一种无毒的植物通用型高纯度基因组DNA快速提取方法和试剂盒

一种无毒的植物通用型高纯度基因组dna快速提取方法和试剂盒
技术领域
1.本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种无毒的植物通用型高纯度基因组dna快速提取方法和试剂盒。


背景技术：

2.植物基因组dna的提取是植物分子生物学研究的基础，高质量的基因组dna可直接应用于基因克隆、分子标记、酶切、构建文库、real-time pcr和southern blot等各类下游分子生物学实验，然而国内外现有的植物基因组dna提取技术均至少存在多个如表1所示的缺点：
3.表1国内外各种现有植物基因组dna提取技术的不足之处及其具体表现
4.[0005][0006]
因此，开发一种可以同时克服上述现有技术不足的植物高纯度基因组dna提取方法成为亟待解决的问题。


技术实现要素：

[0007]
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种无毒的植物通用型高纯度基因组dna快速提取方法和试剂盒，以克服上述现有技术中存在的诸多问题。本发明提供的方法提取成本低、操作简单，提取过程不使用有毒试剂和昂贵的试剂、耗材或仪器设备，可快速、高效、安全地从多种植物中提取基因组dna，提取的基因组dna完整性好、产量高、纯度高，可直接应用于基因克隆、分子标记、酶切、构建文库、real-time pcr和southern blot等各类下游分子生物学实验。
[0008]
本发明提供了一种无毒的植物通用型高纯度基因组dna快速提取方法，包括如下步骤：
[0009]
(1)将待提取植物样品研磨破碎；
[0010]
(2)加入fn-pw细胞漂洗液进行漂洗除去样品中的多糖多酚和色素等杂质，所述fn-pw细胞漂洗液由0.5％～4％(w/v)的pvp、0％～2％(w/v)的l-半胱氨酸、0.5％～4％(v/v)的triton x-100和纯水组成；
[0011]
(3)加入fn-s细胞裂解液释放基因组dna，离心取上清液，所述fn-s细胞裂解液由1％～10％(w/v)的ctab、10～300mm的tris-hcl(ph为7.5～8.5)、1～50mm的na2edta(ph为7.5～8.5)、1.4～2.0m的nacl、0％～2％(w/v)的pvp、0.5％～2％(v/v)的triton x-100和纯水组成；
[0012]
(4)向(3)所得上清液中加入异丙醇重悬沉淀，振荡，离心弃上清液；
[0013]
(5)加入70％～75％的乙醇重悬沉淀，振荡，离心弃上清液；
[0014]
(6)加入无水乙醇重悬沉淀，振荡，离心弃上清液；
[0015]
(7)将(6)所得离心沉淀物进行干燥后加入无菌超纯水或te重悬沉淀，离心取上清液即得高纯度基因组dna溶液；
[0016]
其中，步骤(2)为可选步骤，对于含杂质较少的样品，如水稻新鲜叶片、玉米新鲜叶片、小麦新鲜叶片、各类植物根尖等，可省略该步骤；对于富含多糖多酚和色素等杂质的样本，如棉花成熟叶片、水稻干枯叶片、柑橘叶片、苹果树叶片、杨树叶片等，此步骤不可省略，并且要根据样品实际情况适当增加漂洗次数，如100mg棉花成熟叶片漂洗5次以上，可有效去除多糖多酚及色素；步骤(3)中，释放基因组dna时，可根据实验目的选择是否添加rnase a，对于所获基因组dna仅用于2kb以下短片段pcr扩增模板时，无需添加rnase a，如提取拟南芥基因组dna用于t-dna插入鉴定时就可以不添加rnase a；对于所获基因组dna除了用于2kb以下短片段基因克隆，还用于酶切、构建文库、real-time pcr和southern blot等下游分子生物学实验时，则需添加rnase a。
[0017]
本发明中，所取样品的量不是固定的，可以根据实际需求取用，所取样品量小于300mg时，用2ml离心管即可完成实验，所取样品量超过300mg时，可以将2ml离心管更换为更大量程的圆底离心管进行实验。
[0018]
本发明中，步骤(1)，对待提取植物样品进行研磨破碎时，可以根据样品特点和实验条件选择不同的研磨方式进行研磨破碎，如可以将待提取植物样品研磨成粉末后取样至离心管进行后续操作，也可将待提取植物样品直接加入离心管中进行样品研磨破碎然后进行后续操作。
[0019]
本发明中，步骤(2)，加入fn-pw细胞漂洗液进行漂洗除去样品中的多糖多酚和色素等杂质时，可根据待提取植物样品所含多糖多酚和色素等杂质的情况适当调整漂洗方法，如可适当调整fn-pw细胞漂洗液的用量、漂洗方式和漂洗温度，作为优选，可采用如下方式进行漂洗：按照0.02ml/mg(以待提取植物样品的重量为基准)的用量向破碎的待提取植物样品中加入经50～75℃预热的fn-pw细胞漂洗液，上下振荡漂洗30秒，12000～14000rpm离心1min，弃上清。
[0020]
本发明中，步骤(3)，加入fn-s细胞裂解液释放基因组dna时，可根据实验要求和实验结果适当适当调整实验参数，如可适当调整fn-s细胞裂解液裂的用量、实验温度、实验时间等，作为优选，对于所获基因组dna仅用于2kb以下短片段pcr扩增模板时，释放基因组dna时，可采用如下方式释放基因组dna：按照4ul/mg(以待提取植物样品的重量为基准)的用量加入经50～75℃预热的fn-s细胞裂解液重悬沉淀，上下振荡5s，于50～75℃温浴2～5min；对于所获基因组dna除了用于2kb以下短片段基因克隆，还用于酶切、构建文库、real-time pcr和southern blot等下游分子生物学实验时，释放基因组dna时，可采用如下方式释放基因组dna：按照4ul/mg(以待提取植物样品的重量为基准)的用量加入经50～75℃预热的fn-s细胞裂解液重悬沉淀，按1:0.02(v/v，以fn-s细胞裂解液的用量为基准)的用量加入rnase a，上下振荡5s，于50～75℃温浴5～15min。
[0021]
本发明中，步骤(4)，加入异丙醇主要目的是在高盐溶液中沉淀核酸的同时去除多糖和ctab杂质，可根据待提取植物样品的样品量、以及其所含杂质的多少来选择异丙醇的用量，作为优选，异丙醇的加入量为0.6～1倍步骤(3)所得上清体积。
[0022]
本发明中，步骤(5)，加入70％～75％的乙醇重悬沉淀主要是为了沉淀核酸、去除杂质，可根据待提取植物样品的样品量、以及其所含杂质的多少来选择70％～75％的乙醇
的用量以及选择加入70％～75％的乙醇重悬沉淀的次数，作为优选，按照8～16ul/mg(以待提取植物样品的重量为基准)的用量加入70％～75％的乙醇重悬沉淀。
[0023]
本发明中，步骤(6)，加入无水乙醇重悬沉淀主要是为了沉淀核酸、去除杂质，可根据待提取植物样品的样品量、以及其所含杂质的多少来选择无乙醇的用量以及选择加入无水乙醇重悬沉淀的次数，作为优选，按照8～16ul/mg(以待提取植物样品的重量为基准)的用量加入无水乙醇重悬沉淀。
[0024]
本发明中，步骤(7)，将步骤(6)所得离心沉淀物进行干燥时可以根据实验条件确定适当的干燥方式，作为优选，可采用如下方式进行干燥：将带有沉淀物的离心管盖子打开，在65～75℃鼓风干燥箱中放置晾干1～5min。
[0025]
本发明，步骤(7)，加入无菌超纯水或te重悬沉淀时，作为优选，选用预热的无菌超纯水或te重悬沉淀，如此，可快速获得dna溶液，然后将杂质离心沉于管底，取上清液(dna溶液)保存，可有效防止dna溶液褐化或滋生霉菌。
[0026]
本发明还提供了一种无毒的植物通用型高纯度基因组dna快速提取试剂盒，所述试剂含有上述fn-pw细胞漂洗液或上述fn-s细胞裂解液或同时含有上述fn-pw细胞漂洗液和上述fn-s细胞裂解液。
[0027]
本发明的有益效果：
[0028]
(1)通用性强：本发明提供的基因组dna提取方法可以在绝大多数植物样本中通用，包括但不限于新鲜植物样本、干燥植物样本及植物标本；本发明提供的基因组dna提取方法可以在富含多糖多酚、油脂或色素等杂质的样本中通用，包括但不限于棉花成熟叶片、马铃薯块茎及木本植物叶片，其关键在于fn-pw细胞漂洗液可以在基因组dna释放之前，从源头上有效去除样本中的杂质。
[0029]
(2)应用范围广：本发明方法提取的基因组dna可应用于基因克隆、分子标记、酶切、构建文库、real-time pcr和southern blot等各类下游分子生物学实验。
[0030]
(3)提取速度快：本发明提供的基因组dna提取方法可在10～30min完成单个样本的基因组dna提取工作，其关键在于fn-s细胞裂解液中含有适量的triton x-100，其在50～75℃温浴条件下，加速ctab与蛋白质和多糖结合，让dna快速释放，且温浴过程中也无需振荡混匀，故提取速度明显提高，而传统ctab法需要在65℃条件下至少温浴30min，期间还需每隔几分钟振荡几次。
[0031]
(4)提取纯度高：本发明方法提取不同植物样本的基因组dna，其od
260
/od
280
的平均值介于1.8～2.0；本发明方法提取的基因组dna，经1％琼脂糖凝胶电泳可见清晰dna条带。
[0032]
(5)提取产量高：本发明方法从100mg植物新鲜样品提取的高纯度基因组dna产量大于15ug。
[0033]
(6)提取步骤灵活性高：本发明方法应用于含杂质较少的样品，不需要但也不限制使用fn-pw细胞漂洗液，本发明方法应用于含杂质较多的样品时，可根据样品的量及样本特点灵活选择fn-pw细胞漂洗液的漂洗次数；本发明方法可以从微量样品、少量样品或大量样品中提取基因组dna，只需按照样品量1:4(w/v)加入fn-s细胞裂解液即可；本发明方法可根据实验目的选择是否添加rnase a以及不同温浴时间，本发明方法应用于2kb以下短片段pcr扩增模板制作时，无需添加rnase a，温浴2～5min即可，本发明方法应用于酶切、构建文库、real-time pcr和southern blot等对基因组dna质量要求较高的下游分子生物学实验
时，则需添加rnase a，温浴5～15min。
[0034]
(7)提取的基因组dna长期保存不易变质和降解：本发明方法用预热的无菌超纯水或te重悬沉淀，可快速获得带有不溶杂质的dna溶液，进一步将杂质离心沉于管底，取上清液(dna溶液)保存，可有效防止杂质沉淀物造成的dna溶液褐化或滋生霉菌，防止dna降解，克服了传统提取方法dna溶解速度慢、dna溶液含有大量杂质沉淀物的缺点。
[0035]
(8)提取试剂用量少：本发明方法从50mg含杂质较少的新鲜植物样品中提取出高纯度基因组dna，仅需要200ul的fn-s细胞裂解液、4ul的rnase a、200ul异丙醇、2ml的无水乙醇以及极少量的无菌超纯水或te，有利于推广应用。
[0036]
(9)提取成本低：本发明方法不使用磁珠、吸附柱、离心柱、采样卡等相对昂贵的耗材，提取50mg新鲜植物样本，仅需要1个2ml离心管和2个1.5ml离心管，耗材成本大约是离心柱法的1/50；本发明方法不需要昂贵的化学试剂且提取试剂用量很少；本发明方法不需要昂贵的仪器设备，所用仪器设备均为分子生物学实验室常规仪器设备；本发明方法虽然不使用上述昂贵仪器、试剂及耗材，但使用磁珠、吸附柱、离心柱、采样卡等吸附或过滤手段也能达到本发明方法的提取效果，本发明方法还可在高通量基因组dna自动化提取设备中应用，这些都应属于本发明方法的保护范围。
[0037]
(10)提取过程安全无毒：本发明方法不使用强酸或强碱等强腐蚀性试剂，不使用氯仿、苯酚、巯基乙醇、异硫氰酸胍或dtt等有毒试剂，克服传统基因组dna提取方法使用有毒试剂或强腐蚀性试剂的缺点。
附图说明
[0038]
图1是本发明方法提取的水稻叶片基因组dna的1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为marker(bm2000 dna marker)，泳道2～11分别为不同水稻单株提取的基因组dna；
[0039]
图2是本发明方法提取的番茄叶片基因组dna的1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为marker(bm5000 dna marker)，泳道2～10分别为不同番茄单株提取的基因组dna；
[0040]
图3是本发明方法提取的马铃薯叶片基因组dna的1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为marker(bm2000 dna marker)，泳道2～11分别为不同马铃薯单株提取的基因组dna；
[0041]
图4是本发明方法提取的棉花叶片基因组dna的1％琼脂糖凝胶电泳图，泳道1为marker(bm5000 dna marker)，泳道2～10分别为不同棉花单株提取的基因组dna。
具体实施方式
[0042]
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。下述实施例仅用于阐明本发明，不应理解为对本发明的限制；下述实施例中的实验方法均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂均可从市面购买；下述实施例中所用的仪器设备均为分子生物学实验室常规仪器设备。在不背离本发明精神和实质的情况下，本领域技术人员对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的保护范围。
[0043]
实施例1：水稻基因组dna的提取
[0044]
(一)水稻新鲜成熟叶片基因组dna的提取方法：
[0045]
在实验前，先配制fn-s细胞裂解液：fn-s细胞裂解液由1％～10％(w/v)的ctab、10～300mm的tris-hcl(ph为7.5～8.5)、1～50mm的na2edta(ph为7.5～8.5)、1.4～2.0m的
nacl、0％～2％(w/v)的pvp、0.5％～2％(v/v)的triton x-100和纯水组成，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果，在本实施例中设置为2％(w/v)的ctab、100mm的tris-hcl(ph为8.0)、10mm的na2edta(ph为8.0)、1.4m的nacl、1％(v/v)的triton x-100和ph为7.5的纯水。具体提取步骤如下：
[0046]
(1)将50mg新鲜叶片粗略剪碎，放进带有3颗钢珠(直径4mm)的干净2ml离心管中，置于液氮中速冻5s，用组织研磨仪将叶片研磨成粉末；
[0047]
(2)加入200ul经70℃预热的fn-s细胞裂解液重悬沉淀，加入4ul的rnase a，上下振荡5s，于70℃温浴10min；
[0048]
(3)13500rpm离心1min，然后取150ul上清液转移至干净的1.5ml离心管；
[0049]
(4)加入150ul的异丙醇(常温或低温放置的异丙醇均可)，上下振荡5s，13500rpm离心30s，弃上清；
[0050]
(5)用400ul的70％的乙醇重悬沉淀，上下振荡5s，13500rpm离心30s，弃上清；
[0051]
(6)用800ul的无水乙醇重悬沉淀，上下振荡5s，13500rpm离心30s，弃上清；
[0052]
(7)用800ul的无水乙醇重悬沉淀，上下振荡5s，13500rpm离心30s，用吸头吸净上清，保留沉淀；
[0053]
(8)将上述带有沉淀物的离心管盖子打开，在70℃鼓风干燥箱中放置2min晾干；
[0054]
(9)用50ul经70℃预热的无菌超纯水重悬沉淀，13500rpm离心30s，上清即为基因组dna溶液，将上清转移至干净离心管保存。
[0055]
(二)水稻新鲜成熟叶片基因组dna的质量检测：
[0056]
用本实施例中(一)所述方法，对取自10个不同日本晴水稻单株的新鲜成熟叶片进行基因组dna快速提取，测定结果如下：
[0057][0058]
进一步，分别取5ul上述基因组dna溶液，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测结果如图1所示，10个不同水稻单株叶片的基因组dna模板均可电泳出清晰的目的条带，无拖带和杂带，重复性好，效果理想。
[0059]
实施例2：番茄基因组dna的提取
[0060]
(一)番茄新鲜叶片基因组dna的提取方法：
[0061]
在实验前，先配制fn-s细胞裂解液：fn-s细胞裂解液由1％～10％(w/v)的ctab、10～300mm的tris-hcl(ph为7.5～8.5)、1～50mm的na2edta(ph为7.5～8.5)、1.4～2.0m的nacl、0％～2％(w/v)的pvp、0.5％～2％(v/v)的triton x-100和纯水组成，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果，在本实施例中设置为3％(w/v)的ctab、150mm的tris-hcl(ph为8.0)、10mm的na2edta(ph为8.0)、1.5m的nacl、1.5％(v/v)的triton x-100和ph为7.5的纯水。具体提取步骤同实施例1。
[0062]
(二)番茄新鲜叶片基因组dna的质量检测：
[0063]
用本实施例中(一)所述方法，对取自9个不同番茄单株的新鲜叶片进行基因组dna快速提取，测定结果如下：
[0064] 单株1单株2单株3单株4单株5单株6单株7单株8单株9od
260
/od
280
1.821.851.801.761.781.831.811.791.75dna产量(ug)11.110.412.511.812.411.39.810.39.5
[0065]
进一步，分别取5ul上述基因组dna溶液，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测结果如图2所示，9个不同番茄单株叶片的基因组dna模板均可电泳出清晰的目的条带，无拖带和杂带，重复性好，效果理想。
[0066]
实施例3：马铃薯基因组dna的提取
[0067]
(一)马铃薯新鲜叶片基因组dna的提取方法：
[0068]
在实验前，先配制fn-s细胞裂解液：fn-s细胞裂解液由1％～10％(w/v)的ctab、10～300mm的tris-hcl(ph为7.5～8.5)、1～50mm的na2edta(ph为7.5～8.5)、1.4～2.0m的nacl、0％～2％(w/v)的pvp、0.5％～2％(v/v)的triton x-100和纯水组成，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果，在本实施例中设置为4％(w/v)的ctab、100mm的tris-hcl(ph为8.0)、20mm的na2edta(ph为8.0)、1.5m的nacl、1.5％(v/v)的triton x-100和ph为7.5的纯水。具体提取步骤同实施例1。
[0069]
(二)马铃薯新鲜叶片基因组dna的质量检测：
[0070]
用本实施例中(一)所述方法，对取自10个不同马铃薯单株的新鲜叶片进行基因组dna快速提取，测定结果如下：
[0071][0072]
进一步，分别取5ul上述基因组dna溶液，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测结果如图3所示，10个不同马铃薯单株叶片的基因组dna模板均可电泳出清晰的目的条带，无拖带和杂带，重复性好，效果理想。
[0073]
实施例4：棉花基因组dna的提取
[0074]
(一)棉花新鲜叶片基因组dna的提取方法：
[0075]
在实验前，先配制fn-pw细胞漂洗液和fn-s细胞裂解液：fn-pw细胞漂洗液由0.5％～4％(w/v)的pvp、0％～2％(w/v)的l-半胱氨酸、0.5％～4％(v/v)的triton x-100和纯水组成，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果，在本实施例中设置为2％(w/v)的pvp、1％(w/v)的l-半胱氨酸、1.5％(v/v)的triton x-100和ph为7.5的纯水；fn-s细胞裂解液由1％～10％(w/v)的ctab、10～300mm的tris-hcl(ph为7.5～8.5)、1～50mm的na2edta(ph为7.5～8.5)、1.4～2.0m的nacl、0％～2％(w/v)的pvp、0.5％～2％(v/v)的triton x-100和纯水组成，在上述取值范围内的任意配比组合均可达到相同或相似的效果，在本实施例中设置为2％(w/v)的ctab、100mm的tris-hcl(ph为8.0)、20mm的na2edta(ph为8.0)、1.4m的nacl、0.5％(w/v)的pvp、1％(v/v)的triton x-100和ph为7.5的纯水。具体提取步骤如下：
[0076]
(1)将50mg新鲜叶片粗略剪碎，放进带有3颗钢珠(直径4mm)的干净2ml离心管中，置于液氮中速冻5s，用组织研磨仪将叶片研磨成粉末；
[0077]
(2)取1ml经70℃预热的fn-pw细胞漂洗液加入到上述离心管中，上下振荡漂洗30
秒，12000～14000rpm离心1min，弃上清；
[0078]
(3)重复步骤(2)5次；
[0079]
(4)加入200ul经70℃预热的fn-s细胞裂解液重悬沉淀，加入4ul的rnase a，上下振荡5s，于70℃温浴10min；
[0080]
(5)13500rpm离心1min，然后取150ul上清液转移至干净的1.5ml离心管；
[0081]
(6)加入90ul的异丙醇(常温或低温放置的异丙醇均可)，上下振荡5s，13500rpm离心30s，弃上清；
[0082]
(7)用400ul的70％的乙醇重悬沉淀，上下振荡5s，13500rpm离心30s，弃上清；
[0083]
(8)用800ul的无水乙醇重悬沉淀，上下振荡5s，13500rpm离心30s，弃上清；
[0084]
(9)用800ul的无水乙醇重悬沉淀，上下振荡5s，13500rpm离心30s，用吸头吸净上清，保留沉淀；
[0085]
(10)将上述带有沉淀物的离心管盖子打开，在70℃鼓风干燥箱中放置2min晾干；
[0086]
(11)用50ul经70℃预热的无菌超纯水重悬沉淀，13500rpm离心30s，上清即为基因组dna溶液，将上清转移至干净离心管保存。
[0087]
(二)棉花新鲜叶片基因组dna的质量检测：
[0088]
用本实施例中(一)所述方法，对取自9个不同棉花单株的新鲜叶片进行基因组dna快速提取，测定结果如下：
[0089] 单株1单株2单株3单株4单株5单株6单株7单株8单株9od
260
/od
280
1.911.931.891.941.831.901.851.801.88dna产量(ug)13.814.513.210.912.615.411.412.513.9
[0090]
进一步，分别取5ul上述基因组dna溶液，使用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，检测结果如图4所示，9个不同棉花单株叶片的基因组dna模板均可电泳出清晰的目的条带，无拖带和杂带，重复性好，效果理想。
[0091]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所有的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。