DKK-1抑制剂用于治疗癌症的用途的制作方法

dkk-1抑制剂用于治疗癌症的用途
相关申请的交叉引用
1.本技术要求于2019年9月19日提交的美国临时申请62/902857的申请日的权益。上述申请的完整教导通过引用并入本文。


背景技术：

2.癌症是一种细胞障碍，其特征在于不受控制的或失调的细胞增殖、减少的细胞分化、侵入周围组织的不适当的能力、和/或在异位部位处建立新的生长的能力。取决于所涉及的具体癌症，用于癌症的治疗可涉及手术、放疗、化疗或这些治疗的组合。据估计，美国2018年将诊断出1,735,350个新的癌症病例，并且将有604,640人死于癌症。因此，尽管在癌症的治疗方面取得了重大进展，但对于癌症患者，仍持续存在着对新的和改善的治疗的需求。


技术实现要素：

3.在示例实施例中，本发明是一种在有需要的受试者中治疗癌症的方法，该方法包括在受试者的癌症的样品中通过h评分或阳性百分比确定dkk1表达；以及向确定为具有高于预定值的dkk1表达h评分或阳性百分比的受试者施用第一量的dkk1抑制剂。
附图说明
4.前述内容从接下来对本发明的各种示例实施例进行的更具体的描述中将是明显的，如在附图中所展示的，在附图中，相同的参考符号在不同图中代表相同部分。附图并非必定按比例，而是将重点放在说明本发明的实施例上。
5.图1是代表组合起来包含134名患者的患者亚组的示意图，这些患者用于通过rnascope进行的dkk1 h评分的汇总分析，如实例1中所述。
6.图2是三个图的叠加，每个图代表134名患者按他们的dkk1 h评分的三分位数，其以无进展生存期(pfs，测量为概率)作为天数的函数。
7.图3是代表按他们的dkk1 h评分三分位数分开的134名患者的池、以及由癌症的类型和一种或多种治疗剂限定的患者的亚组的风险比(hr)的表和图。
8.图4是标准化对数秩统计量(本文所述)作为dkk1 h评分的函数的图。
9.图5是两个图的叠加，每个图代表患者的亚组的pfs(表示为概率)作为时间的函数。
10.图6是代表按他们的最佳dkk1 h评分分开的134名患者的池、以及由癌症的类型和一种或多种治疗剂限定的患者的亚组的风险比的表和图。
11.图7是不同截止点的比较的图解显示，其表明最佳截止点具有最佳调整的风险比(hr)。
12.图8示出了两个叠加的图，每个图代表eec/eoc患者的亚组的pfs(表示为概率)作为时间的函数。
13.图9是代表eec/eoc患者的亚亚组的hr的表和图。
14.图10示出了两个叠加的图，每个图代表gej/gc/ec患者的pfs(表示为概率)作为时间的函数。
15.图11是代表gej/gc/ec患者的亚组的hr的表和图。
16.图12是代表在25名接受dkn-01/抗pd-1疗法的可评价的gej/gc io初治患者中病灶尺寸的最大百分比减小的条形图。
17.图13示出了两个叠加的图，每个图代表接受dkn-01/抗pd-1疗法的io初治gej/gc患者的亚组的pfs(表示为概率)作为时间的函数。
18.图14a示出了两个叠加的图，每个图代表gej/gc/ec患者的pfs(表示为概率)作为时间的函数，该pfs使用％阳性度量计算，使用较高的三分位数的下边界作为截止值。
19.图14b示出了两个叠加的图，每个图代表gej/gc/ec患者的pfs(表示为概率)作为时间的函数，该pfs使用％阳性度量计算，使用“最佳”截止值。
20.图15示出了两个叠加的图，每个图代表接受dkn-01/抗pd-1疗法的io初治gej/gc患者的亚组的pfs(表示为概率)作为时间的函数。
21.图16a和图16b是示出了如本文所述治疗的胃/gej io难治性患者的h评分(a)或％阳性值(b)的散点图。
具体实施方式
22.本发明的示例实施例的描述如下。
23.本文引用的所有专利、公布的申请以及参考文献的教导都通过引用以其全文并入。
24.虽然本发明已参考其示例实施例进行了特定示出和描述，但本领域的技术人员将理解，在不偏离由所附权利要求书涵盖的本发明范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的各种改变。
25.如本文所用的食道胃癌是指食道癌和胃(gastric/stomach)癌(gc)。
26.如本文所用的食道癌(ec)是指食道以及胃-食道连接(gej)的癌症。如本领域常用的，食道癌包括食道鳞状细胞癌(escc)和食道腺癌(eac)。通常，escc是指起源于鳞状细胞的癌症，这些细胞将食道排列在器官的大约上部2/3处。eac是指起源于腺体细胞的癌症，其替代鳞状细胞区域(例如，在barrett食道中)，典型地在食道的下1/3处。因此，如本文所用的食道腺癌是指食道以及胃-食道连接的腺癌。
27.在一些实施例中，食道腺癌是复发的、转移的或两者兼有。在一个实施例中，复发的食道腺癌可以在肿瘤生长的原发部位处复发(例如，复发的肿瘤生长发生在相同的部位处)。在另一实施例中，复发的食道腺癌可以在与肿瘤生长的原发部位不同的部位处复发(例如，肿瘤已转移)。在另外的实施例中，复发的食道腺癌可在原发部位以及与肿瘤生长的原发部位不同的部位两者处复发。
28.如本文所用，术语“复发(recurrent)”和“再发(relapsed)”可互换使用。
29.如本文所用，“胃癌”是指胃的癌症。胃癌的一种具体类型是“胃腺癌”。腺癌是一类癌性肿瘤，其被定义为具有腺体起源、腺体特征、或两者的上皮组织的瘤形成。
30.胃癌是世界上第四大最常见的癌症相关的死亡的原因，并且其在西方国家仍然难
以治愈，主要是因为大多数患者患有晚期疾病。胃始于胃食道连接处，并止于十二指肠处。组织学上，90％-95％的胃恶性肿瘤是腺癌。治愈性疗法涉及手术切除，最常见的是全胃切除或胃次全切除，伴随淋巴结切除。可切除胃癌患者的总体5年生存率的范围是从10％至30％。
31.如本文所用，“妇科癌症”是指子宫内膜的癌证(子宫内膜癌)和卵巢的癌症(卵巢癌)。子宫衬有被称为子宫内膜的特定组织。当癌症在该内衬中生长时，其被称为子宫内膜癌。子宫的大多数癌症是子宫内膜癌。在某些实施例中，子宫内膜癌是上皮性子宫内膜癌(eec)。在另一实施例中，卵巢癌是上皮性卵巢癌(eoc)。
32.如本文所用，“胆道癌”是指胆道的癌症。胆道癌发生在胆管(将胆汁从肝脏转运的管道)中，称为“胆管癌”或胆囊癌。基于癌症发生在胆管中的位置，将胆管癌分为不同的类型：肝内胆管癌发生在肝内胆管的部分，并且有时被分类为肝癌的一种类型；肝门部胆管癌发生在肝外的胆管中。这种类型也称为肝门周围胆管癌；并且远端胆管癌发生在最靠近小肠的胆管的部分。胆囊癌发生在胆囊中。
33.在示例实施例中，受试者对至少一种(例如一种、两种、三种、四种、五种等)先前的治疗方案不耐受。例如，受试者经历了对先前的治疗方案的不良反应并且治疗停止。在另一实施例中，受试者对至少一种先前的治疗方案是难治的(例如，受试者对治疗方案不再有响应)。在其他实施例中，受试者对至少一种先前的治疗方案无响应。在各个实施例中，如适用，受试者经历了本文所述的对至少一种先前的治疗方案的失败的组合。在另一实施例中，受试者为“免疫肿瘤学初治”(io初治)。
34.在另外的实施例中，如通过本领域已知的各种标准mrna或蛋白检测方法中的一种或多种(例如，原位杂交或免疫组织化学)所确定，食道胃、妇科、和胆道肿瘤表达dkk1。此类肿瘤的实例包括食道腺癌或胃腺癌。
35.如本文所用，“截止点”或“截止点值”是指dkk1表达的测量值(例如，在肿瘤细胞中，无论是h评分值还是“％阳性”值，如下所述)，当亚组中具有高于该“截止点”的表达(h评分或％阳性)的测量值的患者施用dkk1抑制剂(例如dkn-01)时，如与具有低于该“截止点”值的表达的测量值的患者亚组相比，这些患者示出无进展生存期(pfs)的统计学显著的改善。
36.如本文所用，无论是通过h评分值还是％阳性值(“最佳h评分”、“最佳％阳性”、或简单地“最佳截止点”)表示，“最佳dkk1表达”是指“标准化对数秩统计量”的绝对值达到其最大值处dkk1的表达的测量值(h评分值或％阳性值)，其中该“标准化对数秩统计量”的计算如下概述。
37.x1-xn范围内的固定的截止点μ的对数秩统计量通过t
μ
定义为：其中，观察i的对数秩评分(a)由以下给出：其中，
是在时间zj之前或在时间zj处死亡或删失的观察的数目。z＝(z1，...，zn)和δ＝(δ1，...，δn)分别是至事件时间和删失指标的向量。对长秩统计量t
μ
进行标准化导致如以下定义的s
μ
：其中无效假设下的t
μ
的预期值(e)由以下给出：并且方差由以下给出：并且表示x的经验分布函数。我们根据x的预定义的样品分位数(ε1，ε2)将可能的截止点限制为区间μ∈[μ1，μ2]。并且其中0＜ε1＜ε2＜1并且由μ确定的两组中的样品大小是m
μ
＝nf
nx
(μ)和n
μ
＝n-m
μ
。
[0038]
标准化统计量的绝对值的最大值(对数秩)s
μ
定义了截止点估计量，其使观察的分离最大化。使用上述定义，最大选择的对数秩统计量定义为：
[0039]
对于详细信息，参考torsten hothorn和berthold lausen.on the exact distribution of maximally selected rank statistics[关于最大选择秩统计量的精确分布].computational statistics&data analysis[计算统计和数据分析],43(2):121-137,2003年6月。该参考文献的教导通过引用以其全文并入本文。
[0040]
完整的算法实施在maxstat(r)中描述，并因此使用包“maxstat”进行该分析，参见torsten hothorn(2017).maxstat:maximally selected rank statistics[maxstat：最大选择秩统计量].r包版本0.7-25，见于url https://cran.r-project.org/package＝maxstat。
[0041]
在某些实施例中，如果h评分的值高于最佳截止点，则将用基于dkn-01的疗法治疗的癌症患者分组为dkk1 h评分“高”，并将具有低于最佳截止点的h评分的患者分组为dkk1“低”。最佳截止点使这两组之间的观察的分离最大化。
[0042]
如本文所用，当指值的百分位数(例如，“较高三分位数”)时，短语“高于预定值”意指“等于或大于预定值”，并且当指选择的数值时，短语“高于预定值”意指“大于预定值”，如“最佳dkk1表达h评分”。
[0043]
h评分和％阳性值
[0044]
目的基因产物的表达(例如dkk1的表达)的水平可以通过免疫组织化学方法或原位杂交技术进行评价。表达的水平的方便半定量测量是计算％阳性值(由dkk-1rna检测试剂染色的细胞的％)或为肿瘤样品分配h评分(或“组织”评分)。对于h评分，确定固定的视野中每个细胞的染色强度(0、1 、2 、或3 )。然后，h评分可以基于主要的染色强度，或更复杂地，可以包括所见的每个强度水平的各个百分比的总和。通过一种方法，计算处于每个染色强度水平的细胞的百分比，并最后使用下式分配h评分：
[0045]
h评分＝[1
×
(％细胞1 ) 2
×
(％细胞2 ) 3
×
(％细胞3 )]
[0046]
最终的评分(范围从0至300)为给定的肿瘤样品中较大强度或量的染色给出了更大的相对权重。然后可以基于具体的区分阈值将样品视为阳性或阴性。例如，参见hirsch fr、varella-garcia m、bunn pa jr等人:epidermal growth factor receptor in non-small-cell lung carcinomas:correlation between gene copy number and protein expression and impact on prognosis.[非小细胞肺癌中的表皮生长因子受体：基因拷贝数与蛋白表达之间的相关性以及对预后的影响]j clin oncol[临床肿瘤学杂志]21:3798-3807,2003；以及john t,liu g,tsao m-s:overview of molecular testing in non-small-cell lung cancer:mutational analysis,gene copy number,protein expression and other biomarkers of egfr for the prediction of response to tyrosine kinase inhibitors.[非小细胞肺癌中的分子测试概述：egfr的突变分析、基因拷贝数、蛋白表达和其他生物标志物用于预测对酪氨酸激酶抑制剂的反应]oncogene[致癌基因]28:s14-s23,2009。将这些参考文献的相关教导通过引用并入本文。
[0047]
在各个实施例中，h评分(例如，h评分的预定值)可以是从1至300，例如，20至100、或20至50。h评分的示例预定值是：20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、和100。在可替代的示例实施例中，h评分的预定值是：10或更大、20或更大、30或更大、40或更大、50或更大、60或更大、70或更大、80或更大、或90或更大。在某些实施例中，h评分的预定值是：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、103、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287、288、289、290、291、292、293、294、295、296、297、298、299、或300。
[0048]
在可替代的实施例中，dkk1表达的测量值可以是对dkk1染色阳性的肿瘤细胞的分
数(％阳性)的值。首先，基于细胞中的点的数目，确定固定的视野中每个肿瘤细胞的染色量(0、1 、2 、或3 )。在所有肿瘤细胞被分配为“阳性”后(例如，检测出rnascope原位杂交的单个染色点)，通过将全部的染色的肿瘤细胞相加并除以肿瘤细胞的总数确定阳性肿瘤细胞的百分比。％阳性的范围可以从0至100。
[0049]
在各个实施例中，％阳性值(例如，％阳性的预定值)可以是从15％至50％，例如从20％至40％、或20％至25％。％阳性的示例预定值是：15％或更大、20％或更大、25％或更大、30％或更大、35％或更大、40％或更大、45％或更大、或50％或更大。在某些实施例中，％阳性的预定值是：1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％。
[0050]
rnascope分析
[0051]
计算样品的h评分的方法之一是由高级细胞诊断公司(advanced cell diagnostics,inc.)开发并可从其商购的原位杂交技术，例如在url https://acdbio.com/处所描述。该技术依赖于来自与目的mrna同源的杂交探针的光学信号。该信号可以通过明视野或落射荧光显微镜检测。该技术允许检测单个分子。例如，参见rnascope:a novel in situ rna analysis platform for formalin-fixed paraffin-embedded tissues[rnascope：福尔马林固定的石蜡包埋的组织的新型原位rna分析平台].wang f,flanagan j,su n,wang lc,bui s,nielson a,wu x,vo ht,ma xj,luo y(2012).j of mol diagnostics[分子诊断杂志],14(1):22-29。
[0052]
检测生物标志物的可替代方法
[0053]
除了技术之外，还可以使用检测生物标志物(例如基因产物表达的水平，如dkk1表达水平)的可替代方法。
[0054]
已示出了组织切片的免疫组织化学(ihc)染色是评估或检测样品中蛋白的存在的可靠方法。免疫组织化学技术利用抗体原位探测并使细胞抗原可视化(通常通过显色或荧光方法)。因此，使用抗体或抗血清(在一些实施例中，多克隆抗血清，并且在一些实施例中，对每个标志物具有特异性的单克隆抗体)检测表达。如下文更详细讨论的，可以通过例如用放射性标记、荧光标记、半抗原标记(如生物素)或酶(如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)直接标记抗体本身来检测抗体。可替代地，未标记的一抗与标记的二抗结合使用，该二抗包含抗血清、多克隆抗血清或对一抗具有特异性的单克隆抗体。免疫组织化学方案和试剂盒在本领域是熟知的并且是可商购的。
[0055]
两种通用的ihc方法是可用的：直接和间接测定。根据第一种测定，直接确定抗体与靶抗原的结合。这种直接测定使用标记的试剂，如无需另外的抗体相互作用就可可视化的荧光标签或酶标记的一抗。在典型的间接测定中，未缀合的一抗与抗原结合，然后标记的二抗与一抗结合。在二抗与酶标记结合的情况下，添加显色或荧光底物以提供抗原的可视
化。发生信号放大是因为几种二抗可以与一抗上的不同表位发生反应。
[0056]
用于免疫组织化学的一抗和/或二抗典型地将用可检测的部分标记。有许多标记可用，这些标记通常可分为以下几类：
[0057]
(a)放射性同位素，如
35
s、
14
c、
125
i、3h、和
131
i。可以使用例如current protocols in immunology[当代免疫学实验手册],卷1和2,coligen等人编辑.wiley-interscience[威利跨学科],纽约,纽约出版(1991)中描述的技术用放射性同位素标记抗体并且可以使用闪烁计数来测量放射性。
[0058]
(b)胶体金颗粒。
[0059]
(c)荧光标记，包括但不限于稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹磺酰、丽丝明、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白、或可商购荧光团，如spectrum和spectrum和/或上述任何一种或多种的衍生物。可以使用例如在current protocols in immunology[当代免疫学实验手册](同上)中披露的技术使荧光标记与抗体缀合。可以使用荧光计量化荧光。
[0060]
(d)各种酶-底物标记是可用的并且美国专利号4,275,149提供了其中的一些的回顾。该酶通常催化显色底物的化学改变，该化学改变可以使用各种技术进行测量。例如，该酶可以催化底物的颜色改变，这可以用分光光度法测量。可替代地，该酶可以改变底物的荧光或化学发光。上面描述了用于量化荧光的改变的技术。化学发光底物通过化学反应被电子激发，然后可以发射能够测量(例如，使用化学发光计)的光或向荧光受体提供能量。酶标记的实例包括荧光素酶(例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶；美国专利号4,737,456)、荧光素、2,3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶(如辣根过氧化物酶(hrpo))、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖类氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。将酶与抗体缀合的技术描述于o'sullivan等人methods for the preparation of enzyme-antibody conjugates for use in enzyme immunoassay[用于酶免疫测定的酶-抗体缀合物的制备的方法],在methods in enzym[酶学方法]中.(编辑j.langone&h.van vunakis),academic press[学术出版社],纽约,73:147-166(1981)。
[0061]
酶-底物组合的实例包括例如：
[0062]
(i)以过氧化氢酶为底物的辣根过氧化物酶(hrpo)，其中过氧化氢酶氧化染料前体[例如，邻苯二胺(opd)或3,3',5,5'-四甲基联苯胺盐酸盐(tmb)]。3,3-二氨基联苯胺(dab)也可用于使hrp标记的抗体可视化；
[0063]
(ii)以对硝基苯磷酸盐作为显色底物的碱性磷酸酶(ap)；以及
[0064]
(iii)β-d-半乳糖苷酶(β-d-gal)与显色底物(例如，对硝基苯基-β-d-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如，4-甲基伞形酮基-d-半乳糖苷酶)。
[0065]
本领域技术人员可以获得许多其他酶-底物组合。对于这些的一般回顾，参见美国专利号4,275,149和4,318,980。
[0066]
有时，标记与抗体间接缀合。技术人员将意识到用于实现这一点的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合，并且上文提到的四大类标记中的任一种都可以与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地与抗生物素蛋白结合，并因此该标记可以以这种间接的方式与抗体缀合。可替代地，为了实现标记与抗体的间接缀合，使抗体与小的半抗原缀
合，并且使上文提到的不同类型的标记之一与抗半抗原抗体缀合。因此，可以实现标记与抗体的间接缀合。
[0067]
除了本领域普通技术人员已知的标准样品制备程序之外，可能希望在ihc之前、期间或之后进一步处理组织切片。例如，可以进行表位修复方法，如在柠檬酸盐缓冲液中加热组织样品[参见例如，leong等人appl.immunohistochem.[应用免疫组织化学]4(3):201(1996)]。
[0068]
在任选的封闭步骤之后，使组织切片暴露于一抗持续足够的时间段并处于一抗与组织样品中的靶蛋白抗原结合的合适的条件下。实现这一点的合适的条件可以通过常规的实验来确定。
[0069]
抗体与样品的结合程度通过使用上文讨论的任何一种可检测标记来确定。优选地，该标记是酶标记(例如hrpo)，其催化显色底物(如3,3'-二氨基联苯胺色原)的化学改变。优选地，酶标记与特异性结合一抗的抗体缀合(例如一抗是兔多克隆抗体并且二抗是山羊抗兔抗体)。
[0070]
可以安装如此制备的样本并盖玻片。然后例如使用显微镜确定载玻片评价。
[0071]
ihc可以在之前或之后与形态学染色剂组合。脱蜡后，安装在载玻片上的切片可以用形态学染色剂染色用于评估。将使用的形态学染色剂提供组织切片的准确形态学评价。切片可以用一种或多种染料染色，每种染料都明显地将不同的细胞组分染色。在一个实施例中，使用苏木精将载玻片的细胞核染色。苏木精广泛可用。合适的苏木精的实例是苏木精ii(ventana)。当希望较浅的蓝色细胞核时，可在苏木精染色后使用蓝化试剂。本领域技术人员将理解，可以通过增加或减少载玻片留在染料中的时间的长度来优化给定组织的染色。
[0072]
用于载玻片制备和ihc加工的自动化系统可商购。benchmark xt系统就是这种自动化系统的实例。染色后，可以通过显微镜的标准技术分析组织切片。通常，病理学家等评估组织是否存在异常或正常的细胞或具体的细胞类型，并提供目的细胞类型的基因座。因此，例如，病理学家等将审查载玻片并鉴定正常细胞(如正常的肺细胞)和异常细胞(如异常或肿瘤肺细胞)。可以使用任何定义目的细胞的基因座的手段(例如，x-y轴上的坐标)。
[0073]
用于生物标志物检测的其他技术是本领域已知的，包括但不限于核酸检测方法(包括但不限于pcr、测序、rtpct、rna-seq、微阵列分析、sage、mass array技术和fish)和蛋白质检测方法(包括但不限于质谱、蛋白质印迹)。使用本领域技术人员已知的某些技术实现了对c-met基因的扩增的检测。例如，可以使用比较基因组杂交产生作为染色体位置的函数的dna序列拷贝数的图。参见例如，kallioniemi等人(1992)science[科学]258:818-821。也可以检测c-met基因的扩增，例如通过使用对c-met基因具有特异性的探针的southern杂交或通过实时定量pcr。在某些实施例中，通过直接评估c-met基因的拷贝数，例如，通过使用与c-met基因杂交的探针来实现检测c-met基因的扩增。例如，可以进行fish测定。在某些实施例中，通过间接评估c-met基因的拷贝数，例如，通过评估位于c-met基因外但与c-met基因共同扩增的染色体区的拷贝数来实现检测c-met基因的扩增。还可以使用体内诊断测定，例如通过以下来评估生物标志物表达：施用与待检测的分子结合并带有可检测标记(例如放射性同位素)的标签的分子(如抗体)并从外部扫描患者以定位该标记。
[0074]
dkk1抗体
[0075]
先前已描述了dkk1抗体(参见例如，美国专利号8,148,498和7,446,181，将其通过引用以其全文并入本文)。本文披露的dkk1抗体或其抗原结合片段涉及与人dkk1结合的人工程化抗体，该人dkk1包含seq id no:22中所示的氨基酸序列或其片段。本发明的dkk1抗体是治疗上有用的dkk1拮抗剂，具有许多期望的特性。例如，dkk1抗体阻断dkk1介导的碱性磷酸酶抑制、标志物或成骨细胞活性，以及治疗各种类型的癌症(例如，非小细胞肺癌)。
[0076]
全长抗体当它以天然方式存在时是包含由二硫键互相连接的2条重(h)链和2条轻(l)链的免疫球蛋白分子。每条链的氨基末端部分包括约100-110个氨基酸的可变区，该可变区经由包含在其中的互补决定区(cdr)主要负责抗原识别。每条链的羧基末端部分限定恒定区，主要负责效应子功能。
[0077]
这些cdr散布有更为保守的区，称为框架区(“fr”)。每个轻链可变区(lcvr)和重链可变区(hcvr)由3个cdr和4个fr组成，按以下顺序从氨基端到羧基端排列：fr1，cdr1，fr2，cdr2，fr3，cdr3，fr4。轻链的3个cdr被称为“lcdr1、lcdr2、和lcdr3”并且重链的3个cdr被称为“hcdr1、hcdr2、和hcdr3”。这些cdr含有与抗原形成特异性相互作用的残基中的大多数。在lcvr和hcvr区内的cdr氨基酸残基的编号和定位遵循众所周知的kabat编号规则。
[0078]
轻链分为κ或λ，并且其由本领域已知的特定恒定区表征。重链分为γ、μ、α、δ、或ε，并且将抗体的同种型分别定义为igg、igm、iga、igd、或ige。igg抗体可以进一步分为亚类，例如，igg1、igg2、igg3、igg4。每种重链类型的特征在于具有本领域熟知的序列的特定恒定区。
[0079]
如本文所用，术语“单克隆抗体”(mab)是指抗体，该抗体衍生自单个拷贝或克隆，包括例如任何真核、原核、或噬菌体克隆，而不是产生它的方法。本发明的mab优选地以同质的或基本上同质的群体存在。完全mab含有2条重链和2条轻链。
[0080]
除非另有说明，否则术语“dkk1抗体”涵盖全长抗体以及dkk1抗体的抗原结合片段二者。
[0081]
此类单克隆抗体的“抗原结合片段”包括例如fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、和单链fv片段以及可利用dkn-01cdr的双特异性和/或多价抗体。可以例如通过重组技术，噬菌体展示技术、合成技术(例如，cdr移植)、或此类技术的组合、或本领域已知的其他技术来生产单克隆抗体及其抗原结合片段。例如，可以用人dkk1或其片段免疫小鼠，可以回收并纯化所得的抗体，并且可以通过本领域已知的方法评估确定它们是否具备与本文披露的这些抗体化合物相似或相同的结合与功能特性。还可以通过常规方法制备抗原结合片段。用于产生和纯化抗体和抗原结合片段的方法是本领域熟知的并可以例如发现于harlow和lane(1988)antibodies,a laboratory manual[抗体：实验室手册],cold spring harbor laboratory press[冷泉港实验室出版社],冷泉港,纽约,第5-8章和第15章,isbn 0-87969-314-2中。
[0082]
本文披露的单克隆dkk1抗体被工程化以包含框架区，这些框架区是基本上人或衍生自非人抗体的完全人周围的cdr。此类人工程化抗体的“抗原结合片段”包括例如fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、和单链fv片段。“框架区”或“框架序列”是指框架区1至4中的任一个。由本文披露的抗体涵盖的人工程化抗体及其抗原结合片段包括其中框架区1至4中任一个或多个基本上或完全是人的分子，即，其中存在单独的基本上或完全人框架区1至4的
可能组合中的任一种。例如，这包括其中框架区1和框架区2、框架区1和框架区3、框架区1、2、和3等基本上或完全为人的分子。基本上人框架是与已知的人种系框架序列具有至少约80％序列同一性的那些。优选地，基本上人框架与已知的人种系框架序列具有至少约85％、约90％、约95％、或约99％的序列同一性。
[0083]
可以使用几种不同方法来生成除本文披露的那些之外的表现出类似功能特性的人工程化抗体。本文披露的具体抗体化合物可以用作模板或亲本抗体化合物以制备额外的抗体化合物。在一种方法中，将亲本抗体化合物cdr移植到与亲本抗体化合物框架具有高序列同一性的人框架中。新框架的序列同一性通常将与亲本抗体化合物中对应框架的序列至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、或至少约99％相同。这种移植可能导致相比于亲本抗体的结合亲和力的降低。如果情况如此，可以基于由queen等人(1991)proc.natl.acad.sci.usa[美国国家科学院院刊]88:2869披露的具体标准将该框架在某些位置处回复突变为亲本框架。描述在人源化小鼠抗体中有用的方法的额外的参考文献包括美国专利号4,816,397、5,225,539、和5,693,761；如描述于levitt(1983)j.mol.biol.[分子生物学杂志]168:595-620的计算机程序abmod和encad；以及winter和共同工作者的方法(jones等人(1986)nature[自然]321:522-525；riechmann等人(1988)nature[自然]332:323-327；和verhoeyen等人(1988)science[科学]239:1534-1536)。鉴定被考虑用于回复突变的残基的方法是本领域已知的(参见例如，美国专利号8,148,498)。
[0084]
在本文所述的治疗的方法中施用的dkk1抗体包含轻链可变区(lcvr)和重链可变区(hcvr)，其中lcvr包含互补决定区(cdr)lcdr1、lcdr2、和lcdr3，并且hcvr包含cdr hcdr1、hcdr2、和hcdr3，其中lcdr1具有seq id no:1的氨基序列，hcdr1具有seq id no:4的氨基序列，并且hcdr2具有seq id no:5的氨基序列。
[0085]
在一个实施例中，dkk1抗体包含具有seq id no:1的氨基序列的lcdr1、具有seq id no:2的氨基序列的lcdr2、具有seq id no:3的氨基序列的lcdr3、具有seq id no:4的氨基序列的hcdr1、具有seq id no:5的氨基序列的hcdr2、以及具有seq id no:6的氨基序列的hcdr3。
[0086]
在另一实施例中，dkk1抗体包含具有seq id no:7的氨基酸序列的lcvr和具有seq id no:8的氨基酸序列的hcvr。在特定的实施例中，该lcvr包含seq id no:11的氨基酸序列并且该hcvr包含seq id no:12的氨基酸序列。
[0087]
在另外的实施例中，dkk1抗体包含具有seq id no:17的氨基酸序列的重链(hc)和具有seq id no:18的氨基酸序列的轻链(lc)。分别包含seq id no:17和seq id no:18的hc和lc氨基酸序列的dkk1抗体或其抗原结合片段在本文中称为dkn-01。特别地，dkn-01具有分子/经验式c
6394 h
9810 n
1698 o
2012 s
42
，并且分子量为144015道尔顿(完整)。
[0088]
在某些实施例中，本文披露的dkk1抗体是igg4抗体，其具有针对人dkk1的中和活性，该人dkk1包含seq id no:22中所示的序列或其片段。例如，经典wnt信号传导对成骨细胞分化和活性很重要。wnt-3a与bmp-4组合诱导多能小鼠c2c12细胞分化为成骨细胞，具有可测量的碱性磷酸酶(“ap”)(成骨细胞活性的标志物)终点。dkk1(经典wnt信号传导的抑制剂)抑制ap的分化和产生。中和dkk1抗体预防dkk1介导的ap的抑制。阻断dkk1抑制活性的抗体预防ap活性的丧失(参见美国专利号8,148,498)。在特定的实施例中，具有中和活性的dkk1抗体是dkn-01，其是igg4抗体。
[0089]
本文披露的dkk1抗体具有对dkk1(例如，人dkk1，seq id no:22)的高亲和力(kd)，如美国专利号8,148,498中所述。例如，本发明的dkk1抗体在37℃下具有0.5x10-12
m与3.0x10-11
m之间的kd。
[0090]
帕博利珠单抗
[0091]
帕博利珠单抗是一种强效的人源化igg
4 mab，其与程序性细胞死亡1(pd-1)受体结合的特异性高，从而抑制程序性细胞死亡1(pd-1)受体与程序性细胞死亡配体1(pd-l1)和程序性细胞死亡配体2(pd-l2)的相互作用。基于临床前体外数据，帕博利珠单抗对pd-1具有高亲和力和强效的受体阻断活性。帕博利珠单抗具有可接受的临床前安全特性，并且在临床开发中作为晚期恶性肿瘤的iv免疫疗法。帕博利珠单抗以其商品名keytruda
tm
为人所知，其适用于治疗多种适应症的患者。此外，帕博利珠单抗正在患有胃肠道癌症(包括食道癌)的患者中进行研究。尽管是初步的，但在患有食管癌的患者中已经看到有前景的发现(bilgin等人targeting the pd-1pathway:a new hope for gastrointestinal cancers[靶向pd-1通路：胃肠道癌症的新希望].curr med res opin[当前医学研究和意见].2017；33(4):749-759.；iams等人neoadjuvant treatment for locally invasive esophageal cancer[局部侵袭性食道癌的新辅助治疗].world j surg[世界外科杂志].2017年3月7日[先于印刷的电子出版]；chau等人interim safety and clinical activity in patients(pts)with advanced gastric or gastroesophageal junction(g/gej)adenocarcinoma from a multicohort phase 1study of ramucirumab(r)plus pembrolizumab(p)[雷莫芦单抗(r)加帕博利珠单抗(p)的多队列1期研究中患有晚期胃或胃食道连接(g/gej)腺癌的患者(pt)的中期安全性和临床活性].j clin oncol[临床肿瘤学杂志].35,2017(增刊4s；摘要102))。2017年5月，帕博利珠单抗被批准用于任何具有某些遗传特性的不可切除的或转移的实体瘤，而不考虑肿瘤的组织类型或部位。2017年9月，帕博利珠单抗被批准用于在患有复发的局部晚期或转移的胃癌或胃食道连接腺癌(其肿瘤表达pd-l1)的患者中治疗癌症。
[0092]
具有导致dna错配修复、通常会导致微卫星不稳定性的突变的肿瘤往往生成许多可作为肿瘤抗原的突变蛋白；帕博利珠单抗似乎通过预防自我检查点系统阻断清除来促进免疫系统清除任何这种肿瘤。
[0093]
如本文所用，术语“紫杉烷”包括紫杉醇、多西紫杉醇、卡巴他赛(carbazitaxel)、以及它们具有抗肿瘤特性的衍生物。例如，“紫杉醇”包括天然衍生的和化学合成的紫杉醇二者。紫杉醇以出售。适合于本文所述的本发明的衍生化紫杉醇包括脱氧紫杉醇化合物，如美国专利号5,440,056中描述的那些、结合白蛋白的紫杉醇(abraxane)、dha紫杉醇和pg紫杉醇。紫杉醇及其衍生物的化学式是本领域已知并描述的。其他紫杉烷化合物披露于"synthesis and anticancer activity of taxol other derivatives[紫杉醇其他衍生物的合成及抗癌活性]"d.g.i.kingston等人,studies in organic chemistry[有机化学研究],第26卷,标题为“new trends in natural products chemistry[天然产物化学的新趋势]”(1986),atta-ur-rabman,p.w.le quesne编辑.(elvesier,阿姆斯特丹1986),第219-235页。还参见例如，美国专利号5,569,729、5,565,478、5,530,020、5,527,924、5,508,447、5,489,589、5,488,116、5,484,809、5,478,854、5,478,736、5,475,120、5,468,769、5,461,169、5,440,057、5,422,364、5,411,984、5,405,972、和5,296,506。术语“多
西紫杉醇”包括天然衍生的和化学合成的紫杉醇二者。多西紫杉醇以出售。
[0094]
施用模式
[0095]
用于本发明方法或组合物的dkk1抗体和与dkk1抗体组合使用的其他治疗剂(例如，帕博利珠单抗、紫杉醇、顺铂、吉西他滨等)可以配制用于肠胃外、口服、经皮、舌下、口腔、直肠、鼻内、支气管内或肺内施用。
[0096]
对于肠胃外施用，用于本发明方法或组合物的化合物可以被配制用于注射或输注，例如静脉内、肌内或皮下注射或输注，或用于以推注剂量和/或输注(例如，连续输注)形式施用。可以使用任选地含有其他配制剂(如悬浮剂、稳定剂和/或分散剂)的在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液。
[0097]
对于口服施用，这些化合物可以呈由常规手段用药学上可接受的赋形剂制备的片剂或胶囊的形式，这些赋形剂如粘合剂(例如，聚乙烯吡咯烷酮或羟丙基甲基纤维素)；填充剂(例如，乳糖、微晶纤维素或磷酸钙)；润滑剂(例如，硬脂酸镁、滑石或二氧化硅)；崩解剂(例如，羟基乙酸淀粉钠)；或润湿剂(例如，十二烷基硫酸钠)。如果希望，则可以使用适合的方法包衣片剂。用于口服施用的液体制剂可以呈溶液、糖浆或悬浮液的形式。液体制剂可以通过常规手段用药学上可接受的添加剂制备，这些添加剂如悬浮剂(例如，山梨糖醇糖浆、甲基纤维素或氢化可食用脂肪)；乳化剂(例如，卵磷脂或阿拉伯胶)；非水性媒介物(例如，杏仁油、油性酯或乙醇)；和防腐剂(例如，对羟基苯甲酸甲酯或丙酯或山梨酸)。
[0098]
对于口腔施用，用于本发明方法或组合物的化合物可以呈以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
[0099]
对于直肠施用，用于本发明方法或组合物的化合物可以呈栓剂形式。
[0100]
对于舌下施用，片剂可以以常规方式配制。
[0101]
对于鼻内、支气管内或肺内施用，可以采用常规配制品。
[0102]
此外，用于本发明方法或组合物的化合物可以被配制成持续释放的制剂。例如，化合物可以与向活性剂化合物提供持续和/或控制释放特性的适合聚合物或疏水材料一起配制。因此，用于本发明方法的化合物可以以微粒的形式例如通过注射或以圆片或圆盘的形式通过植入施用。配制控制释放药物制剂的各种方法是本领域已知的。
[0103]
可用于实施本文所述方法的本发明化合物(例如，dkk1抗体单独或与一种或多种额外的治疗剂组合)或其药学上可接受的盐或包含一种或多种化合物(或其药用盐)的组合物的施用可以是连续的、每小时的、每日四次、每日三次、每日两次、每日一次、每隔一天一次、每周两次、每周一次、每两周一次、每月一次、或每两个月一次、或更长时间、或一些其他间歇性给药方案。
[0104]
化合物或包含一种或多种本发明化合物(或其药用盐)的组合物的施用实例包括外周施用。外周施用的实例包括口服、皮下、腹膜内、肌内、静脉内、直肠、经皮、或鼻内施用形式。
[0105]
如本文所用，外周施用包括化合物或包含本发明化合物的组合物的所有施用形式，其排除颅内施用。外周施用的实例包括但不限于口服、肠胃外(例如，肌内、腹膜内、静脉内或皮下注射，延长释放、缓释植入物、贮库等)，鼻、阴道、直肠、舌下或局部施用途径，包括经皮贴剂应用等。
[0106]
组合疗法
[0107]
用于本发明方法或组合物的dkk1抗体和一种或多种第二治疗剂(例如，帕博利珠单抗、紫杉醇、顺铂、吉西他滨等)可以分开或组合配制用于肠胃外、口服、经皮、舌下、口腔、直肠、鼻内、支气管内或肺内施用。
[0108]
本文披露的dkk1抗体可用于与帕博利珠单抗组合用于治疗食道胃癌(例如食道癌或胃腺癌)。这种组合施用可以通过包括dkk1抗体和帕博利珠单抗的单一剂型，这种单一剂型包括片剂、胶囊、喷雾、吸入粉末、可注射液体等。除单一剂型之外，组合施用可以包含另外额外的药剂(例如，化学治疗剂)。可替代地，组合施用可以通过施用两种不同的剂型，其中一种剂型含有dkk1抗体，并且另一种剂型包括第二量的帕博利珠单抗。在这种情况下，剂型可以相同或不同。不希望限制组合疗法，以下举例说明可以采用的某些组合疗法。应理解，超出所需的第二量的帕博利珠单抗的额外的化学治疗剂可以用于本文所述的方法中。
[0109]
可以在施用dkk1抗体之前、同时、或之后施用第二量的帕博利珠单抗。因此，dkk1抗体和帕博利珠单抗可以在单一配制品中一起施用，或者可以在分开的配制品中施用，例如同时或顺序施用，或二者。例如，如果dkk1抗体和帕博利珠单抗在分开的组合物中顺序施用，则dkk1抗体可以在帕博利珠单抗之前或之后施用。本领域普通技术人员将容易地确定施用dkk1抗体与第二量的帕博利珠单抗之间的持续时间。在某些实施例中，dkk1抗体可以立即在帕博利珠单抗之前或之后，或者在技术人员认为适当的一段时间之后。
[0110]
此外，dkk1抗体和第二量的帕博利珠单抗可以或可以不以类似的给药方案施用。例如，dkk1抗体和帕博利珠单抗可以具有不同的半衰期和/或在不同的时间尺度上起作用，使得dkk1抗体以大于帕博利珠单抗的频率施用，或反之亦然。例如，dkk1抗体和帕博利珠单抗可以在一天内一起施用(例如，以单一剂量或顺序施用)，随后一定天数后仅施用化学治疗剂(或不同的化学治疗剂)。施用治疗剂之间的天数可以根据每种药物的安全性、药代动力学和药效学适当地确定。dkk1抗体或帕博利珠单抗可以短期或长期施用。
[0111]
在特定的实施例中，dkn-01和帕博利珠单抗的组合治疗的治疗时间段为21天周期，该周期可以重复直到确定患者不会从组合疗法中获得任何临床益处。例如，患者可以经历大约一个周期至约30个周期的治疗(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、7、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)。在另一实施例中，受试者正在治疗妇科癌症。治疗包含在本文所述的临床试验之后组合施用dkk1抗体(如dkn-01)和紫杉醇。
[0112]
如本文所用，“有效量”是指治疗上或预防上足以治疗靶障碍的治疗剂或治疗剂的组合的量。有效量将取决于患者的年龄、性别、和体重、患者的当前医疗状况以及所治疗的食道或胃癌的性质。本领域技术人员将能够根据这些和其他因素确定适当的剂量。
[0113]
在示例实施例中，有需要的受试者接受单一疗法(即，正在施用第一量的第一治疗剂)，使得第一治疗剂的第一量是有效量。在另一示例实施例中，有需要的受试者接受组合疗法(例如，正在施用第一量的第一治疗剂和第二量的第二治疗剂)，使得组合的第一量和第二量是有效量。在另外的实施例中，组合疗法可以采用第三量的第三治疗剂，使得组合的第一量、第二量和第三量是有效量。
[0114]
通过共同施用第一量的dkk1抗体(或其药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物)和第二量的帕博利珠单抗，可以在本发明方法或组合物中实现有效量。在一个实施例中，dkk1抗体和帕博利珠单抗各自以相应的有效量(例如，各自以若单独施用将为治疗有效的量)施
用。在另一实施例中，dkk1抗体和帕博利珠单抗各自以单独不会提供治疗效果的量(次治疗剂量)施用。在又另一实施例中，dkk1抗体可以有效量施用，而帕博利珠单抗以次治疗剂量施用。在仍另一实施例中，dkk1抗体可以次治疗剂量施用，而帕博利珠单抗以有效量施用。
[0115]
对于dkk1抗体，每次施用的适合剂量包括以下的剂量：约或大于约15mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约100mg、约150mg、约200mg、约300mg、约400mg、约500mg、约600mg、约625mg、约650mg、约675mg、约700mg、约725mg、约750mg、约775mg、约800mg、约825mg、约850mg、约875mg、约900mg、约925mg、约950mg、约975mg、约1000mg、约1025mg、约1050mg、约1075mg、约1100mg、约1125mg、约1150mg、约1175mg、约1200mg、约1225mg、约1250mg、约1275mg、约1300mg、约1325mg、约1350mg、约1375mg、约1400mg、约1425mg、约1450mg、约1475mg、约1500mg、约1525mg、约1550mg、约1575mg、约1600mg、约1625mg、约1650mg、约1675mg、约1700mg、约1725mg、约1750mg、约1775mg、约1800mg、约1825mg、约1850mg、约1875mg、约1900mg、约1925mg、约1950mg、约1975mg、约2000mg、约2025mg、约2050mg、约2075mg、约2100mg、约2125mg、约2150mg、约2175mg、约2200mg、约2225mg、约2250mg、约2275mg、约2300mg、约2325mg、约2350mg、约2375mg、约2400mg、约2425mg、约2450mg、约2475mg、约2500mg、约2525mg、约2550mg、约2575mg、约2600mg、或约3,000mg。每种适合的剂量可以在技术人员认为合适的时间段内施用。例如，每种适合的剂量可以在约30分钟至长达约1小时、约2小时、约3小时、约4小时、约5小时、约6小时、约7小时、或约8小时的时间段内施用。在具体的实施例中，dkk1抗体(例如，dkn-01)的适合剂量可以从约50mg至约300mg(如50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg或300mg)。选择的剂量可以在约30分钟至约2小时的时间段内静脉内施用。在特定的实施例中，dkk1抗体的适合剂量可以是在约30分钟至长达约2小时的时间段内施用约150mg。dkk1抗体的另一适合剂量可以是在约30分钟至长达约2小时的时间段内施用约300mg。这些剂量在所叙述的时间段内的施用可以使用静脉内途径完成。
[0116]
对于帕博利珠单抗，每次施用的适合剂量可以基于标记上找到的推荐剂量来确定。例如，每次施用帕博利珠单抗的适合剂量是在至少30分钟的时间段内静脉内从约50mg至约200mg。该施用可以每三周重复。在特定的实施例中，每次施用的适合剂量是使用静脉内途径在30分钟输注时间段内约200mg。该剂量施用可以每三周重复。帕博利珠单抗的其他适合剂量包括2mg/kg q3w(每三周)、10mg/kg q3w(每三周)、和10mg/kg q2w(每两周)。在特定的实施例中，帕博利珠单抗的剂量为静脉内200mg。在一个方面，该200mg在30分钟内施用。
[0117]
对于紫杉烷(例如，紫杉醇)，每次施用的适合剂量可以基于标记上找到的推荐剂量来确定。例如，每次施用紫杉醇的适合剂量是从约200mg/m2至约20mg/m2。在特定的实施例中，紫杉醇的剂量为80mg/m2。紫杉烷(例如，紫杉醇)可以静脉内施用。静脉内施用可以在约一小时内。
[0118]
对于吉西他滨，每次施用的适合剂量可以基于标记上找到的推荐剂量来确定。例如，每次施用吉西他滨的适合剂量是从约2000mg/m2至约500mg/m2。在特定的实施例中，吉西他滨的剂量为1000mg/m2。
[0119]
对于顺铂，每次施用的适合剂量可以基于标记上找到的推荐剂量来确定。例如，每次施用顺铂的适合剂量是从约10mg/m2至约40mg/m2。在特定的实施例中，顺铂的剂量为
20mg/m2。
[0120]
如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，优选人，但也可以意指需要兽医治疗的动物，例如伴侣动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、羊、猪、马等)和实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。在特定的实施例中，受试者之前已接受过抗pd-1/pd-l1单克隆抗体(例如，帕博利珠单抗、纳武单抗、阿替利珠单抗、得瓦鲁单抗或阿维单抗)治疗，并且受试者的疾病对这种先前的治疗是难治性的。
[0121]
如本文所用，“治疗”包括实现、部分或基本上延迟、抑制或预防与食道癌或胃腺癌相关的临床适应症的进展。例如，“治疗”包括如通过本领域已知的标准成像方法(包括例如计算机断层摄影(ct)扫描、磁共振成像(mri)、胸部x光、和ct/正电子发射断层摄影(ct/pet)扫描)检测并根据本领域已知的指南和方法进行评价的肿瘤生长减少或进一步生长的预防。例如，可以通过实体瘤响应评价标准(recist)(修订的recist指南版本1.1；参见eisenhauer等人,eur.j.cancer[欧洲癌症杂志]45(2):228-47,2009)评价对治疗的响应。因此，在一些实施例中，“治疗”是指完全响应(cr)，其根据recist指南定义为所有靶病灶的消失；或部分响应(pr)，其定义为以基线总直径为参考，靶病灶直径总和减少至少30％。用于评价肿瘤对治疗的响应的其他手段包括评价肿瘤标志物和评价表现状态(例如，assessment of creatinine clearance[评估肌酐清除率]；参见cockcroft和gault,nephron[肾元].16:31-41,1976)。
[0122]
药物组合物
[0123]
dkk1抗体和帕博利珠单抗可以掺入适合于施用的药物组合物中。此类组合物典型地包含任意组合的抗体、或帕博利珠单抗、或一种或多种额外的化学治疗剂，和药学上可接受的载体。如本文所用，表达“药学上可接受的载体”旨在包括与药物施用可相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。用于药学活性物质的此类介质和试剂的使用是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑在组合物中使用它们。
[0124]
将本发明药物组合物配制成与预期的施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外，例如静脉内、真皮内、皮下、口服(例如，吸入)、经皮(局部)、经粘膜、和直肠施用。用于肠胃外、真皮内或皮下应用的溶液或悬浮液可以包括以下组分：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌剂，如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲液，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐以及用于调节张度的试剂，如氯化钠或右旋糖。可用酸或碱(如盐酸或氢氧化钠)调节ph。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。
[0125]
适合于可注射使用的药物组合物包括无菌水性溶液(在水溶性的情况下)或分散体以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。对于静脉内施用，适合的载体包括生理盐水、抑菌水、cremophor el(tm)(巴斯夫公司(basf)，新泽西州派西派尼市(parsippany，n.j.))或磷酸盐缓冲盐水(pbs)。在所有情况下，该组合物必须是无菌的并且应当具有达到容易注射的程度的流动性。它在制造和储存条件下必须是稳定的并且必须防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。该载体可以是含有以下物质的溶剂或分散介质：例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)，及其适合的混合物。可以例如
通过使用如卵磷脂的包衣、通过在分散体的情况下保持所需粒度以及通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。预防微生物的作用可以通过各种抗细菌剂和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)来实现。在许多情况下，将优选在组合物中包括等渗剂，例如糖、多元醇(如甘露醇、山梨醇)、氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射组合物的延长吸收。
[0126]
按照需要，可以通过将活性化合物(例如，dkk1抗体单独或与帕博利珠单抗组合，dkk1抗体与紫杉醇组合，dkk1抗体与吉西他滨和顺铂组合)以需要的量掺入具有以上列举成分中的一种或组合的适当溶剂中，随后进行无菌过滤来制备无菌可注射溶液。通常，分散体通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，这些方法从其先前的无菌过滤溶液中产生活性成分和任何额外的所希望的成分的粉末。
[0127]
口服组合物通常包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以被封装在明胶胶囊中或被压成片剂。出于口服治疗性施用的目的，可以将活性化合物随赋形剂一起掺入并且以片剂、糖锭剂、或胶囊剂的形式使用。口服组合物也可以使用用作漱口水的流体载体来制备，其中将在流体载体中的化合物口服应用并且漱口(swished)并且吐出或吞咽。可以包括药学上相容的粘合剂和/或佐剂材料作为组合物的一部分。片剂、丸剂、胶囊、糖锭剂等可以含有以下成分中的任一种或具有类似性质的化合物：粘合剂，如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如海藻酸、primogel或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或sterotes；助流剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或调味剂，如薄荷、水杨酸甲酯、或橙味调味剂。
[0128]
对于通过吸入施用，化合物以气溶胶喷雾形式递送，该气溶胶喷雾来自压力容器或含有适合的推进剂(例如，气体，如二氧化碳)的分配器，或雾化器。
[0129]
也可以通过经粘膜或经皮的方式进行全身施用。对于经粘膜或经皮施用，在该配制品中使用适于待渗透的屏障的渗透剂。此类渗透剂通常是本技术领域熟知的，并且对于经粘膜施用，包括例如洗涤剂、胆汁盐、和夫西地酸衍生物。经粘膜施用可通过使用鼻喷雾剂或栓剂来完成。
[0130]
对于经皮施用，将活性化合物配制成如本领域中通常已知的软膏剂、油膏剂、凝胶剂或霜剂。
[0131]
化合物还可以被制备成栓剂(例如，利用常规的栓剂基质，如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂形式供直肠递送。
[0132]
在一个实施例中，将这些活性化合物与保护化合物免于从体内快速消除的载体一起制备，如控制释放配制品，包括植入物和微囊化的递送系统。可以使用可生物降解、生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、和聚乳酸。用于制备此类配制品的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。这些材料也可以从阿尔扎公司(alza corporation)和新星制药有限公司(nova pharmaceuticals,inc.)商购获得。脂质体悬浮液(包括以抗病毒抗原的单克隆抗体靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法制备，例如，如在美国专利号4,522,811中所述。
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[0175]
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[0176]
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[0177]
人dkk1氨基酸序列
[0178]
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[0179]
举例说明
[0180]
临床试验的描述
[0181]
下文详细讨论的数据来自三项单独的临床试验。这三项单独的临床试验通过正在治疗的癌症的类型进行区分。这三项试验旨在治疗食道胃癌、妇科癌症和胆道癌。在每项研究中，患者施用300mg的dkn-01，例外是两名患者接受单独的或与至少一种额外的治疗剂组合的150mg的dkn-01。下文详细讨论了每项研究。
[0182]
食道胃癌
[0183]
受试者：具有组织学证实的复发的或转移的食道或胃食道连接(gej)或胃腺癌的男性和女性患者。
[0184]
治疗方案：a)组合疗法-dkn-01和紫杉醇，28天周期：根据标准临床实践，在每个周期的第1天和第15天在最短30分钟以及最长2小时内不间断地iv施用300mg的dkn-01，并且在第1、8、15和22天在1小时内iv施用紫杉醇。首先施用dkn-01，随后是紫杉醇。dkn-01的剂量为300mg。紫杉醇的剂量为80mg/m2。b)组合疗法-dkn-01和帕博利珠单抗，21天周期：根据标准临床实践，在每个周期的第1天和第15天在最短30分钟以及最长2小时内不间断地iv施用300mg的dkn-01，并且在每个周期的第1天在30分钟内iv施用帕博利珠单抗。两名患者接受150mg dkn-01。首先施用dkn-01，随后是帕博利珠单抗。c)单一疗法-dkn-01，28天周期：在每个周期的第1天和第15天在最短30分钟以及最长2小时内iv施用300mg的dkn-01。
[0185]
患者参与研究的持续时间包括筛选时间段、治疗时间段(21天周期或28天周期，如上所述)和随访时间段。对于随访时间段，计划在研究治疗的末次剂量后30天内进行访视。患者在该访视时进行身体检查、伴随药物审查、ecog ps、生命体征、临床安全性实验室测试、血清妊娠测试、12导联ecg、实体瘤测量和放射学评估。将用于药代动力学和药效学评价的单个血液样品作为随机样品采集。停止研究治疗后的长期随访，对不具有进展性疾病的患者按照常规临床实践每12周继续监测，包括评价肿瘤响应，直至使用recist v1.1指南的疾病进展、死亡或直至研究结束。疗效评价：
[0186]
组合疗法的抗肿瘤活性如下获得。
[0187]
通过用于肿瘤测量的一项或多项以下的放射学测试评估每名患者：
[0188]
·
计算机断层摄影(ct)扫描
[0189]
·
mri
[0190]
·
胸部x光
[0191]
·
ct/正电子发射断层摄影(ct/pet)扫描(在可行的情况下，在整个研究中使用的优选成像模式是ct/pet扫描)。
[0192]
在周期3开始之前以及之后的每个奇数周期对一个或多个实体瘤进行基线放射学评估并重复，以使用recist v.1.1(修订的recist指南版本1.1；eisenhauer等人2009)评价肿瘤响应和进展。对于接受dkn-01和帕博利珠单抗组合疗法的患者，在一些情况下使用免疫相关响应标准(irecist)评估肿瘤响应和进展(参见seymour l,bogaerts j,perrone a等人irecist:guidelines for resonse criteria for use in trials testing immunotherapeutics[irecist：在测试免疫治疗剂中使用的响应标准指南].lancet oncol[柳叶刀肿瘤学]2017；18(3):e143-e152)。
[0193]
根据recist v.1.1如下表征靶病灶的评价：
[0194]
完全响应(cr)：所有靶病灶消失。任何病理学淋巴结(无论是靶还是非靶)必须具有《10mm的短轴减小。肿瘤标志物结果必须已归一化。
[0195]
部分响应(pr)：以基线总直径为参考，靶病灶的直径总和减少至少30％。
[0196]
进展性疾病(pd)：以研究时的最小总和(包括最小情况下的基线总和)为参考，靶病灶的直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加之外，总和还必须展示出至少5mm的绝对增加。一个或多个新病灶的出现也被认为是进展。
[0197]
稳定疾病(sd)：以研究时的最小总直径为参考，既没有足够的缩小以符合pr，又没有足够的增加以符合pd。
[0198]
不可评价(ne)：当对靶病灶进行不完全的放射学评估或测量方法与基线相比发生变化时。(ne也可以指未进行/缺失。)
[0199]
妇科癌症
[0200]
受试者：具有上皮性子宫内膜癌(eec)和上皮性卵巢癌(eoc)的女性患者。eec患者必须具有组织学证实的复发之前治疗的eec的诊断(通过初次手术标本或复发活检)。eoc患者必须具有组织学证实的复发的铂抗性/难治性eoc、原发性腹膜或输卵管癌(即，在完成基于铂的化疗的6个月内疾病复发或在基于铂的化疗期间进展)的诊断(通过初次手术标本或复发活检)。
[0201]
治疗方案：a)dkn-01单一疗法-28天周期：在28天周期的第1天和第15天300mg dkn-01。在最短30分钟以及最长2小时内静脉内施用dkn-01。b)组合疗法-dkn-01和紫杉醇，28天周期：300mg的dkn-01以及80mg/m2。在28天周期的第1天和第15天在最短30分钟以及最长2小时内静脉内施用300mg的dkn-01。根据标准临床实践，在每个28天周期的第1、8和15天，在1小时内静脉内施用紫杉醇。在每个周期的第1天和第15天，作为单独的输注，首先施用dkn-01，随后是紫杉醇。
[0202]
患者参与研究的持续时间包括筛选时间段、治疗时间段和随访时间段。对于随访时间段，计划在治疗时间段的末次治疗施用后30天内进行访视。在停止进展性疾病的治疗和放射照相记录后，将在生存随访期对所有患者进行生存的随访，直至死亡、撤回同意、随访丢失、或研究结束。治疗访视结束后，将每年4次(每3个月)进行生存随访。
[0203]
疗效评价：
[0204]
每项研究的主要疗效终点是客观相应率(orr)，如通过使用实体瘤响应评价标准版本1.1(recist 1.1)评估的(eisenhauer ea,therasse p,bogaerts j.等人new response evaluation criteria in solid tumours:revised recist guideline[新实体瘤响应评价标准：修订的recist指南](版本1.1).eur j cancer[欧洲癌症杂志].2009；45(2):228-247。orr是完全响应[cr] 部分响应[pr]的最佳总体响应[bor])。
[0205]
每项研究的次要疗效终点是：a)如使用recist 1.1评估的客观疾病控制率(odcr)。odcr是cr pr 稳定[sd]》6周(cr＝完全响应并且pr＝部分响应)；b)os(总体生存期)，定义为从首次研究药物给药至任何原因的死亡的时间；c)pfs(无进展生存期)，定义为从首次研究药物给药至首次放射学记录的如使用recist 1.1确定的进展性疾病(pd)或任何原因导致的死亡的时间。d)ttp，定义为从首次研究药物给药直到首次放射学记录的如使用recist 1.1确定的进展性疾病的日期的时间；e)dor(响应的持续时间)，定义为从初始响应(≥pr)直到放射学记录的pd或死亡
的时间；pd使用recist 1.1定义；f)docr(完全响应的持续时间)，定义为从初始cr直到放射学记录的pd或死亡的时间；pd使用recist 1.1定义；g)docb(临床受益的持续时间)，定义为从cr、pr或sd的首次肿瘤评估至如使用recist 1.1确定的pd时或因任何原因导致的死亡的时间；以及h)tttf，定义为从首次研究药物给药直到出于任何原因(包括pd、毒性、和死亡)而停止dkn-01的日期的时间。
[0206]
胆道癌
[0207]
受试者：具有组织学或细胞学记录的原发于肝内或肝外胆系统或胆囊的癌的男性和女性患者，这些患者具有不可切除的、局部晚期或转移的疾病的临床和/或放射学证据。
[0208]
治疗方案：组合疗法-dkn-01、吉西他滨和顺铂，21天周期：在21天周期的第1天和第8天在最短30分钟以及最长2小时内不间断地iv施用300mg的dkn-01。在第1天和第8天，根据标准临床实践经由iv输注施用顺铂和吉西他滨。施用25mg/m2的顺铂和1000mg/m2的吉西他滨。
[0209]
患者参与研究的持续时间包括筛选时间段、由21天周期组成的治疗时间段和治疗后时间段。在完成治疗时间段后，按照临床实践(如果患者因与进行性疾病无关的原因而停止研究药物)经由临床访视或电话对患者进行生存的随访直至死亡或研究结束。使用recist标准继续评价停止研究治疗而没有记录疾病进展的患者，直到疾病进展、死亡、或研究结束。
[0210]
疗效评价：
[0211]
允许用于在患有晚期实体恶性肿瘤的患者中确定可测量的疾病的护理标准放射成像(例如，计算机断层摄影扫描[ct]、磁共振成像[mri])。在周期3开始之前以及之后的每个奇数周期(周期开始的3天内)对实体瘤进行基线放射学评估并重复，以使用recist标准评价肿瘤响应。患者应在整个研究中(在基线处和在后续的评估处)使用相同的放射成像模式，以提供放射学评估的一致性。如果发现有响应，则需要在最少4周后进行后续的放射学评估以确认响应。
[0212]
对治疗的临床响应基于实体瘤的recist 1.1标准。将进行以下评价：至首次和最佳响应时间、客观响应率(orr)、无进展生存期(pfs)、响应的持续时间(dor)和总体生存期(os)。实例
[0213]
实例1：基于的h评分和％阳性值的确定
[0214]
本文所述的分析中采用的h评分如下获得。
[0215]
使用徕卡生物系统公司(leica biosystems)的bond rx平台(ls)上的2.5ls或2.5lsx红试剂盒(acd)进行单重自动化rnascope测定。随后进行预处理，包括靶标修复(使用徕卡表位修复缓冲液2在95℃下15min)和在40℃下蛋白酶iii处理15min。然后将探针在42℃下杂交2h，随后进行rnascope特异性扩增。然后使用bond聚合物精制红检测试剂盒进行显色检测。rnascope探针设计之前已经描述过。本研究中使用了以下acd rnascope探针：hs-dkk1(目录号421418)、hs-ppib(目录号313908)和dapb(目录号312038)。载玻片在徕卡仪器上使用苏木精复染，并离线进行复染的蓝化。染色被观察为点状红点。使用带有40x物
镜的来自徕卡的at2扫描仪对载玻片进行成像。
[0216]
用对适度表达的管家基因ppib具有特异性的探针对每个样品进行rna完整性的质量控制，并用对细菌dapb rna具有特异性的探针对背景进行质量控制。对于对照探针，应用半定量评分标准来评估rna完整性和背景染色。由acd的有资格的科学家进行视觉(手动)评分。基于以下情况为每个对照探针分配0-4的评分：
·
评分0＝无染色或《1个点/10个细胞
·
评分1＝1-3个点/细胞
·
评分2＝4-9个点/细胞，无或非常少点聚簇
·
评分3＝10-15个点/细胞和/或《10％的点聚簇
·
评分4＝》15个点/细胞和/或》10％的点聚簇
[0217]
如果满足以下标准，则样品被视为质量控制(qc)通过：1)ppib评分≥2，整个样品中阳性对照信号相对均匀，指示rna完整性。2)dapb评分《1，指示背景信号最小。
[0218]
来自dkk1染色的活检载玻片的扫描载玻片图像由兽医病理学家审查，并使用qupath开源形态测量分析程序(bankhead,p.等人qupath:open source software for digital pathology image analysis[qupath：用于数字病理图像分析的开源软件].sci rep[科学报告]7,16878,doi:10.1038/s41598-017-17204-5(2017)；通过引用并入本文)分析。含有肿瘤的组织的一个或多个区域被鉴别为目的区域(roi)。dkk1 mrna表达的水平如下计算。
[0219]
每个肿瘤细胞的dkk1 mrna表达被分配至以下区间(bin)中
·
区间0＝0个点/细胞
·
区间1＝1-3个点/细胞
·
区间2＝4-9个点/细胞
·
区间3＝10 个点/细胞
[0220]
对于h评分确定，在所有肿瘤细胞被分配评分后，使用区间0、区间1、区间2或区间3中的百分比评分来计算h评分：h评分＝(％区间3x3) (％区间2x2) (％区间1x1) (％区间0x0)
[0221]
通过该计算，h评分可以在0至300的范围内。
[0222]
对于％阳性确定，在所有肿瘤细胞被分配评分后，阳性肿瘤细胞的百分比通过将具有染色的总肿瘤细胞相加来确定。这可以通过相加(区间1 区间2 区间3)并除以肿瘤细胞的总数(区间0 区间1 区间2 区间3)或通过对所有分配为“阳性”(例如，通过检测至少一个单个染色点)的细胞计数并将该数目除以肿瘤细胞的总数进行。％阳性的范围可以从0至100。
[0223]
对于h评分确定，如果qupath软件不能鉴定肿瘤细胞，则使用与如上所述相同的h评分公式，通过估计区间1、区间2和区间3中的细胞的百分比来手动分析载玻片。
[0224]
对于％阳性确定，如果qupath软件不能鉴定肿瘤细胞，则通过估计区间1、区间2和区间3中的细胞的百分比来手动分析载玻片。通过将区间1、区间2和区间3中的细胞的估计百分比相加来计算％阳性。
[0225]
实例2：dkk1表达h评分和临床结果相关
[0226]
1.具有在最高三分位数的h评分的患者具有较长的无进展生存期
[0227]
在这项研究中，从总共134名患者中收集了rnascope数据，这些患者在各种适应症和额外的组合中以300mg dkn-01进行治疗。数据是基于上述临床研究获得的。简言之，研究p102涉及67名患有食道胃癌的患者(这些患者评估了肿瘤dkk1 mrna表达)，其中57名患者通过dkn-01/keytruda的组合治疗。在这57名患者中，31名患者经诊断患有胃食道连接癌并且是免疫治疗初治的(即之前未通过keytruda或其他抗pd-1/抗pd-l1抗体进行治疗过)。研究p204涉及54名患有妇科癌症的患者(这些患者评估了肿瘤dkk1 mrna表达)：32名诊断患有子宫内膜癌(eec/上皮性子宫内膜癌)的患者和22名诊断患有卵巢癌(eoc/上皮性卵巢癌)的患者。研究p103涉及13名患有胆道癌(胆管癌)的患者。
[0228]
本研究中分析的134名患者的亚组在图1中以图形表示
[0229]
对整个134名患者池的统计分析表明，与具有在低三分位数或中三分位数组中的dkk1 h评分的患者相比，具有在最高三分位数中的h评分的患者具有更长的无进展生存期。这些结果图解显示于图2中。
[0230]
还计算了每个三分位数以及对癌症类型和一种或多种治疗剂进行调整的患者亚组的风险比(hr，具有“放射学进展”或因任何原因“死亡”的事件的风险)。这些结果图解显示于图3中。如可见的，在一般情况下以及当对癌症类型和一种或多种治疗剂调整时，具有在较高三分位数中的dkk1 h评分的患者与较低三分位数相比具有统计学上显著更长的pfs。(最右列的数字代表每个亚组的hr与参考亚组(按患者的dkk1 h评分的底部三分位数的患者)比较的p值。)
[0231]
2.具有高于最佳截止的h评分的患者具有较长的无进展生存期
[0232]
进一步表明了关于癌症患者组的dkk1 h评分存在最佳截止点(本文称为“最佳dkk1表达h评分”)，使得当对亚组中具有高于“最佳截止点”的h评分的患者施用dkk1抑制剂(例如dkn-01)时，如与具有等于或低于该“最佳截止点”值的患者的亚组相比，这些患者示出统计学上显著的无进展生存期(pfs)的改善。
[0233]
在第一种情况下，如上文所述，使用标准化对数秩统计量分析了上述134名癌症患者的池。
[0234]
发现存在对应于与生存结果(pfs)具有最显著关系的dkk1 h评分的值。汇集的组的dkk1 h评分的值为38。该dkk1 h评分的值对应于标准化对数秩统计量的最大值，并且是与较长pfs最显著相关的整个池的两个亚组之间的截止点。
[0235]
标准化对数秩统计量的这个最大值的存在图解显示在图4中。
[0236]
具有高于“最佳评分”的dkk1 h评分的患者的dkn-01治疗的有利临床结果(较长的pfs)进一步展示在图5中。图5是两个图的叠加。每个图代表pfs(表示为概率)作为时间的函数。一个图代表具有高于“最佳”评分38的dkk1 h评分的患者亚组，并且另一个图代表具有等于或低于“最佳”评分的dkk1 h评分的患者亚组。
[0237]
还计算了如与具有等于或低于“最佳”评分的h评分的患者亚组相比的具有高于“最佳”评分的h评分的患者组的风险比(hr，具有“放射学进展”或因任何原因“死亡”的事件的风险)。还计算了针对癌症类型和一种或多种治疗剂调整的患者亚组的hr。这些结果图解显示于图6中。如可见的，当针对癌症类型和一种或多种治疗剂调整时，具有高于“最佳”评分的dkk1 h评分的患者与等于或低于最佳评分的患者相比具有统计学上显著更低的hr。(最右列的数字代表每个亚组的hr与参考亚组(具有等于或低于“最佳”评分的dkk1 h评分
的患者亚组)比较的p值。)
[0238]
不同截止点的比较的表明最佳截止点具有最佳调整的风险比(hr)。这些结果图解呈现于图7中。如可见的，相对于由较高的三分位数或较高的四分位数定义的亚组，由高于“最佳截止点”的h评分定义的亚组具有最佳调整的hr。右列代表hr值并提供95％置信区间。
[0239]
3.不同癌症的最佳截止点的值相似
[0240]
发现当对由不同癌症定义的患者亚组进行统计分析时，即使在针对治疗方案和癌症类型调整之后，也得出相似的“最佳截止点”的值。
[0241]
具体地，发现高于38的dkk1 h评分与eec/eoc中较长的pfs相关。这些结果图解呈现于图8和图9中。图8示出了两个叠加的图，每个图代表eec/eoc患者的亚组的pfs(表示为概率)。一个亚组具有高于最佳截止点的dkk1 h评分，另一个亚组则等于或低于该最佳截止点。图9示出了代表eec/eoc患者的亚亚组的hr的表和图。如可见的，三个调整的亚组的hr值相似。右列代表hr值并提供95％置信区间。
[0242]
在另外的研究中，发现高于“最佳截止点”值38的dkk1h评分与gej/gc/ec患者的较长pfs相关。汇集了67名接受dkn-01单一疗法、或dkn-01与keytruda或紫杉醇的组合疗法的食道胃癌患者的数据。这些结果图解呈现于图10和图11中。
[0243]
图10示出了两个叠加的图，每个图代表gej/gc/ec患者的亚组的pfs(表示为概率)。一个亚组具有高于最佳截止点38的dkk1 h评分，另一个亚组则等于或低于该最佳截止点。图11示出了代表如参考图10讨论的相同的gej/gc/ec患者亚组的hr的表和图。如可见的，当针对癌症类型和治疗剂调整时，由高于“最佳截止点”的h评分定义的亚组与等于或低于最佳截止点的患者相比具有统计学上显著更低的hr。右列代表hr值并提供95％置信区间。
[0244]
4.用dkn-01和抗pd-1抗体治疗时，具有在最高三分位数中的h评分的gej/胃癌患者具有较长的无进展生存期
[0245]
在另外的研究中，在上面相对于图10和11描述的患者中，选择出31名患者(其中25名是可评价的)的亚组。这些患者患有胃-食道连接癌或胃癌，并且从未用免疫疗法治疗过(所谓的“io初治患者”)。如图12中呈现的条形图所指示，表现出部分响应的患者具有在较高的三分位数中的dkk1 h评分(此处，h评分为35及以上)，而展现出进行性疾病的大多数患者具有低于该较高三分位数的dkk1 h评分。
[0246]
对31名患者的亚组的无进展生存概率(pfs)分析指示，与具有低于较高三分位数的dkk1 h评分的患者(5.9周)相比，在dkk1 h评分(h评分为35或以上)的较高三分位数中的患者的中位pfs在22.2周时是统计学上有意义的更长。该分析的结果呈现于图13中。
[0247]
实例3：dkk1染色％阳性值与临床结果相关
[0248]
在另外的研究中，分析了如相对于图1所述的接受dkn-01单一疗法或者300mg dkn-01与第二药剂的组合的69名食道胃癌(egc)患者(加上接受150mg dkn-01和帕博利珠单抗的2名额外的患者)的rnascope数据。
[0249]
患者的pfs使用％阳性测量值确定。发现具有较高百分比的对dkk1染色阳性的肿瘤细胞的egc患者展现出增加的pfs。具体地，较高三分位数的患者(“dkk1高”，按rnascope至少26％的肿瘤细胞对dkk1染色呈阳性的那些)具有11.6周的中位生存期，而低于较高三分位数的患者具有6.0周的中位生存期，由对数秩(mantel-cox)检验进行的p值＝0.08。该
分析的结果(26％的截止值，对应于较高三分位数)图解呈现于图14a中。
[0250]
还计算了相同的69名患者的“最佳”截止值并生成了pfs图。
[0251]
简言之，首先计算所有潜在的截止点(最多等于分析中的样品的数目)的对数秩统计量。应用了hothorn和lausen(science direct working paper no s1574-0358(04)70152-5[科学直接工作论文编号s1574-0358(04)70152-5],2018年3月5日，在https://papers.ssrn.com/sol3/papers.cfm？abstract_id＝3133711处可获得)中描述的方法以选择截止点。这是通过使用无效假设下(h0：生存独立于连续变量中由截止点定义的组中的成员资格，此处：％阳性为正)对数秩统计量的精确分布计算p值的上限来完成的。
[0252]
此处，按％阳性测量的最佳截止值为23％。dkk1高患者(％阳性等于或高于23％)的中位生存期为11周(95％ci6.000-28.286)，dkk1低患者(％阳性低于23％)的中位生存期为6周(95％ci 5.857-8.714)。p值＝0.116。pfs图呈现在图14b中。
[0253]
在另外的研究中，使用dkk1表达的％阳性值分析了如上面相对于图13讨论的相同的患者亚组(31名胃(g)/胃食道连接(gej)患者)。这些结果呈现于图15中。发现具有较高百分比的对dkk1染色阳性的肿瘤细胞的g/gej io初治患者展现出增加的pfs。具体地，在％阳性值的较高三分位数中的患者(按rnascope至少20％的肿瘤细胞对dkk1染色呈阳性)表明了22.1周的中位生存期，相比于该较高三分位数外的患者的6.1周(按对数秩(mantel-cox)检验，p值＝0.017)。
[0254]
实例4
[0255]
在另外的研究中，分析了患有胃/gej io难治性患者(即之前用免疫疗法治疗的患者)的患者亚组。五名患者用dkn-01与帕博利珠单抗组合进行治疗(4名患者用300mg dkn-01并且1名患者用150mg dkn-01)。分析的结果呈现在图16a(对于h评分)和图16b(对于％阳性值)中。如可见的，5名患者中的3名患有稳定疾病(sd)，2名患者具有进展性疾病(pd)。所有sd患者具有高于pd患者的h评分或％阳性值。sd患者的最低h评分为59，并且sd患者的最低％阳性值为33％。
[0256]
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[0257]
虽然本发明已参考其示例实施例进行了特定示出和描述，但本领域的技术人员将理解，在不偏离由所附权利要求书涵盖的本发明范围的情况下，可以在其中做出在形式和细节方面的各种改变。