一种高含量没食子酸及其制备方法

1.本发明涉及一种高含量没食子酸及其制备方法，属于中药成分的提取、分离纯化技术领域。


背景技术：

2.锥(castanopsis chinensis)又名桂林栲、栲栗和米锥等，为壳斗科锥属乔木，高达20米，胸径达0.6米，树皮纵裂，片状脱落，枝、叶均无毛。在广西、广东和云南等省区广泛分布，木材棕黄色，有时其心材色污暗，木射线甚窄，材质较轻，结构略粗，纹理直，属黄锥类。
3.目前，有关锥的化学成分、药理活性及产品开发等研究还未见相关报道，前期通过定性预实验检测发现锥的树叶含有多酚类成分，具有较高的开发成抗氧化功能的保健、美容产品的前景。没食子酸(gallic acid,简称ga)，化学名为3,4,5-三羟基苯甲酸，分子式为c7h6o5，又称为倍酸、五倍子酸，是一种有机酸，常见于五倍子、漆树、茶等植物中，广泛应用于化工、医药、食品和电子工业等领域。
4.现有技术中，没食子酸的制备方法主要是用有机溶剂或水溶液加酸提取，分离纯化采用大孔吸附树脂纯化与阴阳离子树脂脱色或活性碳脱色等结合，存在的缺陷是：产率和纯度不高。此外，现有技术中尚未有有关锥中没食子酸提取纯化工艺或利用酶水解后提取纯化工艺的报道，更未有利用凝胶柱层析纯化没食子酸时采用高纯度乙醇系统洗脱系统进行分离纯化的报道。
5.鉴于此，有必要提供一种从锥中制备高含量没食子酸的方法，为没食子酸提供新的来源及弥补现有技术的不足。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一，是提供一种高含量没食子酸的制备方法。
7.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种高含量没食子酸的制备方法，包括如下步骤：
8.步骤1：制备没食子酸提取液
9.取锥叶粉末，加入极性溶剂，进行超声提取，得到没食子酸提取液；
10.步骤2：制备富含没食子酸的提取物
11.将步骤1得到的没食子酸提取液，进行酶解，再浓缩后，得到富含没食子酸的提取物；
12.步骤3：制备高含量没食子酸
13.将步骤2得到的富含没食子酸的提取物，经乙醇萃取，得到萃取液；将萃取液过凝胶柱层析，进行梯度洗脱，收集含没食子酸组份，浓缩至有晶体析出时，降温结晶，抽滤收集白色结晶，干燥，即得到高含量没食子酸。
14.本发明的高含量没食子酸的制备方法的原理是：
15.本发明的步骤1中，将锥叶粉末中的没食子酸及含没食子酸基团化合物提取出来。
16.本发明的步骤2中，将含没食子酸基团化合物通过酶解生成没食子酸及母核。
17.本发明的步骤3中，利用分子筛原理，在乙醇溶剂体系中，通过柱层析分离出来，实现与杂质的分离及没食子酸的富集。
18.综上，采用本发明的制备方法，得到的没食子酸的含量高(≥95％)，比现有技术的没食子酸的含量提高了4％，且收率达到90％以上。
19.本发明的高含量没食子酸的制备方法的有益效果是：
20.1、本发明首次以锥叶为原料，经提取、酶水解和柱层析等简便工艺，得到高含量没食子酸，为没食子酸的制备提供了新的供应原料，也为锥植物资源开辟了新的利用途径。
21.2、采用本发明的制备方法，得到的没食子酸的含量高(≥95％)，比现有技术的没食子酸的含量提高了4％，且收率达到90％以上。
22.3、本发明的制备方法简单，操作容易，成本低廉，市场前景广阔，适合规模化推广应用。
23.在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
24.进一步，步骤1所述锥叶粉末，是新鲜锥叶经干燥、粉碎、过40-60目筛所得。
25.采用上述进一步的有益效果是：适当的粉碎度有利于没食子酸及含没食子酸基团化合物的提取。
26.进一步，步骤1中，所述极性溶剂为水、质量百分数为10％的乙醇水溶液和质量百分数为10％的甲醇水溶液中的任意一种；所述锥叶粉末和所述极性溶剂的质量比为1:(10-30)。
27.采用上述进一步的有益效果是：上述均为极性溶剂，可以将锥叶中的没食子酸及含有没食子酸基团的化合物提取出来，同时可减小有机溶剂的使用。
28.进一步，步骤1中，所述超声提取的频率为30khz-40khz，16℃-30℃室温，次数为2-3次，每次30min-45min。
29.采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，有利于将锥叶中的没食子酸及含有没食子酸基团的化合物提取出来。
30.进一步，步骤2中，所述酶解是在步骤1得到的没食子酸提取液中，加入锥叶原料重量0.20
‰‑
1.0
‰
的单宁酶，酶解60min-90min。
31.采用上述进一步的有益效果是：采用上述参数，可以将步骤1得到的没食子酸提取液进行有效酶解。单宁酶可以将含没食子酸基团化合物中的没食子酸基团水解生成没食子酸，可以有效增加没食子酸提取液中没食子酸的量。
32.进一步，步骤2中，所述浓缩是指在温度为60℃-70℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa进行真空浓缩。
33.采用上述进一步的有益效果是：浓缩后的提取物颜色不至于过深而影响最终产品的颜色。
34.进一步，步骤3中，所述乙醇萃取具体是指：在步骤2得到的富含没食子酸的提取物中，加入其质量的1-2倍的质量百分数为95％的乙醇，萃取2-3次，合并萃取液。
35.采用上述进一步的有益效果是：充分溶出没食子酸及去除大极性物质，同时萃取液可不经过浓缩，直接用作为下一步的柱层溶液。
36.进一步，步骤3中，所述凝胶柱层析采用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱sephadex lh-20，规格为6cm
×
80cm，填料粒径为27μm-163μm。
37.采用上述进一步的有益效果是：没食子酸分子量小，采用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱sephadex lh-20，在分离时最先流出与别的物质分离及没食子酸的富集效果佳，并且易于规模化生产。
38.上述羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱sephadex lh-20购自美国ge公司。
39.进一步，步骤3中，所述梯度洗脱具体为：采用3-5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液作为洗脱剂进行等梯度洗脱，最后用3倍柱体积的100％甲醇进行清洗，每0.1l为一个流份，洗脱速度为2ml/min。
40.采用上述进一步的有益效果是：等梯度洗脱保证分子量小的没食子酸最先流出而获得有效富集，可以提高目标化合物分离效率，同时除去杂质。
41.进一步，步骤3中，所述降温结晶是指在16℃-30℃室温静置12h。
42.采用上述进一步的有益效果是：在此温度范围结晶速度合适、结晶得率高、产品纯度较高。
43.进一步，步骤3中，所述干燥是指在60℃-70℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa，真空干燥至失重≤1％。
44.采用上述进一步的有益效果是：在保证产品干燥度的同时，产品颜色浅。
45.进一步，步骤3中，所述高含量没食子酸中，没食子酸的质量百分含量≥95％。
46.采用上述进一步的有益效果是：现有技术中，没食子酸的质量百分含量为≤91％。而采用本发明的方法，没食子酸的质量百分含量为≥95％。因此，本发明可以显著提高没食子酸的含量。
47.本发明的目的之二，是提供一种高含量没食子酸。
48.本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种由上述制备方法得到的高含量没食子酸。
49.本发明的高含量没食子酸的有益效果是：
50.本发明的高含量没食子酸由上述方法制备而成，制备方法简单，制备的没食子酸含量高，适合工业化生产。
附图说明
51.图1为本发明实施例1制备得到的高含量没食子酸的1h nmr(500mhz,cd3od)谱；
52.图2为本发明实施例1制备得到的高含量没食子酸的
13
c nmr(125mhz,cd3od)谱。
具体实施方式
53.以下结合附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
54.实施例1
55.本实施例的高含量没食子酸的制备方法，包括如下步骤：
56.步骤1：制备没食子酸提取液
57.新鲜锥叶经干燥、粉碎、过40-60目筛，得到锥叶粉末。取0.5kg锥叶粉末，加入质量
百分数为10％的乙醇水溶液，所述锥叶粉末和所述极性溶剂的质量比为1:30,进行超声提取，所述超声提取的频率为30khz-40khz，16℃-30℃室温，次数为2-3次，每次30min-45min,得到没食子酸提取液。
58.步骤2：制备富含没食子酸的提取物
59.在步骤1得到的没食子酸提取液中，加入锥叶原料重量1.0
‰
的单宁酶，酶解60min，再在温度为60℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa进行真空浓缩后，得到富含没食子酸的提取物。
60.步骤3：制备高含量没食子酸
61.在步骤2得到的富含没食子酸的提取物中，加入其质量的1-2倍的质量百分数为95％的乙醇，萃取2-3次，合并萃取液；将萃取液过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱sephadex lh-20，规格为6cm
×
80cm，填料粒径为27μm-163μm，采用3-5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液作为洗脱剂进行等梯度洗脱，最后用3倍柱体积的100％甲醇进行清洗，每0.1l为一个流份，洗脱速度为2ml/min，收集含没食子酸组份，浓缩至有晶体析出时，16℃室温静置12h进行降温结晶，抽滤收集白色结晶，在60℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa，真空干燥至失重≤1％，即得到21.5g高含量没食子酸。
62.结构鉴定：
63.对所得结晶体进行ms、1h-nmr和
13
c-nmr等谱学数据鉴定，如图1和图2所示，并将结果与文献报道值进行对比。
64.lcit-tof-ms：m/z 169.0228(m-h)，计算值c7h5o5,分子量169.0215。
[0065]1h-nmr(500mhz,cd3od)δ:7.09(2h,s,h-2,6)。
[0066]
13
c-nmr(125mhz,cd3od)δ:121.9(c-1),110.3(2c,c-2,6),146.3(2c,c-3,5),139.6(c-4),170.4(c-7)。
[0067]
上述ms、1h-nmr和
13
c-nmr数据与文献报道基本一致，故鉴定为没食子酸，结构如下：
[0068][0069]
纯度检查：采用hplc分析法，色谱柱：cosmosil 5c18 ar ii，规格为4.6mm
×
250mm，填料粒径为5μm；柱温：35℃；流动相以乙腈为流动相a，50mm的h3po4溶液为流动相b，0～39min，流动相a和流动相b的体积比为(4-30):(96-70)；39～54min,流动相a和流动相b的体积比为75:25；流速：0.8ml/min；检测波长：272nm。
[0070]
检测本实施例所得没食子酸的纯度，结果显示所得没食子酸含量为98.8％。
[0071]
实施例2
[0072]
本实施例的高含量没食子酸的制备方法，包括如下步骤：
[0073]
步骤1：制备没食子酸提取液
[0074]
新鲜锥叶经干燥、粉碎、过40-60目筛，得到锥叶粉末。取0.5kg锥叶粉末，加入水，所述锥叶粉末和所述水的质量比为1:10,进行超声提取，所述超声提取的频率为30khz，30℃室温，次数为2次，每次30min-45min,得到没食子酸提取液。
[0075]
步骤2：制备富含没食子酸的提取物
[0076]
在步骤1得到的没食子酸提取液中，加入锥叶原料重量0.20
‰
的单宁酶，酶解60min，再在温度为60℃-70℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa进行真空浓缩后，得到富含没食子酸的提取物。
[0077]
步骤3：制备高含量没食子酸
[0078]
在步骤2得到的富含没食子酸的提取物中，加入其质量的1-2倍的质量百分数为95％的乙醇，萃取2-3次，合并萃取液；将萃取液过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱sephadex lh-20，规格为6cm
×
80cm，填料粒径为27μm-163μm，采用3-5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液作为洗脱剂进行等梯度洗脱，最后用3倍柱体积的100％甲醇进行清洗，每0.1l为一个流份，洗脱速度为2ml/min，收集含没食子酸组份，浓缩至有晶体析出时，16℃室温静置6h进行降温结晶，抽滤收集白色结晶，在70℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa,真空干燥至失重≤1％，即得到16.7g高含量没食子酸。
[0079]
结构鉴定同实施例1。
[0080]
检测本实施例所得没食子酸的纯度，结果显示所得没食子酸含量为97.6％。
[0081]
实施例3
[0082]
本实施例的高含量没食子酸的制备方法，包括如下步骤：
[0083]
步骤1：制备没食子酸提取液
[0084]
新鲜锥叶经干燥、粉碎、过40-60目筛，得到锥叶粉末。取0.5kg锥叶粉末，加入质量百分数为10％的乙醇水溶液，所述锥叶粉末和所述乙醇水溶液的质量比为1:20,进行超声提取，所述超声提取的频率为30khz，30℃室温，次数为2次，每次30min-45min,得到没食子酸提取液。
[0085]
步骤2：制备富含没食子酸的提取物
[0086]
在步骤1得到的没食子酸提取液中，加入锥叶原料重量0.5
‰
的单宁酶，酶解75min，再在温度为60℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa进行真空浓缩后，得到富含没食子酸的提取物。
[0087]
步骤3：制备高含量没食子酸
[0088]
在步骤2得到的富含没食子酸的提取物中，加入其质量的1倍的质量百分数为95％的乙醇，萃取2次，合并萃取液；将萃取液过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱sephadex lh-20，规格为6cm
×
80cm，填料粒径为27μm-163μm，采用3倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液作为洗脱剂进行等梯度洗脱，最后用3倍柱体积的100％甲醇进行清洗，每0.1l为一个流份，洗脱速度为2ml/min，收集含没食子酸组份，浓缩至有晶体析出时，16℃-30℃室温静置12h进行降温结晶，抽滤收集白色结晶，在68℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa，真空干燥至失重≤1％，即得到18.2g高含量没食子酸。
[0089]
结构鉴定同实施例1。
[0090]
检测本实施例所得没食子酸的纯度，结果显示所得没食子酸含量为98.8％。
[0091]
实施例4
[0092]
本实施例的高含量没食子酸的制备方法，包括如下步骤：
[0093]
步骤1：制备没食子酸提取液
[0094]
新鲜锥叶经干燥、粉碎、过40-60目筛，得到锥叶粉末。取0.5kg锥叶粉末，加入质量
百分数为10％的乙醇水溶液，所述锥叶粉末和所述极性溶剂的质量比为1:30,进行超声提取，所述超声提取的频率为30khz-40khz，28℃室温，次数为3次，每次30min-45min,得到没食子酸提取液。
[0095]
步骤2：制备富含没食子酸的提取物
[0096]
在步骤1得到的没食子酸提取液中，加入锥叶原料重量1.0
‰
的单宁酶，酶解90min，再在温度为68℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa进行真空浓缩后，得到富含没食子酸的提取物。
[0097]
步骤3：制备高含量没食子酸
[0098]
在步骤2得到的富含没食子酸的提取物中，加入其质量的2倍的质量百分数为95％的乙醇，萃取3次，合并萃取液；将萃取液过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱sephadex lh-20，规格为6cm
×
80cm，填料粒径为27μm-163μm，采用5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液作为洗脱剂进行等梯度洗脱，最后用3倍柱体积的100％甲醇进行清洗，每0.1l为一个流份，洗脱速度为2ml/min，收集含没食子酸组份，浓缩至有晶体析出时，16℃-30℃室温静置12h进行降温结晶，抽滤收集白色结晶，在62℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa，真空干燥至失重≤1％，即得到12.5g高含量没食子酸。
[0099]
结构鉴定同实施例1。
[0100]
检测本实施例所得没食子酸的纯度，结果显示所得没食子酸含量为86.4％。
[0101]
实施例5
[0102]
本实施例的高含量没食子酸的制备方法，包括如下步骤：
[0103]
步骤1：制备没食子酸提取液
[0104]
新鲜锥叶经干燥、粉碎、过40-60目筛，得到锥叶粉末。取0.5kg锥叶粉末，加入质量百分数为10％的乙醇水溶液，所述锥叶粉末和所述极性溶剂的质量比为1:30,进行超声提取，所述超声提取的频率为30khz-40khz，16℃室温，次数为3次，每次45min,得到没食子酸提取液。
[0105]
步骤2：制备富含没食子酸的提取物
[0106]
在步骤1得到的没食子酸提取液中，加入锥叶原料重量1.0
‰
的单宁酶，酶解90min，再在温度为65℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa进行真空浓缩后，得到富含没食子酸的提取物。
[0107]
步骤3：制备高含量没食子酸
[0108]
在步骤2得到的富含没食子酸的提取物中，加入其质量的1-2倍的质量百分数为95％的乙醇，萃取2-3次，合并萃取液；将萃取液过羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱sephadex lh-20，规格为6cm
×
80cm，填料粒径为27μm-163μm，采用3-5倍柱体积的体积浓度为95％乙醇水溶液作为洗脱剂进行等梯度洗脱，最后用3倍柱体积的100％甲醇进行清洗，每0.1l为一个流份，洗脱速度为2ml/min，收集含没食子酸组份，浓缩至有晶体析出时，22℃室温静置12h进行降温结晶，抽滤收集白色结晶，在67℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa,真空干燥至失重≤1％，即得到12.7g高含量没食子酸。
[0109]
结构鉴定同实施例1。
[0110]
检测本实施例所得没食子酸的纯度，结果显示所得没食子酸含量为83.5％。
[0111]
对比例1
[0112]
本对比例跟实施例1不同的是，步骤2中未添加单宁酶，具体而言，包括如下步骤：
[0113]
步骤1：跟实施例1相同。
[0114]
步骤2：制备富含没食子酸的提取物
[0115]
将步骤1得到的没食子酸提液在温度为60℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa进行真空浓缩后，得到富含没食子酸的提取物。
[0116]
步骤3：同实施例1，即得到6.2g没食子酸。
[0117]
结构鉴定同实施例1。
[0118]
检测本实施例所得没食子酸的纯度，结果显示所得没食子酸含量为96.9％。本对比例得到的没食子酸的产量远远小于实施例1，纯度也小于实施例1。
[0119]
对比例2
[0120]
本对比例跟实施例1不同的是，步骤3不采用羟丙基葡聚糖凝胶色谱柱，而是采用聚苯乙烯型大孔吸附树脂(d101)。具体而言，包括如下步骤：
[0121]
步骤1：跟实施例1相同。
[0122]
步骤2：跟实施例1相同。
[0123]
步骤3：制备没食子酸
[0124]
在步骤2得到的富含没食子酸的提取物中，加入其质量的1-2倍的质量百分数为95％的乙醇，萃取2-3次，合并萃取液；将萃取液浓缩后，经聚苯乙烯型大孔吸附树脂(d101)吸附，先用3倍柱体积去离子水，然后用4倍柱体积的乙醇和水按体积比为30:70的混合液进行洗脱，每0.1l为一个流份，洗脱速度为2ml/min，收集含没食子酸组份，浓缩至有晶体析出时，加入100g活性碳进行脱色2h，过滤后浓缩至有晶体析出，16℃室温静置12h进行降温结晶，抽滤收集白色结晶，在60℃，真空度为-0.04mpa至-0.06mpa，真空干燥至失重≤1％，即得到20.1g没食子酸。
[0125]
结构鉴定同实施例1。
[0126]
检测本实施例所得没食子酸的纯度，结果显示所得没食子酸含量为90.5％。本对比例得到的没食子酸的纯度远远小于实施例1，产量也小于实施例1。
[0127]
由实施例1-5和对比例1-2可知，采用本发明的制备方法，得到的没食子酸的含量高(≥95％)，比现有技术的没食子酸的含量提高了4％，且收率达到90％以上。
[0128]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。