miRNA分子标记物在精神分裂检测中的应用

mirna分子标记物在精神分裂检测中的应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及一种精神分裂症分子标志物mirna-4763-3p及其在在精神分裂症高危人群的筛查、精神分裂症早期诊断及治疗等领域的应用。


背景技术：

2.精神分裂症是一种常见的在感知，思维，情感，行为等方面存在障碍和精神活动的不协调的重性精神疾病,在全球影响超过2000万人，在青春期或成年早期发病率很高，患者早期死亡率较普通人高出2-3倍。其典型的临床症状是幻觉、妄想，发病早期病人比较孤僻，不愿和别人交流，随着病情进一步发展，即表现为思维紊乱，出现幻想幻听，有些患者还会出现自杀自残和离家出走的冲动。本病严重损害患者的心身健康，给患者家庭以及社会带来沉重的负担。因此找到一种防治精神分裂症的技术手段很有必要。
3.micrornas(mirnas)是一类非编码的小rna分子，通过与目标mrna的3'非翻译区 (3'utr)互补或部分互补结合，使其降解或介导其翻译抑制，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。mirna在大脑发育和许多精神疾病的病理生理中起着至关重要的作用。对精神分裂症患者不同生理时期前额叶皮层中mirna表达的研究揭示了该区域中mirna的时空动态，这表明精神分裂症和在婴儿和青春期功能失调的mirna 可能存在联系。mirnas及其衍生物在疾病诊断和治疗有很大的前景。
4.生物标志物是可以在分子水平上标记细胞，组织，器官的病理变化的生化指标。由于灵敏性和特异性的优点，它可以提供预警和预后功效分析，也可以在很大程度上作为辅助诊断的基础。许多技术已被用于寻找精神分裂症生物标志物。最新研究表明，由于mirna的稳定性和特异性，它们可以作为基因表达的调节剂成为有吸引力的候选生物标志物。特别是，全血或特定血液成分中的mirna是改善疾病诊断，包括危及生命的病理学的候选药物。在精神分裂症的相关研究中也发现了血液mirna在精神分裂症发病机理中的核心作用。但mirna分子在精神分裂症发病的生物医学检测中分子生物学应用还处于初级阶段，其应用需要新的更有效的解决方案，才能充分发挥作用。


技术实现要素：

5.为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种mirna 分子标记物在精神分裂检测中的应用，通过使用生物信息学的方法来系统地分析精神分裂症患者和健康对照组之间基因表达的全基因组差异，然后通过go和kegg功能富集分析这些差异基因参与的信号通路和功能。接下来构建了一个cerna网络来分析上游关键mirna及其包括中心靶基因rasd2之间的相互作用，使用rnahybrid和blastn软件预测它们的最佳结合位点。最后通过分子实验在小鼠模型和精神分裂病人中对精神分裂症的分子机制进行了分析和验证。
6.为达到上述目的，本发明采用如下发明构思：
7.本发明使用生物信息学的方法来系统地分析精神分裂症患者和健康对照组之间
基因表达的全基因组差异以及这些差异基因参与的信号通路和功能。接下来构建了一个cerna网络来分析上游关键mirna及其中心靶基因rasd2之间的相互作用，并且预测它们的最佳结合位点。此外，研究发现mirna调节了这些degs的表达，靶向rasd2基因的hsa-mirna-4763-3p 作为精神分裂症的潜在生物标志物和治疗靶标。最后这些结果在小鼠模型和病人血液样本中得到验证。这项研究基于degs的生物信息学分析和血液样本的验证，并试图发现mirnas 作为精神分裂症的潜在生物标志物，为精神分裂症的早期诊断及治疗奠定了临床基础。
8.根据上述发明构思，本发明采用如下技术方案：
9.一种mirna分子标记物在精神分裂检测中的应用，通过使用生物信息学的方法来分析精神分裂症患者和健康对照组之间基因表达的全基因组差异，然后通过go和kegg功能富集分析这些差异基因参与的信号通路和功能；随后建立一个cerna网络，来分析上游关键mirna 及其靶基因,包括中心靶基因rasd2之间的相互作用以及预测它们的最佳结合位点；通过 mirna调节degs的表达，将靶向rasd2基因的hsa-mirna-4763-3p作为精神分裂症的潜在生物标志物和治疗靶标。本发明通过分子实验对精神分裂症的分子机制在小鼠模型和精神分裂患者中进行了分析和验证，在分子水平探讨精神分裂症的分子机制，将有助于人们发现精神分裂症早期诊断的分子标记物，为精神分裂症的早期防治提供新的靶点。
10.本发明为了确定精神分裂症患者与健康对照组之间的基因差异，分析了这两组中人ipsc 衍生的皮质中间神经元的rna-seq测序结果，在28名精神分裂症患者和28名健康对照组中确定了61个degs。在这61个degs中，在精神分裂症患者中有21个基因表达水平上调，例如c1orf54和hla-b。有40个基因下调，例如setd7,myo5b,kctd12和rasd2。
11.优选地，通过基因本体go(https://david.ncifcrf.gov/)和基因和基因组百科全书kegg 进行功能富集分析，go分析包括：
12.(1)17个基因富集于生物过程：包括蛋白质同源低聚化、钾离子跨膜转运的调节、轴突引导、蛋白激酶活性的调节和视网膜稳态；
13.(2)29个基因富集在细胞成分：包括细胞连接、细胞表面、细胞外囊泡和高尔基体；
14.(3)13个基因富集于分子功能：包括电压门控钾通道活性、多糖结合、rna聚合酶ii 序列特异性dna结合、钾通道活性；
15.kegg分析包括10个degs参与了五种重要途径：移植抗宿主疾病、同种异体移植排斥、醛固酮介导的钠再吸收、尼古丁成瘾和i型糖尿病。
16.优选地，本发明go分析表明：17个基因富集于生物过程、29个基因富集在细胞成分、 13个基因富集于分子功能、kegg分析表明，有10个degs参与了五种重要途径，得到degs 与精神分裂症之间的关系。
17.优选地，cerna网络的中间节点mirna调节degs和相关lncrna的表达，rasd2基因的上游mirna包括has-mirna-4763-3p、hsa-mir-6820-5p、hsa-mir-6756-5p、 hsa-mirna-4695-5p和hss-mirna-6769b-5p，形成了整个网络的中枢。
18.本发明利用精神分裂症相关的degs的分子机制，cerna网络的中间节点mirna调节degs 和相关lncrna的表达。这一结果表明，degs在精神分裂症中的异常表达可能受到各种mirna 的调控。此外，rasd2基因的上游mirna数目最多，形成了整个网络的中枢，这些mirna参与调节精神分裂症中rasd2的表达。
19.优选地，使用rnahybrid和blastn构建了图像并预测了靶基因的结合位点。
20.优选地，采用hsa-mirna-4763-3p作为与rasd2结合的最佳靶位点。
21.本发明采用的hsa-mirna-4763-3p和rasd2之间的结合自由能是最低的，结果表明 mir-4763-3p与rasd2之间存在相互作用并且hsa-mirna-4763-3p是rasd2结合的最佳靶位点。
22.优选地，通过注射5-ht拮抗剂18f-mppf，用于特异性检测精神分裂症患者中的5-ht受体的表达分布，分析出了关键的大脑区域,用于特异性检测精神分裂症，获得了关键的大脑区域信息。
23.本发明结合精神分裂症患者的pet数据，5-ht可以调节前额叶皮质中某些神经递质的释放，包括多巴胺。通过注射高度选择性的5-ht拮抗剂18f-mppf，可用于特异性检测精神分裂症患者中的5-ht受体的表达分布。从44个样本(包括18个精神分裂症患者和26个健康对照)中收集pet数据，并使用matlab r2016a进行分析。通过比较精神分裂症患者和健康个体的数据，我们获得了关键的大脑区域。增强的脑部区域标记为红色，而减少的脑部区域标记为蓝色，这意味着精神分裂症患者的大脑中5-ht受体的表达主要在额叶，颞叶发生上调，在枕叶，后叶和左颞叶发生下调。
24.优选地，采用hsa-mirna-4763-3p作为精神分裂症的候选生物标志物。
25.本发明通过探究rasd2在精神分裂症中的重要作用，以及验证mir-4763-3p与rasd2的关系。首先在小鼠精神分裂症模型中进行了qpcr分析，证实了rasd2的差异表达。随后，对精神分裂症患者血液样本的qpcr分析显示，rasd2表达水平下调，靶向rasd2的 hsa-mirna-4763-3p和hsa-mirna-6769b-5p表达上调，hsa-mirna-6820-5p表达下调。我们的研究结果表明，这些mirnas可能是精神分裂症的候选生物标志物。
26.本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
27.1.本发明通过在分子水平探讨精神分裂症的分子机制，有助于人们发现精神分裂症早期诊断的分子标记物，为精神分裂症的早期防治提供新的分子靶点；在本发明中，首先使用生物信息学的方法来系统地分析精神分裂症患者和健康对照组之间基因表达的全基因组差异，初筛出精神分裂症患者中有61个差异表达基因(degs)；go和kegg功能富集分析显示，大多数基因主要富集于突触传导和神经递质传导相关功能；随后构建了一个cerna网络来分析上游关键mirna及其靶基因之间的相互作用，其中研究发现rasd2基因的上游mirna数目最多，形成了整个网络的中枢；结果表明，不同的mirnas调节了这些degs的表达，因此mir-4763-3p可能会调节其靶基因rasd2的表达，从而影响精神分裂症的发生和发展；接下来在精神分裂症小鼠模型和患者中得到了验证，pet的结果揭示了前额叶等精神分裂症病理学的关键大脑区域，通过qpcr分析在精神分裂症小鼠模型中证实了rasd2的差异表达，证明了rasd2在精神分裂症中的关键调控作用；最后又对精神分裂患者血液样本进行了 qpcr分析，显示rasd2的表达下调，靶向rasd2表达的mir-4763-3p表达上调；
28.2.本发明mir-4763-3p可作为潜在的生物标志物和精神分裂症的治疗靶点，为进一步的精神分裂症临床研究提供了理论基础。
附图说明
29.图1为与精神分裂相关的差异基因的筛选图。其中，图(a)：精神分裂患者(n＝28)
与健康对照组(n＝28)基因表达差异分析热图，红色表示表达上调的基因，蓝色表示表达下调的基因。deg筛选阈值为：|log2fc|》0.38，p值《0.05。(rna测序数据从geo下载 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/；注册号gse121376)。图(b)：差异基因火山图。红色代表上调基因，绿色代表下调基因。共有61个差异基因，其中上调基因有21个，下调基因有40个。图(c)：已被证实与精神分裂相关的差异基因的表达上下调情况。
30.从geo数据库下载先前报道的精神分裂症患者和健康个体的rna-seq数据，设定|log2fc |》0.38，p值《0.05为阈值筛选差异基因。
31.图2为差异基因go/kegg功能富集分析图。其中，图(a-c)：为差异基因在生物学途径、细胞组分和分子功能的功能注释。17个基因参与蛋白质同源寡聚、钾离子跨膜转运调节、轴突引导、蛋白激酶活性调节和视网膜内稳态等生物学过程；29个基因在细胞表面和高尔基体等细胞成分中富集；13个基因执行电压门控钾通道活性、多糖结合、rna聚合酶ii序列特异性dna结合等分子功能。图(d)：差异基因kegg通路分析，主要涉及5个重要的通路：移植物抗宿主病、同种异体排斥反应、醛固酮介导的钠重吸收、尼古丁成瘾和i型糖尿病。图 (e)：关键基因在参与和执行的主要通路和功能。
32.将筛选出的与精神分裂相关的差异基因使用david 6.8(https://david.ncifcrf.gov/) 进行go/kegg功能注释。
33.图3为差异基因的cerna网络分析图。使用rnahybrid和blastn确定mirna
–
mrna和 mirna
–
lncrna之间的调控关系。浅蓝色表示节点has-mirna，红色节点代表上调的mrna，深蓝色节点代表下调的mrna。橙色节点代表上调的lncrna，绿色节点代表下调的lncrna。灰线表示两个节点之间的交互。其中rasd2处于网络的中间位置。
34.图4为mirna和mrna的关系预测图。其中图(a)：为四种不同的mirna与精神分裂相关的基因的靶向预测，显示了至少四个不同的mirna调控的蛋白质编码基因的值。图(b)：由 rnahybrid软件预测mirna和rasd2的结合序列。图(c)：精神分裂症组和健康对照组中六个基因的rpkm值。
35.图5为精神分裂患者大脑的pet成像图。使用精神分裂标志物
18
f-mppf对5-ht受体进行 pet成像，红色代表增强的大脑区域，蓝色代表减少的大脑区域。
36.图6为qpcr验证关键基因和mirna的表达图。其中图(a)：小鼠大脑的
18
f-dtbz pet图像；绿色代表多巴胺受体。图(b)：qpcr检测精神分裂模型小鼠和健康对照小鼠rasd2,kctd12 和setd7基因表达。图(c)：qpcr检测精神分裂患者和健康受试者血液样本中rasd2基因表达。图(d)：qpcr检测精神分裂患者和健康受试者血液样本中参与调节rasd2基因的mirna 的表达。数据以平均值
±
sem表示，与对照组相比较，*p《0.05；**p＜0.01；***p＜0.001。
37.连续一周对小鼠腹腔注射n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂mk-801构建精神分裂小鼠模型。断颈处死小鼠后迅速取其前额叶利用总rna提取试剂盒提取rna后，反转录成cdna。进行qpcr对精神分裂相关的基因进行表达量测定。
38.使用不加抗凝剂的血液收集管收集血液样本，并在血液凝结后取血清，利用总rna提取试剂盒提取rna后，反转录cdna进行如上检测。
具体实施方式
39.以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
40.实施例一：差异表达基因的获取和功能注释：
41.为了鉴定精神分裂症患者和健康个体之间的差异表达基因，获得了先前报道的rna-seq 数据(geo登录号gse121376)。使用本地开发的perl脚本删除5'和3'末端的低质量碱基(q20 ≤20)。使用hisat2(2.0.5版)将读取片段比对到人类参考基因组上(grcm38.p5)。使用 bedtools进行读取并计数(quinlan 2014)，并使用rpkm(每百万碱基读取读数)方法计算其表达量。使用|log2fc|》0.4的倍数变化阈值筛选差异表达基因，通过t检验获得p值。后续用david 6.8对精神分裂症相关基因进行功能富集分析。
42.实施例二：cerna网络的构建：
43.从mirbase中收集mirna。mrna和lncrna序列获自ncbi(grcm38.p5)。所有差异表达的mrna和lncrna均用于靶标鉴定。mirna-mrna和mirna-lncrna的调控关系使用rna原位杂交技术确定(将种子区域的坐标设置为1至6、2至7、3至8、4至9和 5至10；mfe≤-25kcal/mol，p≤0.01)和blastn(e值为1000，除去正向比对中的mirna 和mirna(比对位置大于6)，并获得了交点。使用cytoscape(3.5.1)可视化cerna网络。
44.实施例三：精神分裂症小鼠模型的构建：
45.将n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)型谷氨酸受体拮抗剂mk-801(sigma-aldrich，st.louis， mo，usa)溶解在生理盐水中，并通过腹腔注射注入小鼠体内，连续注射7天(0.6mg/kg，每天一次)。给相同条件的小鼠注射相同剂量的生理盐水作为对照。注射后1周内进行pet 和qpcr实验。
46.实施例四：正电子发射断层扫描(positron emission tomography，pet)：
47.根据正常操作程序，于复旦大学pet中心华山医院使用siemens inveon pet/ct系统(美国肯塔基州诺克斯维尔，西门子医疗设备)对小鼠进行pet成像检测。首先使用异氟烷对小鼠进行麻醉，检测前50分钟通过尾静脉注射将精神分裂标志物
18
f-dtbz到小鼠体内。对小鼠进行动态pet监测，持续60min。
48.实施例五：脑成像：
49.从上海华山医院收集了一组精神分裂症患者和健康对照者的大脑相关数据。使用 dcm2nii(http://people.cas.sc.edu/rorden/mricron/index.html)将所有医学数字成像和通信 (dicom)数据转换为nifti格式的文件。使用以下两个步骤来建立大脑边界以进行分析。首先在matlab r2016a中对统计参数进行映射(spm12，www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm)；每个图像都通过icbm东亚模板归一化为标准的大脑空间图，并同时去除了低频的背景噪声。接着，应用fwhm值为10
×
10
×
10mm3的各向同性高斯平滑核。使用基于18位精神分裂症患者和26位健康对照者的两样本数据进行t检验，比较了各组中关注区域(roi)。通过将阈值设置为p《0.01并应用20像素的阈值进行错误校正，对相关区域进行定位。使用talairachclient，找到并创建的roi的单个和批量标签。
50.实施例六：小鼠大脑rna提取和实时定量pcr(qpcr)
51.在预冷的pbs中将小鼠快速解剖并取出前额叶后，置于rna提取溶液中。根据promegas 总ran提取试剂盒中提供的方案进行rna提取。然后采用takara公司的反转录试
剂盒 (drr047)，对提取到的总rna进行反转录。接下来以cdna为模板，使用针对目标mrna 的pcr引物及yeasen的sybr green premix荧光定量pcr体系，在stratagen mx3000p定量pcr仪上进行扩增，并测得样品的ct值。将所得ct值通过代入测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标mrna的含量。使用gapdh基因作为内参对 mirnaqpcr检测结果进行标准化校正。
52.实施例七：血液样本rna提取和实时定量pcr(qpcr)
53.使用不加抗凝剂的血液收集管对血液样本进行收集，并在血液凝结后取血清，根据yeasen 总ran提取试剂盒中提供的方案进行rna提取(yeasen，中国上海)。然后采用ribobio公司的反转录试剂盒，对提取到的总rna进行反转录，接下来以cdna为模板，使用针对目标mrna的pcr引物及ribobio的qpcr sybr green master mix荧光定量pcr体系，在 stratagen mx3000p定量pcr仪上进行扩增，并测得样品的ct值。将所得ct值通过代入测定标准曲线得出的公式，采用绝对定量的计算方法得出样品中的目标mrna的含量。使用u6 基因作为内参对mrnaqpcr检测结果进行标准化校正。
54.本发明上述实施例通过在分子水平探讨精神分裂症的分子机制，有助于人们发现精神分裂症的早期诊断的分子标记物，为精神分裂症的早期防治提供新的分子靶点。在本发明中，首先使用生物信息学的方法来系统地分析精神分裂症患者和健康对照组之间基因表达的全基因组差异，初筛出精神分裂症患者中有61个差异表达基因(degs)。go和kegg功能富集分析显示，大多数基因主要富集于突触传导和神经递质传导相关功能。随后构建了一个cerna 网络来分析上游关键mirna及其靶基因之间的相互作用，其中研究发现rasd2基因的上游 mirna数目最多，形成了整个网络的中枢。结果表明，不同的mirnas调节了这些degs的表达，mir-4763-3p可能会调节其靶基因rasd2的表达，从而影响精神分裂症的发生和发展。接下来在精神分裂症小鼠模型和患者中得到了验证，pet的结果揭示了前额叶等精神分裂症病理学的关键大脑区域，通过qpcr分析在精神分裂症小鼠模型中证实了rasd2的差异表达，证明了rasd2在精神分裂症中的关键调控作用。最后又对精神分裂患者血液样本进行了qpcr分析，显示rasd2的表达下调，靶向rasd2表达的mir-4763-3p表达上调。综上所述，上述实施例mir-4763-3p可作为潜在的生物标志物和精神分裂症的治疗靶点，为进一步的精神分裂症临床研究提供了理论基础。
55.上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。