一种(an)”和“所述(the)”包括复数个指代物，除非上下文另外明确规定。例如，术语“抗原结合片段”还包括多个抗原结合片段。
[0051]
如本文所用，术语“包含”意指“包括”。词语“包含(comprising)”的变型诸如“包括(comprise)”和“含有(comprises)”具有相应变化的含义。因此，例如，“包括”施用抗原结合片段的治疗方法可以包括一种或多种另外的组分(例如盐、其他免疫调节剂、另一抗原结合片段)。
[0052]
如本文所用，术语“多个”意指多于一个。在某些具体的方面或实施方案中，多个可意指2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51或更多个，以及其中可衍生的任何整数和其中可衍生的任何范围。
[0053]
如本文所用，术语“抗体(antibody和antibodies)”是指由具有不同的fc区和fab区的两条重链和两条轻链组成的抗体。抗体可属于igg(包括igg1、igg2、igg3和igg4)、iga(包括iga1和iga2)、igd、ige、igm和igy亚类。
[0054]
如本文所用，术语“抗原结合片段”包括但不限于fv、fab、fab’和f(ab’)2、fd、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)以及包含vl或vh结构域的片段。根据一个实施方案，根据本发明的抗原结合片段不包括fc区。在具体实施方案中，抗原结合片段是指包含通过柔性接头连接的重链和轻链结构域的scfv。抗体结合片段或其部分/组分可源自任何动物来源或适当的生产宿主。包括单链抗体的抗原结合片段可包含单独的一个或多个可变区或与以下全部或部分组合的一个或多个可变区：铰链区、ch1、ch2和ch3结构域。还包括一个或多个可变区和一个或多个铰链区、ch1、ch2和ch3结构域的任何组合。抗体结合片段可以是特异性结合生物分子的单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体以及人单克隆和多克隆抗体。
[0055]
如本文所用，术语“人源化的抗原结合片段”是指包含来自人抗体以及非人抗体(例如鼠抗体)的序列的抗原结合片段的形式。例如，人源化的抗原结合片段可以包含基本上所有的至少一个可变结构域，其中所有/基本上所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有/基本上所有的ff区来自人免疫球蛋白序列。
[0056]
如本文所用，关于抗体、抗体变体、抗体衍生物、抗原结合片段等的术语“结合特异性”和“特异性结合”是指相比其他非靶分子其优先结合给定靶分子的能力。例如，如果抗体、抗体变体、抗体衍生物或抗原结合片段(“分子a”)能够“特异性结合”或“特异性地结合”给定靶分子(“分子b”)，则分子a具有在分子b与任何其他数量的潜在替代性结合配偶体之间进行区分的能力。因此，当暴露于作为潜在结合配偶体的多个不同但同样可及的分子时，分子a将选择性地结合分子b，而其他替代性的潜在结合配偶体将保持基本上不被分子a结合。通常，相比其他潜在结合配偶体，分子a将更频繁至少10倍，优选地50倍，更优选地100倍并且最优选地大于100倍地优先结合分子b。分子a能够以弱但可检测的水平与不是分子b的分子结合。这通常被称为背景结合，并且可容易地与分子b特异性结合区分开，例如通过使用适当的对照。
[0057]
如本文所用，术语“治疗有效量”包括足以提供期望治疗效果的本发明化合物或组
合物的足够但无毒的量。“治疗有效量”将因受试者而异，这取决于一种或多种因素，例如，所施用的特定药剂、所治疗病状的严重程度、所治疗的物种、受试者的年龄和一般状况以及施用方式。对于任何给定的情况，本领域普通技术人员可使用常规实验来确定适当的“有效量”。通常，“治疗有效量”是指足以导致以下情况中的一种或多种的量：疾病程度的下降/降低、疾病生长或进展的抑制、疾病生长的停止、疾病引起的不适的缓解，或患病脊椎动物的生命的延长。
[0058]
如本文所用，术语“受试者”包括具有经济、社会或研究重要性的任何动物，包含牛、马、绵羊、灵长类、鸟类和啮齿类物种。因此，“受试者”可以是哺乳动物，例如人或非人哺乳动物。
[0059]
如本文所用，术语“治疗”是指补救疾病状态或症状，或以其他方式防止、阻碍、延缓或逆转疾病或其他任何形式的不良症状进展的任何和所有用途。
[0060]
如本文所用，术语“药学上可接受的载剂”是指经联邦或州政府的监管机构或其他普遍认可的药典批准用于动物并且更尤其是人的手段。术语“载剂”是指与治疗剂一起施用的稀释剂、佐剂(例如完全或不完全弗氏佐剂)、赋形剂或媒介物。此类药物载剂可以是无菌液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些，诸如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。当静脉内施用药物组合物时，水是优选的载剂。盐水溶液以及右旋糖和甘油水溶液也可以用作液体载剂，尤其是用于可注射溶液。e.w.martin在“remington’s pharmaceutical sciences”中描述了合适的药物载剂的实例。此类组合物将包含预防或治疗有效量的载剂，以提供用于向受试者适当施用的形式。制剂应适合施用方式。在一个优选的实施方案中，药物组合物是无菌的并且为适于施用给受试者的形式，所述受试者优选地为哺乳动物受试者，并且更优选地为人受试者。
[0061]
如本文所用，相对于生物分子(例如抗原结合片段)，术语“分离的”是不含与其天然存在于一起的至少一些组分的生物分子。
[0062]
如本文所用，术语“蛋白质”和“多肽”各自是指由通过肽键连接在一起的氨基酸构成的聚合物并且可互换使用。出于本发明的目的，“多肽”可构成全长蛋白质或全长蛋白质的一部分。
[0063]
如本文所用，术语“糖蛋白(gp)ib/ix复合物”是指由gpib-α、gpib-β、gpix和gpv组成的多单元复合物。该复合物大量存在于血小板上并且是血小板粘附所必需的。在免疫性血小板病症中产生的自身抗体靶向gpib/ix复合物的组分并导致血小板减少症和血栓形成。
[0064]
术语
‘
fc
γ
riia’是指在某些细胞，特别是人血小板、巨噬细胞和嗜中性粒细胞表面发现的fc受体蛋白，其有助于免疫系统的保护功能。fc受体对被称为fc(片段，可结晶)区的抗体部分具有结合特异性。cd32免疫球蛋白g(igg)受体(fc
γ
riia)可以是人fc
γ
riia受体(例如，如由以下中的任一个所示的序列定义：ncbi参考序列登录号np_067674.2或np_001129691.1)。在一些实施方案中，fc
γ
riia受体蛋白可不包括信号肽和/或前肽。另外或可替代地，抗fc
γ
riia受体抗原结合片段可以能够特异性地结合存在于fc
γ
riia受体变体(例如fc
γ
riia同种型、剪接变体或同种异型)中的抗原表位。例如，抗fc
γ
riia受体抗原结合片段可以结合d1结构域或d2结构域内的表位或当两个结构域之间发生缔合时形成的表位。cd32免疫球蛋白g(igg)受体(fc
γ
riia)是其中igg免疫复合物(ic)介导炎症的疾病的潜在
治疗靶标。
[0065]
术语
‘
pf4’是指血小板因子4，一种由某些细胞，特别是活化的血小板分泌的小肝素结合蛋白。pf4的生物活性尚不清楚。然而，pf4本身可结合并中和血液中肝素和肝素样带负电荷分子的抗凝活性。pf4可以是人pf4(例如，如由以下中的任一个所示的序列定义：np_001350281.1或np_002610.1)。在一些实施方案中，pf4蛋白可不包括信号肽和/或前肽。另外或可替代地，抗pf4抗原结合片段可以能够特异性地结合存在于pf4蛋白变体(例如pf4同种型、剪接变体或同种异型)中的抗原表位。例如，抗pf4抗原结合片段可结合肝素结合结构域内或该结构域外部的表位，或者当pf4与其载体蛋白聚糖载体蛋白相互作用时形成的表位。
[0066]
如本文所用，术语“scfv”是指通过连接抗体的单个可变重链和轻链结构域而生成的单链可变片段。scfv保留了亲本抗体的结合特异性。
[0067]
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何递送系统。此类递送系统包括允许将反应试剂(例如适当容器中的标记、参考样品、支持材料等)和/或支持材料(例如缓冲液、用于施用药剂的书面说明等)从一个位置储存、运输或递送到另一个位置的系统。例如，试剂盒可以包含含有相关反应试剂和/或支持材料的一个或多个外壳(例如盒子)。术语“试剂盒”包括片段化试剂盒和组合试剂盒。“片段化试剂盒”是指包括各自含有全部试剂盒组分的子部分的两个或更多个单独容器的递送系统。容器可一起或单独地递送给预期的接受者。任何包括各自含有全部试剂盒组分的子部分的两个或更多个单独容器的递送系统都包括在术语“片段化试剂盒”的含义内。“组合试剂盒”是指在单个容器(例如，容纳期望组分中的每一种的单个盒子)中含有用于递送的所有组分的递送系统。
[0068]
如本文所用，术语“约”在参考所引用的数值使用时包括所引用的数值和在所引用的数值的正负百分之十之内的数值。
[0069]
如本文所用，术语“之间”在参考数值范围使用时包括该范围的每个端点处的数值。例如，长度为10个残基与20个残基之间的多肽包含长度为10个残基的多肽和长度为20个残基的多肽。
[0070]
本文中对现有技术文件的任何描述或本文中衍生自或基于那些文件的陈述并非承认所述文件或衍生的陈述是相关技术的公知常识的一部分。
[0071]
出于描述的目的，除非另外说明，否则本文所参考的所有文件均据此通过引用整体并入。
具体实施方式
[0072]
仍然需要与itp或免疫性血小板病症相关的hit和血栓形成的更有效的治疗，其中特异性受体被靶向，以抑制通过fc
γ
riia实现的抗体诱导的血小板活化和嗜中性粒细胞活化，从而提供更有效的治疗和/或减少副作用。
[0073]
血小板活化发生在血管损伤之后，从而防止失血并且对于维持机体稳态是必不可少的。然而，血小板活化也是致病过程(诸如血栓形成相关疾病和病症中的血栓形成)的一部分。这涵盖在免疫性血小板病症中，包括免疫性血小板减少症、hit或itp。hit是由肝素施用引起的，其通过免疫介导的反应导致血小板的活化，所述免疫介导的反应包括自身抗体在肝素的存在下与被称为血小板因子4(pf4)的血液因子反应。然后，该复合物通过与fc
γ
riia受体的缔合激活血小板。血小板活化则导致凝块形成，这可能导致需要截肢，或者在更严重的情况下，导致死亡。虽然抗凝剂的使用是目前公认的做法，但这些抗凝剂的作用有限并且经常有严重的副作用。例如，来匹卢定是一种重组肽，它是直接的凝血酶抑制剂，但在施用时，由于蛋白水解作用，其以剂量依赖性方式起作用并且半衰期很短。因此，剂量控制困难，并且超剂量用药导致出血。此外，在hit期间停用肝素不产生快速改善，因为hit抗体继续通过和与内源性聚阴离子(诸如硫酸软骨素或核酸)复合的pf4相互作用而发挥作用。
[0074]
类似地，血小板病症，特别是itp，包括主要由识别存在于血小板和巨核细胞(血小板前体细胞)表面上的糖蛋白的自身抗体引起的一组异质性病症。自身抗体识别丰富的血小板糖蛋白，主要是纤维蛋白原受体gpiib/iiia或血管性血友病因子受体gpib/ix。这些抗体通过若干机制导致总血小板计数减少，包括脾脏中的血小板破坏、巨核细胞产生的血小板减少和肝脏对血小板的摄取。
[0075]
由针对gpib/ix复合物的自身抗体引起的涵盖在“itp”内的血小板病症引发特定的致病作用，其导致严重的血小板减少症和血栓形成并且对一些治疗干预诸如静脉内免疫球蛋白治疗的反应性较低。针对gpib/ix的抗体可导致血小板去唾液酸化和随后肝脏对血小板的清除。itp的一个可能矛盾的方面是，即使在血小板计数低时，患者也有发展血栓形成的倾向。解释这一观察结果的机制尚不清楚，但表明它可能与某些自身抗体诱导的血小板活化有关。这一假设得到了使用在其血小板上表达人fc
γ
riia受体(fc
γ
riia或cd32)的转基因小鼠获得的以下研究发现的支持：即，针对gpib/ix复合物的gpix亚基的抗体导致血小板减少症和血栓形成。在itp中发现的针对gpib/ix的抗体可导致血小板破坏和血小板活化以及血栓形成。其他免疫性病状诸如药物诱导的血小板减少症(ditp)、系统性红斑狼疮(sle)和类风湿性关节炎的致病方面也取决于fc
γ
riia受体的活化和/或通过其实现的信号传导。
[0076]
不希望受理论的束缚，推测本发明通过阻断fc
γ
riia受体或阻断pf4与其相应配体的结合并从而防止血栓形成的抗原结合片段来起作用。
[0077]
因此，本发明的某些实施方案提供fc
γ
riia特异性和pf4特异性抗原结合片段以及包含抗原结合片段及其变体的药物组合物。本发明的其他实施方案涉及治疗患有血栓形成相关疾病的受试者的所述血栓形成相关疾病的方法。本发明的另外方面涉及包含抗原结合片段的药品及其制备方法。本发明还设想了与受体结合并抑制其功能的fc
γ
riia或pf4的小分子抑制剂。
[0078]
fc
γ
riia特异性和pf4特异性抗原结合片段
[0079]
本发明包括包含至少一种fc
γ
riia特异性和/或pf4特异性抗原结合片段、其衍生物或变体的方法、药物组合物和药品。
[0080]
根据本发明的抗fc
γ
riia或pf4特异性抗原结合片段可包含重链和轻链，所述重链和轻链可源自或可不源自相同来源。
[0081]
根据本发明的抗原结合片段和/或其变体不限于任何特定的同种型。在一些实施方案中，它们是人源化的抗原结合片段和/或其变体。
[0082]
包括在本发明范围内的是抗体的“片段”。一般来说，片段是“抗原结合片段”，因为它们能够像它们所源自或它们所基于的亲本抗体一样特异性地结合抗原/表位(例如fc
γ
riia或pf4)。通常，抗原结合片段保留亲本抗体的抗原/表位结合能力的至少10％，或亲本
抗体的抗原/表位结合能力的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。还设想本文所述的抗体的抗原结合片段可包括基本上不改变其抗原/表位结合特异性/能力(例如其抗原/表位结合特异性/能力的至少70％、80％、90％、95％、99％或100％(例如，可保留其抗原/表位结合特异性/能力的至少70％、80％、90％、95％、99％或100％)的保守氨基酸取代。
[0083]
抗原结合片段的非限制性实例包括全长抗体、肽及其衍生物的一部分，包括例如fab、fab’、f(ab)2、f(ab)3、fv、单链fc(scfv)、dsfv、fd片段、fab片段分子(例如scfv)、微型抗体、双抗体、三抗体、四抗体、κ体、线性抗体、由抗体片段形成的多特异性抗体片段，以及抗体的能够特异性结合相关抗原/表位(例如fc
γ
riia或pf4)的任何部分或肽序列。另一个非限制性实例包括包含通过接头连接的重链可变区和轻链可变区的单链抗原结合片段，其中抗原结合片段区可以是同源或异源的。更进一步的非限制性实例包括包含通过柔性接头连接的重链可变区和轻链可变区的单链抗原片段。
[0084]
根据本发明的对fc
γ
riia具有特异性的抗原结合片段的具体实例包括scfv hru1至hru4。根据本发明的对pf4具有特异性的抗原结合片段的实例是ctbr1。
[0085]
hru1(包含如seq id no:2所示的氨基酸序列)是通过利用柔性接头连接iv.3抗体的单个可变重链和轻链结构域而构建的源自小鼠iv.3单克隆抗体(mab)的scfv，并且经过了一些突变框架修饰以将scfv人源化。hru2和hru3包含与比伐卢定(hru2；包含如seq id no:10所示的氨基酸序列)或来匹卢定(hru3；包含如seq id no:11所示的氨基酸序列)缀合的hru1。hru4(包含如seq id no:12所示的氨基酸序列)也是通过利用柔性接头连接iv.3抗体的单个可变重链和轻链结构域而构建的scfv hru2)hhhh，并且经过了进一步的突变框架修饰以获得最佳功能
–
因此是单链人源化的抗体片段“scfv”。hru4可以与抗凝肽(例如常用于hit治疗的比伐卢定和来匹卢定)缀合以产生双功能剂，即抗血栓形成且抗凝的剂。
[0086]
hru1和hru2均包含相同的轻链和重链可变区cdr，其中重链可变区cdr为seq id no 3、4和5并且轻链可变区cdr为seq id no:6、7和8，并且根据本发明的fc
γ
riia结合片段将包含那些cdr，而设想了一个或多个框架区的一些修饰，包括一个或多个保守或人源化取代或修饰，如下文所述。
[0087]
ctbr1(包含如seq id no:15所示的氨基酸序列)是源自对人pf4具有特异性的鼠单克隆抗体的scfv，通过利用柔性接头连接所述抗体的单个可变重链和轻链结构域而构建。ctbr1包含seq id no:16、17和18的重链可变区cdr，以及seq id no 19、20和21的轻链可变区cdr，并且根据本发明的pf4结合片段将包含那些cdr，而再次设想了一个或多个框架区的一些修饰，包括一个或多个保守取代或修饰，如下文所述。
[0088]
用于连接重链和轻链的可变区的接头可以是本领域已知的用于蛋白质化学的任何合适的接头。接头本质上可以是基本上线性的，或者可以是支化的，但允许抗原结合片段的重肽部分独立于其轻链部分移动，并且可以是，例如，包含一个或多个任何合适的有机部分的线性c1-c50接头。在某些实施方案中，接头可包含寡肽，或可以是拟肽(包含多个或唯一氨基酸类似物)。接头可源自天然序列、其变体或合成序列。寡肽或拟肽接头可包含，例如，天然存在的、非天然存在的氨基酸，或两者的组合。用于根据本发明的抗原结合片段的接头的非限制性实例可包含5-60个之间的氨基酸的寡肽，其可例如包含一系列规则的甘氨酸和1至3个丝氨酸以提高溶解度。根据一个实施方案，用于连接根据本发明的scfv的重链
和轻链部分的接头是具有如seq id no:9所示的氨基酸序列的17氨基酸丝氨酸5甘氨酸
12
接头。
[0089]
还包括在本发明的范围内的是本文所述的抗原结合片段的“衍生物”。本发明的抗原结合片段的“衍生物”是指本文所述的抗原结合片段，其被修饰以掺入另外的组分或一种或多种现有组分已改变，但仍能够与其所源自的亲本抗体特异性地结合相同的抗原/表位(例如fc
γ
riia或pf4)。通常，如本文所设想的抗原结合片段衍生物保留亲本抗体的抗原/表位结合能力的至少10％，或其所源自的亲本抗体的抗原/表位结合能力的至少25％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或100％。
[0090]
适于形成抗体衍生物的修饰的非限制性实例包括酰胺化、糖基化、磷酸化、聚乙二醇化、脂化、与细胞配体或其他蛋白质的连锁(linage)、通过已知的保护/封闭基团进行的衍生化、乙酰化等。另外或可替代地，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。
[0091]
抗原结合片段衍生物可由本文所述的抗原结合片段的共价修饰形成，例如，通过使抗原结合片段的靶向氨基酸残基与能够与所选侧链或末端残基反应的剂反应。例如，用双功能剂衍生化是用于将抗原结合片段与大分子载体诸如水不溶性支持基质交联的有用手段。如本文所设想的抗原结合片段及其衍生物可具有与抗原结合片段的碱基连接的剂，所述剂能够增加其体内半衰期(例如，延长从血流中清除之前的时间长度)。这种技术的非限制性实例包括添加peg部分。
[0092]
在某些实施方案中，抗原结合片段衍生物可以是多聚体，例如二聚体，所述多聚体包含一个或多个单体，其中每个单体包括(i)如本文所述的抗原结合区，或由其衍生的多肽区域(例如，通过一个或多个氨基酸的保守取代)，以及(ii)多聚化(例如二聚化)多肽区域，使得抗原结合片段形成特异性结合抗原/表位(例如fc
γ
riia或pf4)的多聚体(例如同源二聚体)。例如，如本文所述的抗fc
γ
riia的抗原结合区或由其衍生的多肽区域可与异源蛋白质重组或化学地融合，其中异源蛋白质包含二聚化或多聚化结构域。可使衍生物经受允许形成同源二聚体或异源二聚体的条件。异源二聚体可包含相同的二聚化结构域但不同的抗fc
γ
riia抗原结合片段、相同的抗fc
γ
riia抗原结合片段但不同的二聚化结构域，或不同的抗fc
γ
riia抗原结合片段和不同的二聚化结构域。合适的二聚化结构域包括源自转录因子的那些(例如碱性区域亮氨酸拉链和锌指)、碱性区域螺旋-环-螺旋蛋白，以及免疫球蛋白恒定区(例如重链恒定区或其结构域，诸如ch1结构域、ch2结构域或ch3结构域)。
[0093]
包括在本发明的范围内的是本文所述的抗原结合片段的“变体”。“变体”抗原结合片段是指通过在“亲本”抗原结合片段序列中添加、缺失和/或取代一个或多个氨基酸残基来改变来自亲本抗原结合片段氨基酸序列的氨基酸序列的抗原结合片段。例如，变体抗原结合片段可在亲本抗原结合片段的一个或多个cdr和/或框架区中包含一个或多个氨基酸取代(例如亲本抗原结合片段的一个或多个重和/或轻链cdr和/或框架区中的1个与10个之间、2个与5个之间，或1、2、3、4或5个取代)。抗原结合片段变体可包含与亲本抗原结合片段的相应可变结构域具有至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％氨基酸序列同源性(即序列同一性)的重链可变结构域序列和/或轻链可变结构域序列氨基酸序列。
[0094]
两个序列之间的序列同源性或同一性在本文中定义为在比对序列并在必要时引入空位以实现最大序列同一性百分比之后候选序列中与亲本抗原结合片段残基相同的氨
基酸残基的百分比。如果待相互比较的两个序列的长度不同，则序列同一性涉及较短序列中与较长序列的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。序列同一性可以通过使用诸如bestfit程序(wisconsin sequence analysis package,用于unix的版本8,genetics computer group,university research park,575science drive,madison,wisconsin,53711)和/或程序“fasta20u66”(版本2.0u66,1998年9月,william r.pearson和university of virginia；另外参见w.r.pearson(1990),methods in enzymology 183,63-98)的计算机程序常规确定。
[0095]
在一些实施方案中，如本文所述的变体抗原结合片段可因可变抗原结合片段的序列中的一个或多个保守氨基酸变化而不同于亲本抗原结合片段。“保守变化”是指基本上抗原性或构象上中性的改变，与亲本抗原结合片段相比，其在变体抗原结合片段的三级结构上产生最小变化，或在变体抗原结合片段的抗原决定簇上产生最小变化，并且不使衍生物不能与亲本抗原结合片段结合相应抗原中的相同表位。保守氨基酸变化的非限制性实例包括疏水性氨基酸的取代和生理化学上相似氨基酸的取代。本领域普通技术人员可以常规地并且没有困难地评估给定的氨基酸取代是否可以在维持构象和抗原中性(antigenic neutrality)的同时进行(参见，例如berzofsky,(1985)science 229:932-940；bowie等人(1990)science 247:1306:1310)。
[0096]
蛋白质构象的改变可使用众所周知的测定，包括但不限于微补体固定(microcomplement fixation)方法(参见wasserman等人(1961)j.immunol.87:290-295；levine等人(1967)meth.enzymol.11:928-936)并通过使用构象依赖性单克隆抗体的结合研究(参见lewis等人(1983)biochem.22:948-952)来实现。一个或多个保守氨基酸变化可发生在亲本抗原结合片段的一个或多个cdr和/或框架区中(例如亲本抗原结合片段的一个或多个cdr和/或框架区中的1个与10个之间、2个与5个之间，或1、2、3、4或5个保守取代)。
[0097]
本发明的抗原结合片段可包含如本文所述的非人抗原结合片段的人源化衍生物。如本文所设想的“人源化的”抗原结合片段是人/非人嵌合抗原结合片段，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。例如，人源化的抗原结合片段可以是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的一个或多个cdr区的残基被来自非人物种(例如，对fc
γ
riia或pf4具有一些期望的特异性和亲和力的小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的cdr区(供体cdr)的残基替代。人免疫球蛋白的框架区(fr)残基也可(任选地)被相应的非人残基替代，并且在一些情况下，人源化的抗原结合片段可包含不存在于受体抗原结合片段或供体抗原结合片段中的残基以提高抗原结合片段的性能。
[0098]
本文进一步设想的是“嵌合”抗原结合片段衍生物，其中重链和/或轻链的一部分与本文所述的源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗原结合片段的相应序列相同或同源，而一条或多条链的其余部分与源自另一不同物种或属于另一不同抗体类别或亚类的抗原结合片段中的相应序列相同或同源。例如，如本文所设想的嵌合抗原结合片段可包含源自如本文所述的fc
γ
riia或pf4抗原结合片段的可变区重链区和源自第二物种的轻链区。嵌合抗原结合片段可例如通过属于不同物种的免疫球蛋白基因片段的基因工程化而产生。
[0099]
一般来说，如本文所设想的人源化、嵌合、衍生、抗原结合片段仍然能够与其所源自或包含其一种或多种组分的亲本抗体或抗原结合片段特异性地结合相同抗原/表位(例
第4版,(2003)rowe等人(编辑),the pharmaceutical press,london,american pharmaceutical association,washington，并且可包括，例如，蒸馏水、盐水溶液、植物基油(诸如花生油、红花油、橄榄油、棉子油、玉米油、芝麻油、花生油或椰子油)、硅油(包括聚硅氧烷、挥发性有机硅)、矿物油(诸如脂质石蜡、软石蜡或角鲨烯)、纤维素衍生物(诸如甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、羧甲基纤维素钠或羟丙基甲基纤维素)、低级烷醇(例如乙醇或异丙醇)、低级芳烷醇、低级聚亚烷基二醇或低级亚烷基二醇(例如聚乙二醇、聚丙二醇、乙二醇、丙二醇、1,3-丁二醇)或甘油、脂肪酸酯(诸如棕榈酸异丙酯、肉豆蔻酸异丙酯或油酸乙酯)、聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、角叉菜胶、黄蓍胶或阿拉伯树胶以及凡士林。通常，一种或多种载剂将形成按重量计组合物的10％至99.9％。
[0109]
在某些实施方案中，本发明的药品和药物制剂可呈适于通过注射施用的形式、适于口服摄取的制剂的形式(诸如胶囊、片剂、囊片、酏剂)、适于局部施用的软膏、霜剂或洗剂的形式、适于作为滴眼剂递送的形式、适于通过吸入(诸如通过鼻内吸入或经口吸入)施用的气雾剂形式，或适于肠胃外施用(即，皮内、皮下、肌内或静脉内注射)的形式。
[0110]
用于口服施用的药品和药物制剂的固体形式可包含人和兽医药物实践中可接受的粘合剂、甜味剂、崩解剂、稀释剂、调味剂、包衣剂、防腐剂、润滑剂和/或时间延迟剂。合适的粘合剂包括阿拉伯树胶、明胶、玉米淀粉、黄蓍胶、海藻酸钠、羧甲基纤维素或聚乙二醇。合适的甜味剂包括蔗糖、乳糖、葡萄糖、阿斯巴甜或糖精。合适的崩解剂包括玉米淀粉、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、黄原胶、膨润土、海藻酸或琼脂。合适的稀释剂包括乳糖、山梨糖醇、甘露糖醇、右旋糖、高岭土、纤维素、碳酸钙、硅酸钙或磷酸二钙。合适的调味剂包括薄荷油、冬青油、樱桃、橙子或覆盆子调味剂。合适的包衣剂包括丙烯酸和/或甲基丙烯酸和/或其酯的聚合物或共聚物、蜡、脂肪醇、玉米醇溶蛋白、虫胶或谷蛋白。合适的防腐剂包括苯甲酸钠、维生素e、α-生育酚、抗坏血酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯或亚硫酸氢钠。合适的润滑剂包括硬脂酸镁、硬脂酸、油酸钠、氯化钠或滑石粉。合适的时间延迟剂包括单硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯。
[0111]
除以上剂之外，用于口服施用的药品和药物制剂的液体形式还可包含液体载剂。合适的液体载剂包括水、油，诸如橄榄油、花生油、芝麻油、葵花油、红花油、花生油、椰子油、液体石蜡、乙二醇、丙二醇、聚乙二醇、乙醇、丙醇、异丙醇、甘油、脂肪醇、甘油三酯或其混合物。
[0112]
用于口服施用的混悬剂还可包含分散剂和/或悬浮剂。合适的悬浮剂包括羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、海藻酸钠或乙酰醇。合适的分散剂包括卵磷脂；脂肪酸诸如硬脂酸的聚氧乙烯酯；聚氧乙烯山梨糖醇的单油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯；聚氧乙烯脱水山梨糖醇的单油酸酯或二油酸酯、硬脂酸酯或月桂酸酯等。
[0113]
为了制备作为可注射溶液或混悬剂的药品和药物制剂，可使用无毒的肠胃外可接受的稀释剂或载剂，诸如林格氏溶液、等渗盐水、磷酸盐缓冲盐水、乙醇和1,2丙二醇。
[0114]
用于口服施用的乳液还可包含一种或多种乳化剂。合适的乳化剂包括如上文例举的分散剂，或天然胶，诸如瓜尔胶、阿拉伯树胶或黄蓍胶。
[0115]
局部制剂包含一种或多种活性成分(例如，即本发明的抗体和/或其抗原结合片段)与一种或多种可接受的载剂，以及任选的任何其他治疗成分。适于局部施用的制剂包括
适于穿透皮肤到达需要治疗的部位的液体或半液体制剂，诸如擦剂、洗剂、霜剂、软膏或糊剂，以及适于向眼、耳或鼻施用的滴剂。
[0116]
当配制成滴剂时，药品和药物制剂可包含无菌水性或油性溶液或悬浮液。这些可通过将活性成分溶解在杀细菌剂和/或杀真菌剂和/或任何其他合适的防腐剂的水溶液中来制备，并任选地包括表面活性剂。然后可通过过滤使所得溶液澄清，转移到合适的容器中并灭菌。例如，可通过过滤实现灭菌，然后通过无菌技术转移到容器中。适合包含在滴剂中的杀细菌剂和杀真菌剂的实例是硝酸苯汞或醋酸苯汞(0.002％)、苯扎氯铵(0.01％)和醋酸氯己定(0.01％)。用于制备油性溶液的合适溶剂包括甘油、稀释的醇和丙二醇。
[0117]
当配制成霜剂、软膏或糊剂时，药品和药物制剂可以是活性成分的外用半固体制剂。它们可通过将极细的或粉末形式的活性成分(单独或在水性或非水性流体的溶液或悬浮液中)与油脂性基质(greasy basis)或非油脂性基质(non-greasy basis)混合来制备。基质可包括烃类，诸如硬石蜡、软石蜡或液体石蜡、甘油、蜂蜡、金属皂(metallic soap)；胶浆剂(mucilage)；天然来源的油，诸如杏仁油、玉米油、花生油、蓖麻油或橄榄油；羊毛脂或其衍生物，或诸如硬脂酸或油酸的脂肪酸以及诸如丙二醇或聚乙二醇(macrogol)的醇。
[0118]
药品和药物制剂可包括任何合适的表面活性剂，诸如阴离子、阳离子或非离子表面活性剂，诸如脱水山梨糖醇酯或其聚氧乙烯衍生物。还可使用悬浮剂诸如天然胶、纤维素衍生物或无机材料诸如胶体二氧化硅，以及其他成分诸如羊毛脂。
[0119]
用于治疗血栓形成相关疾病的方法
[0120]
hit是肝素治疗的危及生命的血栓性并发症。当患者被肝素致敏后形成由pf4和特定hit免疫球蛋白(igg)组成的免疫复合物时，发生hit。这些免疫复合物通过fc
γ
riia受体与血小板相互作用，诱导受体交联，从而导致血小板活化。
[0121]
活化的血小板随后释放pf4，所述pf4放大免疫复合物介导的血小板活化事件并且还产生启动下游凝血途径的促凝血微粒。临床后果包括静脉血栓形成，诸如深静脉血栓形成和肺栓塞；动脉血栓形成，诸如心肌梗塞、中风和肢体坏疽(通常需要截肢)。本文的抗原结合片段和治疗方法提供了阻断hit抗体/pf4/聚阴离子免疫复合物的有害活性的能力。
[0122]
其他免疫病状诸如免疫性血小板减少症(itp)(以产生自身反应性抗体为特征的自身免疫性出血病症)、药物诱导的血小板减少症(ditp)、系统性红斑狼疮(sle)和类风湿性关节炎的致病方面也依赖于通过fc
γ
riia受体实现的激活和/或信号传导。通过本文所述的抗fc
γ
riia抗原结合片段实现的有效抑制可以另外减轻这些严重的疾病。
[0123]
itp可以是原发性的或继发于其他病状。原发性itp被定义为在不存在其他可能导致血小板减少症的原因或情况下孤立的血小板计数低于100x 109/l(参考计数150-400x 109/l)。继发性itp由多种条件引起，包括多种药物(利福平、万古霉素、奎宁)、幽门螺杆菌(h.pylori)感染、hiv、丙型肝炎、狼疮、其他自身免疫性病症、抗磷脂综合征以及恶性肿瘤。
[0124]
患有血栓形成相关疾病(特别是hit和itp)或有此风险的受试者的鉴定是本领域普通技术人员公知的。例如，在hit的情况下，诊断标准通常是肝素开始前血小板计数正常，血小板减少症定义为血小板计数从受试者的基线血小板计数下降30％至《100x109/l或下降》50％，通常在开始肝素治疗后5-10天开始出现血小板减少症，这在先前暴露于肝素(100天内)、血液学、急性血栓形成事件和hit抗体血清转换的情况下可能发生得更早。
[0125]
例如，原发性itp通常通过低血小板计数、正常骨髓和不存在血小板减少症的其他
原因进行定义。itp可以使用标准测试进行诊断，包括：尿分析、cbc及分类计数(cbc with differential)、血液学、凝血、血清化学、表面活性剂d、红细胞沉降率和c反应蛋白。hit和itp(原发性或继发性)可导致出血、血栓形成和终末器官损伤。
[0126]
一旦确定受试者患有血栓形成相关疾病(诸如hit和itp)或有此风险，本发明的方法即可用于治疗受试者的那些疾病。
[0127]
应当理解，本文所述方法的上下文中的“治疗”是指与itp或hit相关的症状的完全或部分减轻，或减缓、抑制或停止itp或hit的进一步进展。通常，治疗反应可以被认为是血小板计数增加到高于使受试者处于出血风险(30x109)的那些阈值、血栓形成损伤和终末器官损伤的改善/解决。
[0128]
本发明的一个非限制性实例包括向患有中度至重度itp(原发性或继发性)的受试者施用抗原结合片段，其中受试者具有出血、血栓形成、深静脉血栓形成(dvt)、瘀点或瘀斑。本发明的另一个非限制性实例包括向患有中度至重度hit的受试者施用抗原结合片段，其中受试者对华法林或其他抗凝剂的反应降低或不足。
[0129]
本发明的一个非限制性实例包括将抗原结合片段施用给具有其他免疫病状与血小板减少症和/或血栓形成和/或终末器官损伤的受试者。另外的非限制性实例包括net诱导的血栓栓塞、器官损伤、其他net相关病症、与药物、病毒感染或抗体治疗相关的itp、抗磷脂综合征、癌症诱导的血小板减少症和血栓栓塞、涉及fc
γ
rii(cd32)并涉及一种或多种以下细胞的自身免疫性或炎症性疾病；血小板、嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞。
[0130]
在本发明的一个具体实施方案中，所述方法包括一种或多种抗体结合片段的组合，其中所述组合还包括向受试者施用两种、三种、四种、五种、六种或更多种本文所述的抗体结合片段。在另一个实施方案中，所述方法包括向受试者施用两种或更多种一起作用以抑制fc
γ
riia和/或pf4抗体结合的治疗。
[0131]
在一些实施方案中，以足以在可以治疗的疾病严重程度的至少一个指标中产生改善，优选持续改善的量和时间向受试者施用一种或多种抗原结合片段。可使用各种指标来评估治疗的量和时间是否足够。此类指标包括，例如，疾病严重程度、症状和/或病症或病状的表现的临床公认指标。改善程度通常由医生确定，所述医生可使用体征、症状、活组织检查或其他测试结果进行确定。
[0132]
受试者可以是可以受益于抗原结合片段的施用的任何动物。在一些实施方案中，受试者是哺乳动物，例如人、狗、猫、马、牛、猪、灵长类动物或啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。
[0133]
所述方法可包括施用“治疗有效量”的根据本发明的抗原结合片段。“治疗有效量”将被理解为是指在患有hit或itp或有此风险的受试者中完全或部分减轻与hit或itp相关的症状，或减缓、抑制或停止那些症状的进一步进展或恶化的抗原结合片段的量。
[0134]
治疗有效量可根据施用途径、特定抗原结合片段和剂型而变化。根据本发明，抗原结合片段的有效量通常在约0.001至最多100mg/kg/天的范围内，例如在约0.05至最多20mg/kg/天的范围内。通常，抗原结合片段提供表现出高治疗指数的制剂。治疗指数是毒性作用与治疗作用之间的剂量比，其可以表示为ld
50
与ed
50
之间的比率。ld
50
是对50％的群体致死的剂量，并且ed
50
是对50％的群体治疗有效的剂量。ld
50
和ed
50
通过标准制药程序在动物细胞培养物或实验动物中确定。
[0135]
通常，根据本发明，抗原结合片段的有效剂量预期在每24小时每千克体重约0.0001mg至约1000mg的一种或多种活性组分(即根据本发明的抗原结合片段)的范围内；通常，为每24小时每千克体重约0.001mg至约750mg；每24小时每千克体重约0.01mg至约500mg；每24小时每千克体重约0.1mg至约250mg；每24小时每千克体重约1.0mg至约250mg。更典型地，预期有效剂量范围在每24小时每千克体重约1.0mg至约200mg；每24小时每千克体重约1.0mg至约100mg；每24小时每千克体重约1.0mg至约50mg；每24小时每千克体重约1.0mg至约25mg；每24小时每千克体重约5.0mg至约50mg；每24小时每千克体重约5.0mg至约20mg；每24小时每千克体重约5.0mg至约15mg的范围内。
[0136]
可替代地，有效剂量可最高至约500mg/m2的一种或多种活性组分(即，根据本发明的抗原结合片段)。通常，预期有效剂量在约0.1至约500mg/m2，优选地约1至约250mg/m2，更优选地约1至约200mg/m2，优选地约1至约150mg/m2，更优选地约1至约100mg/m2，更优选地约1至约50mg/m2，甚至更优选地约1至约25mg/m2，并且甚至更优选地约1至约5mg/m2的范围内。
[0137]
通常，对于治疗应用，治疗将持续受试者的任一病状itp或hit的持续时间。此外，对于本领域普通技术人员将显而易见的是，各个剂量的最佳量和间隔将由itp或hit的性质和严重程度、施用的形式、途径和部位以及正在治疗的特定个体的性质确定。此外，此类最佳条件可以通过常规技术确定。
[0138]
在许多情况下，将希望几次或多次施用抗原结合片段。在某些实施方案中，给定剂量可施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多次。所述剂量可施用给受试者一次，或以一定的间隔施用多于一次，例如每天一次、每周一次、每周两次、每周三次、每月一次、每月两次、每月三次、每两个月一次、每三个月一次、每六个月一次或一年一次。治疗的持续时间以及治疗的剂量和/或频率的任何变化可以在治疗过程中改变或变化，以便满足受试者的特定需要。对于本领域普通技术人员将显而易见的是，可以使用常规的治疗过程确定测试来确定最佳治疗过程。
[0139]
在某些实施方案中，抗原结合片段可以被配制用于各种施用途径，例如，通过肠胃外(例如皮内、静脉内、脊柱内、腹膜内、皮下或肌内)，或通过植入型药盒。全身或肠胃外施用包括但不限于腹膜内、肌内、皮下、粘膜内和静脉内注射。在一个实施方案中，抗原结合片段通过静脉内途径施用。可接受的粘膜施用途径的非限制性实例包括鼻内、经颊、生殖道、直肠、气管内、皮肤和胃肠道。
[0140]
在本文所述的某些方法中，抗原结合片段可与其他剂或疗法组合施用，包括与使用抗凝剂或替代性抗凝剂的当前护理标准组合施用。抗原结合片段可以是如本文所述的药物制剂或药品的组分。用于hit的另外的剂或疗法的非限制性实例包括：阿加曲班、比伐卢定、磺达肝素、华法林、达那肝素、利伐沙班、达比加群和阿哌沙班。用于itp的另外的剂或疗法的非限制性实例包括强的松、丙种球蛋白、抗rho(d)免疫球蛋白(winrho)、利妥昔单抗、达那唑、硫唑嘌呤、环磷酰胺、长春新碱、长春碱和罗米司亭(romiplostim)。抗原结合片段可与另外的剂或疗法同时施用于受试者。此类另外的一种或多种剂可口服施用或通过另一途径施用，例如通过iv注射。另外或可替代地，其抗原结合片段可在施用另外的一种或多种剂或疗法之前或之后施用给受试者。
[0141]
实施例
[0142]
现在将参考一个或多个具体实施例描述本发明，所述实施例不应以任何方式被视
为限制性的。
[0143]
实施例1
[0144]
材料和方法
[0145]
患者
[0146]
从在患有hit的患者知情同意的情况下收集的储存血清中随机选择样品。hit的诊断是根据如先前所定义的标准(amiral j等人(1998)baillieres clin.haematol.)进行的。该研究获得悉尼东南部伊拉瓦拉/悉尼东部地区卫生服务伦理委员会(south-eastern sydney illawarra/eastern sydney area health service ethics committees)的批准。在知情同意的情况下获得来自健康供体的血液和血浆。
[0147]
scfv的分子克隆和人源化
[0148]
根据制造商的说明，使用rneasy mini试剂盒(qiagen,germany)从iv.3杂交瘤细胞中分离总rna。第一链cdna使用用于qrt-pcr的superscript
tm iii first-strand synthesis supermix(invitrogen,carlsbad,ca)合成。使用特异性引物进行重链和轻链的pcr扩增。重链可变区正向引物5’ggccagtggatagtcagatgggggtgtcgttttggc-3’(seq id no:24)和反向引物5
’‑
gaggtgaagctggtggagtc-3’(seq id no:25)。轻链可变区正向引物5
’‑
ggatacagttggtgcagcatc-3’(seq id no:26)和反向引物5
’‑
gatattgtgatgacgcaggct-3’(seq id no:27)。
[0149]
对于vh，pcr在以下条件下进行：95℃，5分钟；94℃，45秒，35个循环；50℃，45秒；72℃，90秒；然后是72℃，5分钟；对于vl，条件为95℃，5分钟；94℃，45秒，30个循环；54℃，45秒；72℃，90秒；然后是72℃，5分钟。两个扩增片段均克隆到载体(invitrogen)中。两个可变片段的核苷酸序列均使用bigdye terminator v3.1sequencing reagent(applied biosystems,ca)确认。通过使用互补决定区(cdr)移植和点突变方法将scfv人源化。保留了六个cdr的序列，并改变了框架区(fr)中的选定氨基酸残基，以反映人vh和vl结构域的亚组。这是参考可在http://www.biochem.unizh.ch/antibody获得的imgt数据库进行的。化学合成与短接头gly
12-ser5(seq id no:9)融合的编码人源化vh和vl结构域的序列(dna2.0,menlo park,ca)，并且进行密码子优化以用于增加在细菌中的蛋白质表达。将构建体克隆到pet11a表达载体中，并且在c端包括his6标签以用于纯化。将载体转化到已经含有pkje7分子伴侣质粒(takara bio inc,otsu,japan)的overexpress
tm cd41(de3)感受态细胞(lucigen corporation,middleton,wi)中。转化细胞在氨苄青霉素(100μg/ml)和氯霉素(20μg/ml)的存在下生长。hru2、hru3和hru4的dna由genscript合成，并且在overexpress
tm cd41(de3)大肠杆菌细胞中表达蛋白质。
[0150]
对于ctbr1，使用rneasy mini试剂盒(qiagen,germany)根据制造商的说明从ctbr1杂交瘤细胞中分离总rna，并如上文针对iv.3所述克隆重链和轻链可变区。
[0151]
蛋白质表达和纯化
[0152]
用0.05％l-阿拉伯糖和0.5mm iptg诱导scfv的表达，在30℃下持续4小时。将细菌细胞在裂解缓冲液(50mm tris-cl、300mm nacl、0.5％triton x-100、2mm苯甲磺酰氟、不含edta的蛋白酶抑制剂(roche diagnostics,castle hill,australia))中裂解，通过his亲和色谱纯化，并且使用抗penta-his抗体通过蛋白质印迹确认其身份。在还原条件下用sds-page检查纯化的scfv，并且使用penta-his抗体(qiagen；34660)通过蛋白质印迹进行检测，
然后用与辣根过氧化物酶缀合的多克隆兔抗小鼠免疫球蛋白孵育。用westernplus-ecl增强型化学发光底物(perkin-elmer,waltham,ma,usa)将信号显影并使用imagequant las4000成像仪(ge healthcare,uppsala,sweden)检测。使用蛋白g色谱从杂交瘤细胞上清液中纯化ctbr1。通过用木瓜蛋白酶琼脂糖珠粒消化来制备ctbr1fab。
[0153]
用于流式细胞术分析的血小板结合
[0154]
以200xg离心10分钟后，从全血中获得富含血小板的血浆(prp)。在整个实验过程中，使用洗涤/悬浮缓冲液(pbs、0.5％bsa、25mm edta，ph 6.8)制备血小板。将4μl的prp与hru分子(2μm)一起孵育30分钟。将细胞用500μl缓冲液(pbs、0.5％bsa、25mm edta，ph 6.8)洗涤一次，并与抗c-myc-af-488一起孵育。洗涤后，将血小板悬浮于200μl pbs中并通过流式细胞术(cantoii,bd biosciences)进行分析。不存在hru的抗c-myc-af-488用作阴性对照。
[0155]
血小板聚集
[0156]
通过在聚集仪(chrono-log aggro/link
tm
)中以1200rpm、37℃持续15分钟混合样品来进行血小板聚集测定。反应混合物(500μl)由300μl健康供体prp、hit患者血清或纯化的总hit igg(最多至14μm，根据不同供体血小板调整)和肝素(0.5iu/ml)组成。聚集程度通过透光率的增加确定。超过20％的血小板聚集水平被视为阳性。对于凝血酶诱导的血小板聚集，在0.3u凝血酶的存在下如上所述混合样品。
[0157]
血清素释放测定
[0158]
sra是确认血小板活化性hit抗体存在的金标准[如sheridan d等人(1986)blood所述]。将来自健康供体的血小板用羟色胺草酸氢盐5-[2-14
c]-(血清素)(
14
c-5ht)(1.5μl/ml)标记，并在hit血清的存在下与肝素[0.1(低剂量)或100iu/ml(高剂量)]混合。然后将感兴趣的蛋白质添加到反应中并在室温下孵育1小时。离心后收集上清液并在闪烁计数器中测量所释放的
14
c-血清素。通过确定相对于血小板中的剩余
14
c-血清素而言上清液中的比例来计算所释放的
14
c-血清素的百分比。如果在治疗性肝素浓度(0.1iu/ml)下检测到超过20％的血清素释放，但在使用高剂量肝素(100iu/ml)时未检测到，则测试结果被定义为阳性。
[0159]
微流体装置和图像采集
[0160]
在4℃下用浓度为200g/ml的血管性血友病因子(vwf)涂布vena8fluoro
tm
生物芯片微通道过夜。用pbs洗涤后，用pbs/1％bsa封闭微通道30分钟。将使用acd抗凝的全血用dioc6(life technologies)标记并在室温下在黑暗中孵育10分钟。
[0161]
在37℃下，在不存在或存在hru1或hru4的情况下，在venaflux微流体装置(cellix ltd.dublin,ireland)中，以患者hit igg或正常igg作为对照，以20达因/cm2的流体剪切速率持续最多至460秒进行测定。流动室安装在荧光显微镜(zeiss axio observer.a1)上，并使用由venaflux软件(cellix ltd.dublin,ireland)驱动的q-imaging exi blue
tm
相机(qimaging,surry,bc,canada)实时捕获来自不同显微镜视野的荧光图像。使用image-pro premier 9.1软件(media cybernetics,inc,rockville,md,usa)分析荧光图像。通过计算血栓平均直径和表面积覆盖率来测量血栓形成。
[0162]
凝血酶时间测定
[0163]
sta-凝血酶试剂盒(diagnostica stago s.a.a.)用于通过止血分析仪确定凝血
酶时间。通过以2500xg离心10分钟，由acd抗凝的正常血液制备血浆。在不同抑制剂浓度(例如hru2和hru3)不存在和存在的情况下，分析500μl未稀释血浆。血浆的凝血酶时间通过分析仪确定。
[0164]
使用fcγriia/hpf4双转基因小鼠的hit的动物模型
[0165]
在这些实验中使用的小鼠先前已有描述(reillymp等人(2001)blood)。向动物静脉内注射(iv)纯化的hit igg或hit样moab kko。正常人igg或无关抗体用作对照。igg注射后以1u/g腹膜内注射肝素。在一些实验中，hru分子或ctbr1fab也通过iv途径注射。对于体内血小板标记，以1μg/g iv注射抗cd42c-dylight649(emfret)。在处理前以及3小时和5小时时测量血小板计数。处理后5-6小时收获肺并固定在福尔马林中。在ivis lumina spectrum ct光谱仪(perkinelmer)中扫描肺的荧光。对于组织学，通过石蜡处理肺并切片。切片用苏木精和伊红染色。其他切片用抗小鼠血小板抗体和dapi染色。
[0166]
使用fcγriia/hpf4双转基因小鼠的免疫性血小板减少症的动物模型。
[0167]
向动物腹膜内注射0.5μg/g或1μg/g的纯化的抗小鼠gpix抗体(emfret)。同种型igg(emfret)用作对照。在一些实验中，将hru1共同注射到小鼠体内。在处理前(时间0)和处理后1小时、3小时和5小时时测量血小板计数。处理后5-6小时收获肺并固定。在收获的2小时内在ivis lumina spectrum ct光谱仪中扫描肺。对于组织学，将肺包埋在石蜡块中并切片。切片用苏木精和伊红染色。在一些切片中，用抗cd42c-dylight649(体内标记)检测到富含血小板的血栓。切片用dapi复染。
[0168]
实施例2-scfv的序列和蛋白质表达
[0169]
鼠scfv以及人源化分子(hru1至hru4)和ctbr1的可变重区和可变轻区的序列在表1中作为seq id no:1-23示出。从细菌表达中获得的纯化蛋白在图1a中示出。
[0170]
表1：序列信息
[0171]
[0172]
[0173]
[0174][0175][0176]
*seq id no:10、11-13、15和22也可各自包含信号肽序列以协助分泌。在本研究中，信号肽序列是kslitpitaglllalsqplla。信号肽序列通常不存在于最终的蛋白质制备物中。
[0177]
**seq id no:2和10-15也可各自包含用于抗原结合分子的纯化的多组氨酸标签(h6)。最终的抗原结合产物可包含或可不包含多组氨酸标签。
[0178]
实施例3-hru1至hru4：血小板聚集和活化的抑制
[0179]
hru分子与人血小板相互作用的能力在图1b中示出。这些实验显示，所有scfv均表现出与人血小板的强结合。
[0180]
研究了scfv抑制血小板聚集和活化的能力。为了确定scfv是否能够在体外抑制hit抗体诱导的血小板聚集，将hru1-4添加到由人血小板、hit igg或igg样单克隆抗体kko和肝素组成的反应物中。在不存在hru分子的情况下，hit igg和kko诱导强烈的血小板聚集(图1c)。hru scfv在亚微摩尔浓度(在所有情况下均为2μm)下强烈抑制hit igg诱导的聚集。这些结果表明，这些是能够阻断由hit igg和肝素诱导的血小板聚集的功能性分子。用于测量血小板活化的血清素释放测定(sheridan d等人(1986)blood)仍然广泛用作用于检测hit抗体的功能测定。如图1d所示，在不存在hru的情况下，hit igg和低剂量肝素(0.1iu/ml)导致强烈的
14
c-血清素释放，而在高肝素浓度下释放的
14
c-血清素的水平不显著(100iu/ml)(高肝素浓度解离hit免疫复合物并在这些测定中用作对照)。然而，当添加hru时，观察到在0.1iu/ml肝素下释放的
14
c-血清素的量有效减少，表明这些分子是hit igg诱导的血小板活化的有效抑制剂。
[0181]
实施例4-hru2和hru3的抗凝血酶活性
[0182]
hru2和hru3被设计为具有双重活性：阻断fcγriia和直接抑制凝血酶(与比伐卢定或来匹卢定一起)。图2a显示hru2和hru3均以剂量依赖性方式抑制凝血酶诱导的血小板聚集。
[0183]
为了确定hru2和hru3的抗凝血活性，使用hemoclot凝血酶抑制剂测定。正常的凝血时间范围是15-24秒。浓度逐渐增加的hru2和hru3(2.7-10.8μm)导致凝血酶凝血时间显著增加(图2b)。这些结果表明hru2和hru3具有有效的抗凝血酶活性。值得注意的是，hru1(不具有抗凝血酶活性)不抑制凝血酶诱导的血小板聚集(图2b)。
[0184]
实施例5-在微流体室中重建hit条件
[0185]
循环中的血栓形成发生在血小板、血浆和血管壁之间的流动依赖接触的背景下。微流体装置允许在密切模仿体内条件的系统中对潜在的抗血栓形成剂的活性进行定量评估(zwaginga jj等人(2006)j.thromb.haemost.)。在37℃下，以20达因/cm2的剪切速率在涂布有vwf的vena8fluoro
tm
生物芯片上，使用用edta抗凝的来自未用药的正常供体的全血重建hit条件。
[0186]
实施例6-hru1至hru4抑制血栓沉积
[0187]
代表性的微流体室图像在图3a中示出。在hru1-4的存在下观察到血栓沉积的完全抑制。百分比覆盖面积图显示在hru1(图3b)和hru4(图3c)的存在下血栓沉积显著减少。此外，在所考虑的样品中，hru1与亲本moab iv.3之间没有可检测到的差异(图3b)。这表明hru1-hru4是流动条件下hit ab诱导的血栓形成的有效抑制剂。
[0188]
实施例7-使用fcγriia/hpf4双转基因小鼠的hit的动物模型中的hru活性
[0189]
hit条件的重建需要人fcγriia和人pf4的表达。使用表达两种人蛋白质的双转基因小鼠系(tg小鼠)。这些动物先前已被建立为hit的模型(reilly mp等人(2001)blood)。图4a中的图示出在注射标记的hru1后通过小鼠血小板的流式细胞术确定的荧光强度。这表明
hru1在体内与tg小鼠血小板相互作用。在这些tg小鼠中，hit igg加肝素的施用诱导严重的血小板减少症。重要的是，在用hru1、hru2、hru3或hru4(图4b至f)处理后，血小板数量的下降明显停止，表明hru可以在体内抵消hit igg的致病活性。hit的最关键方面是血栓形成，在患者中最通常表现为肺血栓栓塞。为了分析hit小鼠模型中的肺凝块，在hit诱导后5小时提取肺，将其固定并通过显微ct扫描进行评估。
[0190]
将小鼠血小板在体内用抗cd42c-dylight649抗体标记，并且当使用ivis lumina spectrum ct扫描来自这些小鼠的固定的肺时，在用hit igg处理的肺中存在明显的荧光积聚，表明存在富含血小板的血栓。用hru1、hru2、hru3或hru4处理导致血栓积聚的完全抑制(图5a-c)。hru2和hru3施用也导致血栓形成的显著抑制(图5d和e)。该图示出hru1、hru2、hru3或hru4施用后的荧光变化，表明血栓形成的减少。总之，这些数据表明hru在hit的小鼠模型中可以有效地治疗血小板减少症和血栓形成。
[0191]
实施例8-hru1在fcγriia/hpf4双转基因小鼠中中和抗血小板抗体诱导的血小板减少症和血栓形成
[0192]
抗血小板抗体存在于自身免疫性疾病中，诸如免疫性血小板减少症(itp)、药物诱导的血小板减少症(ditp)和系统性红斑狼疮(sle)。这些抗体识别丰富的血小板抗原，诸如gpibix或gpiibiiia复合物。在这些情况下血小板破坏的机制之一可涉及fcγriia受体的接合(stolla m等人(2011)blood)。
[0193]
在不存在和存在hru1的情况下，在fc riia/hpf4tg小鼠中测试抗小鼠gpix抗体γ。图6a显示该抗体在这些动物中诱导严重的血小板减少症。hru4的存在抵消抗gpix的活性并显著保护血小板免受破坏(图6a)。对用h&e染色的提取肺进行的分析表明，抗gpix抗体的施用导致肺中血栓积聚(图6b)，然而，在用hru4处理的小鼠中未检测到血栓(图6b)。在使用抗cd42c-dylight649进行体内血小板标记的肺切片中观察到相同的结果。仅在gpix处理的小鼠中检测到富含血小板的血栓(图6c)，但在施用hru4的那些小鼠中未检测到。总的来说，数据表明hru1是由抗血小板抗体诱导的血小板减少症和血栓形成的有效抑制剂。
[0194]
实施例9-ctbr1
[0195]
ctbr1是在不存在肝素的情况下与人pf4结合的单克隆抗体。ctbr1的fab部分与pf4结合并与hit igg抗体竞争(图7a和b)。因此，设想将ctbr1用作hit igg的竞争物以抑制hit免疫复合物的形成。这继而将抑制hit。图7c显示ctbr1fab防止了由hit igg诱导的血小板聚集，表明ctbr1可以隔离pf4并防止形成hit免疫复合物。在体内，ctbr1fab与次优浓度的hru3协同作用并抑制hit，如血小板减少症(图8a)和血栓形成(图8b)的抑制所显示。总之，这些数据表明ctbr1可以阻断pf4并阻碍hit igg抗体的活性。
[0196]
讨论
[0197]
hit是肝素抗凝疗法的严重不良反应，并且由靶向pf4/肝素免疫复合物的抗体引起。免疫复合物与血小板上的fcγriia的相互作用是导致hit的发病机制的关键起始事件(reilly mp等人(2001)blood)。hit的目前临床管理将受益于更有针对性的疗法。本研究表明，源自抗fcγriia moab iv.3的scfv具有用作hit介导的血小板聚集、活化、血小板减少症和血栓形成的抑制剂的潜力。还设想了使用ctbr1与hit抗体竞争结合pf4，从而防止形成hit免疫复合物。hru还完全保护小鼠免于抗gpix诱导的血小板减少症和血栓形成，并且因此这种scfv可以用于靶向诸如itp、ditp和sle的发病状况。
[0198]
通过利用柔性接头连接抗fc
γ
riia受体抗体的可变重链和轻链结构域来产生基因构建体。此外，对scfv的框架进行突变修饰以获得最佳功能性scfv(我们称为hru4)。还将hru1与比伐卢定(hru2)和来匹卢定(hru3)缀合，因为比伐卢定和来匹卢定是用于治疗hit的抗凝剂。设想了hru4与一种或多种抗凝剂分子的类似缀合。
[0199]
将这些构建体克隆到表达载体中，在大肠杆菌中表达并且从细菌裂解物中纯化hru蛋白。通过共聚焦显微镜和流式细胞术检测hru scfv与人血小板的结合。据显示，其强烈阻断由hit抗体诱导的血小板聚集和
14
c-血清素释放。此外，hru1、hru2、hru3和hru4在使用venaflux装置的流动系统中显示出对血小板血栓形成的有效抑制。
[0200]
研究发现表明，这种使用hru1或hru4阻断hit抗体/抗原复合物与血小板fc
γ
riia的结合的新治疗方法可能会改善hit患者的治疗结果，并且与来匹卢定或比伐卢定缀合的潜在scfv可得到甚至更好的结果。
[0201]
本技术要求澳大利亚临时专利申请号2019900991的优先权，其全部内容通过交叉引用并入本文。
[0202]
应当理解，虽然出于说明的目的已经在本文描述了本发明的特定实施方案，但是在不脱离如以下权利要求所限定的本发明的精神和范围的情况下可做出各种修改。