一种治疗骨伤疾病的外敷药膏及其制备方法与流程

1.本发明属于中药领域，具体涉及一种治疗骨伤疾病的外敷药膏及其制备方法。


背景技术：

2.在传统中医里，中医骨伤科学是研究防治人体皮肉、筋骨、气血、脏腑经络损伤与疾患的一门科学。在古代属“折疡”、“金镞”等范畴。历史上本科有“金疡”、“接骨”、“正骨”、“伤科”等不同称谓。骨伤是一个比较宽泛的概念，包括骨折、脱位、伤筋等疾病，还包括骨质增生、肩周炎、颈椎病、腰椎间盘突出、所有类型关节炎等疾病。
3.骨关节炎(osteoarthritis，oa)是中老年人的常见病、多发病，是一种累及多个关节的关节病，其特点是关节软骨破坏、细胞外基质减少、软骨下骨的改变和滑膜炎性改变。在正常软骨中，软骨基质的合成和降解处于稳定状态，而oa 患者的代谢平衡被打破，导致基质合成能力下降，软骨细胞分解代谢能力增强。软骨细胞是关节软骨表面唯一分泌并维持软骨基质合成的细胞成分。基质金属蛋白酶是一组作用于软骨细胞并导致细胞外基质降解和骨吸收的蛋白水解酶。软骨分解与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，mmp)的释放和分泌密切相关。软骨细胞凋亡是oa病变中主要的特征，如染色质凝结、核碎裂、细胞收缩、凋亡小体等。因此，软骨细胞凋亡被认为是关节软骨退行性变的病理因素之一，是骨性关节炎发病机制中的重要环节。目前，非甾体抗炎药被用于治疗oa，但这些传统药物有意外的不良反应，可能引起胃肠道并发症，甚至胃肠道出血和穿孔。因此，临床迫切需要一种不良反应小、抗炎作用强的新药。
4.目前，大量研究表明，细胞因子在oa的发生发展中起着重要作用。在众多炎症因子中，对il-lβ和oa的研究最为深入。oa软骨细胞发生异常凋亡，相关实验证实il-lβ在调节软骨细胞凋亡中起重要作用。il-lβ改变正常的细胞结构，抑制ⅱ型胶原在软骨细胞中的表达，并显著影响关节软骨细胞的基质合成。异常的基质合成进一步恶化了软骨细胞的微环境，软骨细胞不能从基质中获取足够的营养，导致功能障碍和缺陷，形成基质和软骨细胞之间的恶性循环，导致关节软骨的变性。抑制il-1β表达可显著降低oa动物模型的病理特征。同时，有研究表明，il-1β基因敲除小鼠的oa病理征象比未敲除il-lβ基因的小鼠轻。il-lβ在oa中的主要发病机制的研究确保了il-lβ处理的软骨细胞与oa软骨细胞具有很高的相似性。
5.骨关节炎的治疗包括药物治疗和手术治疗。治疗药物可分为非甾体类药物，如布洛芬、阿司匹林和软骨保护剂，如葡萄糖胶。然而，这些药物引起明显的胃肠道不良反应，损害软骨细胞，从而限制了长期应用。因此，找有效成分明确、质量可控、安全高效的中药有效成分具有重要的实用价值。黄芩苷是从黄芩中分离得到的活性化合物，己报道具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗纤维化、保护神经心肌细胞等活性。近年来研究发现黄芩苷对低氧性肺动脉高压大鼠模型有保护作用，其机制是降低分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases，mapk) 和mmp-9的表达。然而，黄芩苷在oa治疗中的具体作用和可能机制尚未见报道。
6.对骨伤疾病，西医的治疗方法一般是口服和外用药物或辅以理疗、按摩等，其效果也只是控制症状发展，而难以根治，而且口服和外用西药也有一定的毒副作用。所以研制中药外敷药膏非常必要。而现有外敷中药存在疗效缓慢，制备困难，副作用大的缺陷。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供一种治疗骨伤疾病的外敷药膏及其制备方法，从配方及制备工艺等方面对传统骨伤用药膏进行了改良，疗效显著。
8.本发明是通过以下技术方案实现的：
9.一种治疗骨伤疾病的外敷药膏，由以下以重量计的原料药物制成：川乌1～3 g、草乌1～3g、海桐皮2～5g、透骨草1～3g、威灵仙1～3g、制天南星2～5g、生大黄2～5g、徐长卿2～5g、怀牛膝1～3g、黄芩6～8g；
10.所述黄芩中的黄芩苷通过激活自噬依赖的mtor信号通路，促进il-1β处理的软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡和炎症反应。
11.优选地，由以下以重量计的原料药物制成：川乌2g、草乌2g、海桐皮3g、透骨草2g、威灵仙1g、制天南星3g、生大黄3g、徐长卿2g、怀牛膝2g、黄芩6g。
12.优选地，由以下以重量计的原料药物制成：川乌3g、草乌3g、海桐皮5g、透骨草2g、威灵仙2g、制天南星3g、生大黄4g、徐长卿5g、怀牛膝3g、黄芩8g。
13.优选地，由以下以重量计的原料药物制成：川乌1g、草乌1g、海桐皮4g、透骨草1g、威灵仙1g、制天南星2g、生大黄3g、徐长卿2g、怀牛膝1g、黄芩6g。
14.优选地，所述骨伤疾病为骨关节炎。
15.一种治疗骨伤疾病的外敷药膏的制备方法：按配方称取川乌、草乌、海桐皮、透骨草、威灵仙、制天南星、生大黄、徐长卿、怀牛膝、黄芩，制成粉末，混合后，加入香油和蜂蜜进行搅拌，形成粘稠的药膏制品，即制得所述治疗骨伤疾病的外敷药膏。
16.本发明所选药材及药理如下：
17.川乌：
18.中医机理：祛风除湿，通络止痛，用于风寒湿痹、关节疼痛，心腹冷痛、跌打损伤、麻醉止痛，生品内服宜慎宜外用，孕妇禁用。制川乌孕妇慎用，不能与半夏、川贝母、浙贝母、瓜蒌、天花粉、白及、白蔹同用。
19.西医药理：抗炎镇痛；降血糖；抗癌；强心；局部麻醉等。
20.草乌：
21.中医机理：祛风除湿，温经止痛，生品内服宜慎宜外用，孕妇禁用。制草乌孕妇慎用，不能与半夏、川贝母、浙贝母、瓜蒌、天花粉、白及、白蔹同用，但宜炮制后用。
22.西医药理：有抗炎镇痛作用；能增强肾上腺素对心肌的作用，对抗氯化钙所致t波倒置，对抗垂体后叶素所致初期的s-t段上升和继之发生的s-t段下降；还有增强毒毛花苷g对心肌的毒性、抗组胺、局部麻醉等作用。
23.海桐皮：
24.中医机理：苦辛平，祛风湿，通络止痛，杀虫止痒，用于风寒湿痹、跌打损伤。
25.西医药理：具有镇痛、镇静作用；抗菌；还有拮抗乙酰胆碱所致肠管收缩作用；1:3水浸剂试管内对多种皮肤真菌有不同程度的抑制作用。
26.透骨草：
27.中医机理：祛风湿、活血，取药液用纱布浸泡患者，外敷患处，对凤仙草过敏者禁用，服用其他药物告知医生孕妇禁用，哺乳期女性、儿童及老年弱咨询医生，生冷油腻及茶类同食可能会降低药效。
28.西医药理：透骨草在镇痛、抗炎、抗菌、抗肿瘤方面有广泛的药理学作用。
29.威灵仙：
30.中医机理：祛风湿、通络止痛、消骨鲠、消痰逐饮，用于风湿痹症、骨鲠咽喉、跌打伤痛、头痛、牙痛、胃脘痛、噎膈、痞积、痰饮积聚，外用适量，消骨鲠可用30～50克，煎服，气血虚弱者慎用。
31.西医药理：对平滑肌有增强节律或松弛作用，具有镇痛、利胆、引产、抗微生物、抗利尿、降血压等作用。
32.制天南星：
33.中医机理：燥湿化痰、祛风解痉，外用散结消肿，用于湿痰寒痰顽痰证，阴虚燥痰及孕妇忌用。
34.西医药理：果实含类似毒蕈碱样物质。有抗肿瘤作用，疗效较肯定，可望成为抗癌新药物，也可成为抗癫痫的辅助药。另有祛痰，镇静，抗惊厥，抗心律失常，抗氧化等作用。
35.生大黄：
36.中医机理：清热泻火、凉血解毒、通脏腑、降湿浊、止血、逐瘀通经，瘀血跌打损伤阻证，不宜妄用，善活血祛瘀，妇女怀孕、月经期、哺乳期应忌用，脾胃虚弱者慎用。
37.西医药理：泻下成分为结合性蒽醌苷类，抑菌成分为游离性蒽醌。大黄不含土大黄苷，可作为鉴别正、伪品的依据之一。动物实验表明，提取物有泻下、抑菌、止血、促进胆汁分泌、降脂、降压和抗肿瘤作用，对消化系统有导泻、利胆、保肝、抗胃和十二指肠溃疡、兴奋肠管平滑肌的作用。
38.徐长卿：
39.中医机理：祛风、化湿，止痛止痒，抗炎抗病毒、抗菌，调节免疫，调节心血管，可煎汁内服，不宜久煎，可研末服用，或入丸散剂，谨遵医嘱，不可自行增加减少量，过敏者禁用，体弱者慎用，服用其他药物请告知医生，孕妇谨慎使用，哺乳期女性请告知医生，生冷油腻食物及茶类会降低药效。
40.西医药理：具有镇静、镇痛、解热作用；可降压、抗心肌缺血、抗心律失常；降低血脂、抗动脉粥样硬化；抑制血小板聚集及抗血栓形成；抗炎和抗变态；使回肠张力下降、抑制胃肠蠕动；对肝微粒体代谢和子宫收缩有抑制作用；抗早孕作用。徐长卿提取液(除去丹皮酚主成分)、丹皮酚对小鼠热板法(扭体反应) 证明有镇痛作用，给小鼠腹腔注射有镇静作用；煎剂有一定抑菌作用；丹皮酚具有抗炎及抗变态反应；徐长卿或丹皮酚具调血脂及抗动脉粥样硬化作用。毒性：徐长卿提取液腹腔给药，小鼠ldso为(32.93
±
1.03)克/千克；丹皮酚ldso为381 克/千克。
41.怀牛膝：
42.中医机理：补肝肾、强筋骨、跌打伤痛、腰膝酸痛，宜酒炙、孕妇慎用。
43.西医药理：现代药理作用证实，有抗生育作用，对子宫平滑肌有较强的兴奋作用。提取物有抗炎镇痛作用和降血糖、降血脂等作用。对免疫功能正常或低下动物均有免疫增
强作用，对细胞免疫和体液免疫均能增强。此外，还证实有延缓衰老和抗肿瘤的作用。对心脏有一定抑制作用，可扩张血管、降压，具有抗溃疡、抗炎镇痛、利胆、兴奋子宫、抗生育、抗凝血、抗瘀、降血糖、降脂、蛋白同化、增强免疫力、延缓衰老、利尿等作用。
44.黄芩：
45.中医机理：以根入药，味苦、性寒，有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎等功效。主治温热病、上呼吸道感染、肺热咳嗽、湿热黄胆、肺炎、痢疾、咳血、目赤、胎动不安、高血压、痈肿疖疮等症。
46.西医药理：黄芩中可分离得到活性化合物黄芩苷，己报道具有抗炎、抗病毒、抗菌、抗纤维化、保护神经心肌细胞等活性。
47.本发明的有益效果如下：
48.(1)本方以通络止痛为主，祛风湿辅助，能够起到良好的祛风湿通络止痛的作用，使炎消而诸证皆退，络通而骨病除。其优势是疗效显著，见效快，副作用低，促进骨伤病的快速康复。
49.(2)本发明证实了黄芩苷通过激活自噬依赖的mtor信号通路，促进il-1β处理的软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡和炎症反应，从而对oa具有潜在的治疗作用，因此将黄芩加入药方，效果良好。
附图说明
50.图1为实施例4中黄芩苷对il-1β处理的c28/i12细胞增殖的影响：a为 cck-8检测，b为edu检测，c为western blot检测；
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表示与对照组比较
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表示与il-1β组比较
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51.图2为实施例4中黄芩苷对il-1β诱导的c28/i12细胞凋亡及炎症反应的影响：a为tunel染色，b为流式细胞术检测，c为western blot检测，d为elisa 检测；
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52.图3为实施例4中黄芩苷对il-1β诱导的c28/i12细胞自噬的影响：a为 mdc染色法，b为qrt-pcr方法，c为western blot检测，d为western blot检测；
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53.图4为实施例4中黄芩苷通过自噬依赖性激活mtor信号通路改善il-1β诱导的c28/i12细胞凋亡：a为cck-8检测，b为tunel染色，c为elisa检测，d为western blot检测；
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具体实施方式
54.下面结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。
55.实施例1
56.一种治疗骨伤疾病的外敷药膏，由以下以重量计的原料药物制成：川乌2g、草乌2g、海桐皮3g、透骨草2g、威灵仙1g、制天南星3g、生大黄3g、徐长卿2g、怀牛膝2g、黄芩6g。
57.上述治疗骨伤疾病的外敷药膏的制备方法，具体步骤如下：
58.按配方称取川乌、草乌、海桐皮、透骨草、威灵仙、制天南星、生大黄、徐长卿、怀牛膝、黄芩，制成粉末，混合后，加入香油和蜂蜜进行搅拌，形成粘稠的药膏制品；即制得所述
治疗骨伤疾病的外敷药膏。
59.实施例2
60.一种治疗骨伤疾病的外敷药膏，由以下以重量计的原料药物制成：川乌3g、草乌3g、海桐皮5g、透骨草2g、威灵仙2g、制天南星3g、生大黄4g、徐长卿5g、怀牛膝3g、黄芩8g。
61.上述治疗骨伤疾病的外敷药膏的制备方法，具体步骤如下：
62.按配方称取川乌、草乌、海桐皮、透骨草、威灵仙、制天南星、生大黄、徐长卿、怀牛膝、黄芩，制成粉末，混合后，加入香油和蜂蜜进行搅拌，形成粘稠的药膏制品；即制得所述治疗骨伤疾病的外敷药膏。
63.实施例3
64.一种治疗骨伤疾病的外敷药膏，由以下以重量计的原料药物制成：川乌1g、草乌1g、海桐皮4g、透骨草1g、威灵仙1g、制天南星2g、生大黄3g、徐长卿2g、怀牛膝1g、黄芩6g。
65.上述治疗骨伤疾病的外敷药膏的制备方法，具体步骤如下：
66.按配方称取川乌、草乌、海桐皮、透骨草、威灵仙、制天南星、生大黄、徐长卿、怀牛膝、黄芩，制成粉末，混合后，加入香油和蜂蜜进行搅拌，形成粘稠的药膏制品；即制得所述治疗骨伤疾病的外敷药膏。
67.测试例1
68.治疗病历均为骨伤疾病，包括骨折、脱位、伤筋等疾病，还包括骨质增生、肩周炎、颈椎病、腰椎间盘突出、所有类型关节炎等疾病。
69.(1)治疗方案
70.将实施例1制得的外敷药膏摊铺在医用透气棉纸上，敷在患处治疗(破损和皮炎处禁用)，敷药后及时观察过敏症状，确保无溃疡。分5次敷用(即每次用药膏量相当于含生药15～20g)，每1天换一次，5次后统计疗效。
71.(2)疗效评定标准
72.治愈：症状消失，疼痛缓解，活动功能恢复。
73.有效：症状有改善或明显改善，活动功能改善。
74.无效：症状无改善，甚至有加重之趋势。
75.(3)疗效统计
76.经158例临床治疗观察，按上述给出的治疗方案进行治疗，用药5次后统计疗效，统计处理结果如下：
77.治愈143人，占90.5％，有效15人，占9.5％，无效0人，总有效率100％。 158例患者均取得了不同程度的康复效果，其中治愈率在90％以上，疗效显著，消炎镇痛。
78.(4)典型病例
79.病例1
80.储某，女，53岁，身高153厘米，体重140斤。现因长期劳作，左膝关节近6个月常为疼痛以一侧偏重。近30天走路疼痛明显，有点肿胀，并有触痛。用实施例1制得的外敷药膏3次(6天)后就明显改善了症状，疼痛明显减轻。用药期间无不适反应。
81.病例2
82.徐某，女，70岁，身高160，体重135斤。现因扭伤，腰部疼痛以左侧偏重。用实施例1制得的外敷药膏5次(10天)后明显改善了症状，疼痛明显减轻。
83.用药期间无不适反应。
84.测试例2黄芩苷在oa治疗中的具体作用和机制
85.1、实验材料与方法
86.(1)试剂及仪器
87.人正常软骨细胞c28/i12从美国型组织培养收集(xy-xb-1918，manassas， va，usa)中获得，eagle培养基(dmem，invitrogen，carlsbad，ca，usa)， 10％胎牛血清(fbs,invitrogen，usa)，1％青霉素-链霉素、黄芩苷(sigma-aldrich， mo)，10ng/ml il-1β(amyjet scientific，武汉)、细胞活力检测试剂盒8(cck-8) 试剂盒(上海beyotime)，酶标仪(瑞士lahx)，annexin v-fitc试剂盒(上海 beyotime)，核糖核酸提取试剂盒(上海beyotime)，荧光显微镜(olympus)， abi prism 7500(usa)，蛋白浓度检测试剂盒(上海beyotime)，pvdf膜(millipore， bedford，ma，usa)，流式细胞仪(bd biosciences，usa)等。
88.一抗：抗bax(1:1000)、抗bcl-2(1:1000)、抗cleaved caspase-3(1:1000)、抗cleaved caspase-9(1:1000)、lc-3b(1:1000)、beclin 1(1:1000)、抗p-mtor (1:1000)、mtor(1:1000)、抗p-p70s6k(1:1000)、抗p70s6k(1:1000)、抗 p-4ebp1(1:1000)、抗4ebp1(1:1000)、抗β-actin(1:1000，abcam，ma，usa) 及二抗(1:2000，abcam，ma，usa)。
89.(2)实验方法
90.(2-1)细胞系和处理
91.人正常软骨细胞c28/i12常规培养于dulbecc修饰的eagle培养基中添加10％胎牛血清和1％青霉素-链霉素在37℃的5％co2湿化条件下，用10ng/ml il-1β处理c28/i12细胞12h，或不同浓度(10(l)、20(m)和40(h)μmol/l)的黄芩苷处理指定时间。
92.(2-2)细胞活力检测
93.将c28/i12细胞以1
×
104个/孔的密度接种于96孔板24h，然后分别用10 ng/ml il-1β和/或不同浓度(10(l)、20(m)和40(h)μmol/l)的黄芩苷处理0、 24、48和72h。根据检测结果，采用cck-8试剂盒检测细胞活力。用酶标仪在 490nm测吸光度。
94.(2-3)细胞增殖检测
95.用5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷法(edu)检测il-lβ和/或黄芩苷处理的 c28/i12细胞的增殖情况。将c28/i12细胞以密度4
×
104个/孔培养在24孔板，处理10ng/ml il-lβ12h和/或不同浓度(10(l)、20(m)和40(h)μmol/l)的黄芩苷48h。然后以4％的多聚甲醛固定c28/i12细胞，用triton x-100裂解核膜，处理后的c28/i12细胞用山羊血清封闭l h。最后，按照厂商说明对c28/i12细胞进行染色。
96.(2-4)细胞凋亡检测
97.采用原位末端转移酶标记技术(tunel)法检测il-lβ和/或黄芩苷处理的 c28/i12细胞的凋亡情况。将c28/i12细胞以密度4
×
104个/孔培养在24孔板，处理10ng/ml il-lβ12h和/或不同浓度(10(l)、20(m)和40(h)μmol/l)的黄芩苷48h。然后，各组的c28/i12细胞切片脱蜡，用蛋白酶k在室温下15min裂解。然后用3％过氧化氢溶液处理阻断内源过氧化物酶，用平衡缓冲液和末端脱氧核苷酸转移酶孵育。最后，切片与抗地高辛过氧化物酶偶联物孵育，并通过软件进行评价。切片在
×
200光镜下观察。
98.(2-5)流式细胞术检测
99.采用annexin v-fitc试剂盒检测黄芩苷在il-lβ和/或黄芩苷处理的c28/i12 细
胞凋亡中的作用。将c28/i12细胞以密度4
×
104个/孔培养在24孔板，处理10 ng/ml il-iβ12h和/或不同浓度(10(l)、20(m)和40(h)μmol/l)的黄芩苷48h。然后用胰蛋白酶收集c28/i12细胞，pbs洗涤，在500μl结合缓冲液中重悬。然后，用5μl annexin v-fitc和10μl pi处理c28/i12细胞，黑暗下孵育15min。最后，用流式细胞仪检测凋亡细胞。
100.(2-6)酶联免疫吸附(elisa)试验
101.根据厂商说明进行elisa检测c28/i12细胞中tnf-α、il-6的浓度。
102.(2-7)细胞自噬测定
103.采用单丹磺酸尸胺(dansylcadaverine，mdc)法检测黄芩苷对il-1β和/或黄芩苷处理的c28/i12细胞自噬的影响。将c28/i12细胞以密度4
×
104个/孔培养在24孔板，处理10ng/ml il-1β12h和/或不同浓度(10(l)、20(m)和40(h)μmol/l) 的黄芩苷48h。然后用pbs洗涤c28/i12细胞两次，用1ml pbs重悬。每孔加入1μl mdc溶液，37℃黑暗孵育30min。最后在荧光显微镜下观察自噬体。
104.(2-8)核糖核酸提取及含量检测
105.用rna提取试剂盒从c28/i12细胞中提取总rna，用taqman一步反转录将其转录为互补脱氧核糖核酸。实时荧光定量聚合酶链式反应(qrt-pcr)实验在abi prism 7500(applied biosystems，usa)上按照厂家说明书进行。使用 2-δδct
法计算atg5和atg7的mrna表达量，β肌动蛋白(β-actin)作为内参。
106.具体引物如下：
107.atg5上游引物：5'-cagacaacgactgaaagacct-3'；
108.atg5下游引物：5'-caggatcaatagcagaaggacaa-3'；
109.atg7上游引物：5'-cgccagcagcagtgatgacc-3'；
110.atg7下游引物：5'-aatgccaggctgacaggaagaac-3'；
111.β-actin上游引物：5'-agccacatcgctcagacacc-3'；
112.β-actin下游引物：5'-gtactcagcgccagcatcg-3'。
113.所有引物序列均采用primer premier软件4.0(premier，canada)设计。
114.qrt-pcr的条件为：95℃ 10min，95℃15s，40个循环，60℃ 1min。
115.(2-9)放射免疫沉淀检测蛋白
116.用ripa裂解缓冲液从c28/i12细胞中提取蛋白，用蛋白浓度检测试剂盒定量。用10％聚丙烯酸胺凝胶电泳分离蛋白，转移到pvdf膜。然后，在室温下用5％脱脂牛奶在tbst中封闭细胞膜1h，并在4℃下用一抗处理过夜。用洗涤缓冲液洗涤膜3次，用酶标二抗(1:2000)在室温下孵育lh。最后，用增强化学发光试剂盒(ecl)对蛋白印迹进行可视化，并用imagej软件(nih，version 4.3) 进行定量。
117.(2-10)统计分析
118.采用graphpad prism 5.0进行数据分析，数据以均值
±
标准差表示。用单因素方差分析来比较各组之间的差异。p《0.05(双侧检验)为有统计学意义。
119.2、结果分析
120.(1)黄芩苷对il-1β处理的c28/i12细胞增殖的影响
121.il-1β显著抑制了c28/i12细胞的活力，而黄芩苷显著提高了il-lβ处理的 c28/i12细胞的活力，且呈时间和剂量依赖性，如图1a所示，差异有统计学意义(p《0.05)；il-1β
显著抑制了edu阳性c28/i12细胞的数量，黄芩苷处理后， edu阳性的c28/i12细胞数量明显上调，且呈剂量依赖性，如图1b所示，差异有统计学意义(p《0.05)；il-1β显著抑制ki-67和pcna的蛋白质含量，而黄芩苷明显增加ki-67的水平和pcna在c28/i12细胞对il-1β，如图1c所示，差异有统计学意义(p《0.05)。
122.(2)黄芩苷对il-1β诱导的c28/i12细胞凋亡及炎症反应的影响
123.il-1β处理后凋亡细胞数量增加，如图2a、图2b所示，差异有统计学意义 (p《0.05)。il-1β显著上调bax、cleaved caspase-3和cleaved caspase-9蛋白表达，下调bcl-2蛋白表达，如图2c所示，差异有统计学意义(p《0.05)。il-1β明显促进了tnf-α和il-6的分泌，而黄芩苷处理明显抑制tnf-α和il-6的分泌，如图2d所示，差异有统计学意义(p《0.05)。
124.(3)黄芩苷对il-1β诱导的c28/i12细胞自噬的影响
125.自噬是广泛存在于真核细胞中的一种重要的生物活性，受损的细胞结构和生物大分子可以通过自噬去除，自噬在维持细胞代谢和稳态中起着重要作用。
126.与il-lβ处理组相比，黄芩苷对il-lβ诱导的c28/i12细胞自噬体有明显的抑制作用，如图3a所示，差异有统计学意义(p《0.05)。il-lβ明显增加了atg5和 atg7的表达，而黄芩苷可抑制atg5和atg7的表达，如图3b所示，差异有统计学意义(p《0.05)。il-lβ明显促进lc3b和beclin1的表达，而黄芩苷则部分抑制lc3b和beclin1的表达，如图3c所示，差异有统计学意义(p《0.05)。il-lβ显著抑制了mtor信号通路的表达，而黄芩苷处理明显激活了il-lβ处理的 c28/i12细胞中mtor信号通路，如图3d所示，差异有统计学意义(p《0.05)。
127.mtor信号通路作为一种经典的信号通路，与软骨细胞自噬密切相关。本研究数据显示，黄芩苷显著激活il-1β处理的软骨细胞中的mtor信号通路。为了进一步验证自噬在oa发生发展中的作用，以下选择自噬诱变剂雷帕霉素进行进一步研究。
128.(4)黄芩苷通过自噬依赖性激活mtor信号通路改善il-1β诱导的c28/i12 细胞凋亡
129.雷帕霉素部分拮抗黄芩苷对il-1β处理的c28/i12细胞活力的促进作用，如图4a所示，差异有统计学意义(p《0.05)。雷帕霉素部分恢复了黄芩苷对il-1β处理的c28/i12细胞凋亡的抑制作用，如图4b所示，差异有统计学意义(p《0.05)。雷帕霉素部分改变了黄芩苷对il-1β处理的c28/i12细胞炎症反应的催化作用，如图4c所示，差异有统计学意义(p《0.05)。在il-1β处理的c28/i12细胞中，雷帕霉素部分逆转了黄芩苷诱导的mtor信号通路的激活，如图4d所示，差异有统计学意义(p《0.05)。本研究发现雷帕霉素部分逆转了黄芩苷对il-1β处理的软骨细胞增殖、凋亡、炎症和自噬的影响。
130.综上，本实施例的研究发现黄芩苷能明显促进il-1β诱导的软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡，抑制软骨细胞自噬。证实了黄芩苷通过激活自噬依赖的mtor 信号通路，促进il-1β处理的软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡和炎症反应，从而对 oa具有潜在的治疗作用。
131.以上所述仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。