一种植物乳杆菌的新应用及其用于制备降低胆固醇的产品的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种植物乳杆菌的新应用及其用于制备降低胆固醇的产品。


背景技术：

血浆总脂高于正常血脂水平称为高血脂症。高血脂症主要包括高胆固醇血症和(或)高甘油三酯血症及其复合型高胆固醇血症，表现为血清胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白胆固醇比正常水平偏高。高胆固醇血症是导致动脉粥样硬化的主要危险因素，而动脉粥样硬化是导致心脑血管疾病的重要原因。另外，心血管疾病已成为世界上许多国家的主要死亡原因，血清胆固醇水平升高已被证明是这种疾病的主要原因。由于最常用的降胆固醇药物具有一些不良副作用，比如降血脂药当中最常用的就是他汀类药物，其代表药物有：阿托伐他汀、瑞舒伐他汀、辛伐他汀、氟伐他汀和普伐他汀。他汀类药物最主要的不良反应包括：恶心、腹痛、腹泻、头痛、头晕、失眠、肌肉疼痛和肝酶升高等。在这些不良反应中需要我们引起重视的有他汀引起的肝功能异常和肌痛为代表肌肉相关损伤。因此能够降低血清胆固醇水平的功能性食品和保健品最近受到了更多的关注，有很大的需求空间。


技术实现要素：

为克服背景技术中存在的常用的降胆固醇药物具有不良副作用的问题，本发明的第一个目的在于提供植物乳杆菌在制备用于降低胆固醇的产品中的新应用，本发明筛选得到的植物乳杆菌能够有效降胆固醇，制备的降低胆固醇的产品无副作用，没有不良反应，有利于人体健康。进一步地，所述植物乳杆菌lactobacillus plantarum lp90，分类命名为lactobacillus plantarum，已于2015年1月27日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc 10453。进一步地，所述植物乳杆菌lp90的活菌数为不低于1
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109cfu/ml或1
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109cfu/g。进一步地，所述产品包含食品。进一步地，所述食品包括固体饮料。本发明的第二个目的在于提供一种应用植物乳杆菌lp90制备降低胆固醇的固体饮料，所述固体饮料包括植物乳杆菌lp90冻干粉、菊粉。进一步地，所述固体饮料还包括低聚果糖、蔓越莓粉。进一步地，植物乳杆菌lp90冻干粉制备方法为：将植物乳杆菌lp90按照占培养基总质量3％的接种量接种到mrs培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用海藻糖浓度为100g/l的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到冻干粉。进一步地，制备冻干粉使用的mrs培养基(g/l)为：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4
·
3h2o 2.6g/l、mgso4
·
7h2o 0.1g/l、mnso4 0.05g/l、吐温80 1ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。进一步地，所述植物乳杆菌lp90与菊粉质量比例为0.1:1.9；所述植物乳杆菌lp90冻干粉：菊粉：低聚果糖：蔓越莓粉质量比例为0.1：0.5：1.2：0.2；所述添加的植物乳杆菌lp90的活菌数为10
10
cfu/ml。所述固体饮料各组分的作用：菊粉是一种天然的水溶性膳食纤维，几乎不能被胃酸水解和消化，只有在结肠被有益微生物利用，从而改善肠道环境。有研究表明，双歧杆菌的增殖程度取决于人体大肠中初始双歧杆菌的数量。低聚果糖又称蔗果低聚糖，是由1～3个果糖基通过β(2—1)糖苷键与蔗糖中的果糖基结合生成的蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等的混合物。低聚果糖除具有一般功能性低聚糖的物理化学性质外，它能明显改善肠道内微生物种群比例，它是肠内双歧杆菌的活化增殖因子，可减少和抑制肠内腐败物质的产生，抑制有害细菌的生长，调节肠道内平衡。蔓越莓粉中的各种酸性物质能增加膀胱中尿的酸性值，形成的强酸性环境杀死尿道中的大肠杆菌。因此，这些物质可以跟益生菌起到相互促进的作用。本发明与上述背景技术相比较可具有如下有益效果：本发明提供的植物乳杆菌lp90用于降低胆固醇的产品方面：(1)体外实验显示其具有有效清除胆固醇和降低胆盐的能力；(2)体内实验表明其能显著降低血清胆固醇和肝脏胆固醇的水平；(3)能够显著增加粪便中酸性固醇的含量；(4)显著降低肝组织胆固醇-7α-羟化酶(cyp7a1)的水平。因此，本发明提供的植物乳杆菌lp90具有很强的降低胆固醇的能力，可以用来开发降低胆固醇的产品或用来发酵制备低胆固醇含量的产品，有利于人体健康，对人体没有副作用。植物乳杆菌lp90用于制备降低胆固醇的产品(如固体饮料)中，安全性好，无副作用。在生产生活中具有很大的应用前景。植物乳杆菌(lactobacillus plantarum,又称lactiplantibacillus plantarum、植物乳植杆菌)是已被纳入《可用于食品的菌种名单》的一种益生菌，因此，本发明筛选得到的植物乳杆菌lp90对人体而言，相对健康，且没有不良反应。
附图说明
附图1本发明实施例植物乳杆菌lp90对改善血清总胆固醇的效果对比柱形图；附图2本发明实施例植物乳杆菌lp90对高胆固醇饮食引起的低密度脂蛋白固醇影响柱形图；附图3本发明实施例植物乳杆菌lp90对高胆固醇饮食引起的高密度脂蛋白固醇影响柱形图；附图4本发明实施例植物乳杆菌lp90对高胆固醇饮食引起的肝脏总固醇影响柱形图；附图5本发明实施例植物乳杆菌lp90对粪便中性固醇的含量影响柱形图；附图6本发明实施例植物乳杆菌lp90对高胆固醇饮食引起的粪便总胆汁酸影响柱形图；附图7本发明实施例植物乳杆菌lp90对肝脏固醇-7α-羟化酶(cyp7a1)的影响柱形
图；图中，“*”表示p《0.05，“**”表示与表示p《0.01，“***”表示表示p《0.001。
具体实施方式：
下面将结合本发明附图及实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。下述实施例中涉及的蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、乙酸钠与酵母粉、柠檬酸氢二铵、k2po4·
3h2o、mgso4·
7h2o、mnso4、吐温80和半胱氨酸氨酸盐购自国药集团化学试剂有限公司。spf级雄性4周龄c57bl/6小鼠，高脂及普通饲料购自上海斯莱克公司；测定tnf-α、il-1β、il-6和il-10检测用elisa试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司。下述实施例中涉及的培养基如下：mrs培养基(g/l)：蛋白胨10g/l、牛肉膏10g/l、葡萄糖20g/l、乙酸钠2g/l、酵母粉5g/l、柠檬酸氢二铵2g/l、k2po4·
3h2o 2.6g/l、mgso4·
7h2o 0.1g/l、mnso
4 0.05g/l、吐温80 1ml/l、半胱氨酸氨酸盐0.5g/l。实施例1：植物乳杆菌lp90冻干粉的制备将植物乳杆菌lp90按照占培养基总质量3％的接种量接种到mrs培养基中，于37℃下培养18h，得到培养液；将培养液离心，得到菌体；将菌体用海藻糖浓度为100g/l的海藻糖冻干保护剂重悬(冻干保护剂和菌体的质量比为2:1)，得到重悬液；将重悬液采用真空冷冻法进行冻干，得到植物乳杆菌lp90冻干粉。实施例2：植物乳杆菌lp90体外降解胆固醇能力植物乳杆菌lp90的胆固醇去除能力测定：将1
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109cfu/ml的植物乳杆菌lp90接种到10ml含有50mg/l的mrs液体培养基中，37℃培养18小时。胆固醇测定方法：取1ml的mrs培养液，在6000rpm下离心5min，吸取上清液，用邻苯二甲醛法测定胆固醇含量。胆固醇降解率计算公式为：(初始胆固醇浓度-反应后胆固醇浓度)/初始胆固醇浓度*100％。胆固醇去除率见表1。表1：胆固醇去除率 胆固醇含量mg/l去除率0h50024h23.852.4％48h12.774.6％如表1所示，植物乳杆菌lp90在24小时可以降解52.4％的胆固醇，48小时降解率达到74.6％。说明植物乳杆菌lp90具有很好的降解胆固醇的能力。实施例3：植物乳杆菌lp90体外降解胆盐混合物的能力测试植物乳杆菌lp90的胆盐分解能力测定：将胆盐混合物(sigma-aldrich)加入到无菌mrs液体培养基中，最终浓度为4mmol/
l。将1
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109cfu/ml的植物乳杆菌lp90接种到10ml含有4mmol/l的mrs液体培养基中，37℃培养2小时，10,000g离心15分钟，取上清液用高效液相色谱法测定结合胆盐浓度。胆盐水解率见表2。表2胆盐水解率 胆固醇含量mmol/l水解率0h402h0.7681％如表2所示，2小时植物乳杆菌lp90能够降解81％的胆盐混合物。实施例4：植物乳杆菌lp90对胆固醇的抑制作用动物模型的建立及分组：从上海斯莱克动物中心购买c57bl/6小鼠。小鼠分别被安置在一个温度为25
±
2℃，湿度为60
±
5％，光暗循环12小时的房间里。动物随机分为3组，每组10只小鼠。第一组为正常对照组，小鼠喂食正常饲料；第二组为模型组，小鼠喂食高胆固醇饲料(1％胆固醇)；第三组为干预组(lp90组)，小鼠喂食高胆固醇饲料同时每天灌胃植物乳杆菌lp90(1
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109cfu)的细菌细胞悬液。实验同时，第一组(健康对照组，ctl)和第二组(高胆固醇模型组，hc)每日灌胃给予0.2ml蒸馏水。在喂养期间，所有动物都可以自由获得饲料和水。实验及干预周期为4周。血清胆固醇水平的测定：实验结束后，所有小鼠眼眶采集全血，3000g离心15min分离血清。所获得的血清样品用全自动生化分析仪和酶比色法测定总胆固醇，低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇水平。结果及分析：植物乳杆菌lp90对改善血清总胆固醇的效果对比见图1。如图1所示，与对照组相比，高胆固醇饮食小鼠的血清中总胆固醇水平显著升高；而植物乳杆菌lp90的干预能够显著降低血清总胆固醇水平。植物乳杆菌lp90对高胆固醇饮食引起的低密度脂蛋白固醇的影响见图2。如图2所示，与对照组相比，高胆固醇饮食小鼠的血清中低密度脂蛋白胆固醇水平显著升高；而植物乳杆菌lp90的干预能够显著降低血清低密度脂蛋白胆固醇水平。植物乳杆菌lp90对高胆固醇饮食引起的高密度脂蛋白固醇影响见图3。如图3所示，与对照组相比，高胆固醇饮食小鼠的血清中高密度脂蛋白胆固醇水平显著降低；而植物乳杆菌lp90的干预能够显著改善血清高密度脂蛋白胆固醇水平。hdl可以将过多的胆固醇从动脉粥样斑块中移走防止血管壁沉积。与正常对照组相比，高胆固醇组小鼠血清hdl水平显著升高，这可能是由于机体为降低血清胆固醇水平而做出的应激反应；相对于高胆固醇组而言，植物乳杆菌lp90干预组小鼠血清hdl水平显著升高，这说明植物乳杆菌lp90对血清hdl有显著改善作用。因此，植物乳杆菌lp90的干预可有效缓解由高胆固醇饮食诱导的血脂代谢异常。肝脏胆固醇水平的测定：实验结束后，小鼠肝组织匀浆后用氯仿和甲醇的二元混合溶剂(2:1，v/v)提取两次，用气相色谱法提取下层有机相(氯仿)测定总胆固醇水平。用7890气相色谱仪和hp-5熔
融石英毛细管柱(30m
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0.25mm；膜厚0.25μm)(威尔明顿特拉华州安捷伦科技有限公司公司)，载气流速(n2)为1ml/min。结果与分析：植物乳杆菌lp90对高胆固醇饮食引起的肝脏总固醇影响见图4。如附图4所示，与对照组相比，高胆固醇饮食小鼠的肝脏中总胆固醇水平显著升高；而植物乳杆菌lp90的干预能够显著降低肝脏总胆固醇水平。因此，这进一步验证了植物乳杆菌lp90的干预可有效缓解由高胆固醇饮食诱导的血脂代谢异常。实施例5：粪便中性和酸性固醇的测定动物造模方法同实施例4。实验结束后收集小鼠粪便，并冻干。粪便样本(100mg)用2ml乙醇在50℃下萃取两次。萃取物使用全自动生化分析仪测定总胆汁酸水平。使用气相色谱法-质谱联用测定粪便中性甾醇(胆固醇、粪甾烷醇和胆甾烷)。结果与分析：植物乳杆菌lp90对粪便中性固醇的含量影响见图5。如图5所示，未观察到高胆固醇组小鼠中性甾醇的显著变化，但是植物乳杆菌lp90可以有效降低粪便中性甾醇的含量。植物乳杆菌lp90对高胆固醇饮食引起的粪便总胆汁酸影响见图6。如图6所示，与对照组相比，高胆固醇饮食小鼠的粪便中总胆汁酸水平显著降低；而植物乳杆菌lp90的干预能够显著增加粪便总胆汁酸水平。因此，这说明植物乳杆菌lp90的干预可有效促进胆固醇代谢，并通过胆汁酸形式排出体外。实施例6：肝脏胆固醇-7α-羟化酶(cyp7a1)的测定采用超低温ripa溶解液，将肝组织用匀浆机匀浆(9000r/min，10min)。用上海哈灵生物技术有限公司生产的cyp7a1酶联免疫吸附试剂盒分别测定肝脏cyp7a1蛋白水平。结果与分析：植物乳杆菌lp90对肝脏固醇-7α-羟化酶(cyp7a1)的影响见图7。如图7所示，与对照组相比，高胆固醇饮食小鼠的肝脏胆固醇-7α-羟化酶(cyp7a1)显著降低；而植物乳杆菌lp90的干预能够显著增加肝脏胆固醇-7α-羟化酶(cyp7a1)水平。因此，这进一步验证了植物乳杆菌lp90的干预可有效促进胆固醇代谢。实施例7：固体饮料的制备植物乳杆菌lp90冻干粉制备同实施例1。降低胆固醇的固体饮料(2g)配方：植物乳杆菌lp90冻干粉0.1g，菊粉1.9g制得固体饮料。产品规格：固体饮料采用2g为1包，添加的植物乳杆菌lp90的活菌数为10
10
cfu/ml。固体饮料的胆固醇去除能力测定：实验方法同实施例2。表3：固体饮料胆固醇去除率 胆固醇含量mg/l去除率0h50024h24.251.6％48h12.175.8％如表3所示，固体饮料在24小时可以降解51.6％的胆固醇，48小时降解率达到75.8％。说明固体饮料具有很好的降解胆固醇的能力。固体饮料的胆盐水解能力测定：实验方法同实施例4。
表4固体饮料胆盐水解率 胆固醇含量mmol/l水解率0h402h0.7282％如表4所示，2小时固体饮料能够水解81％的胆盐混合物。实施例8：固体饮料的制备植物乳杆菌lp90冻干粉制备同实施例1。降低胆固醇的固体饮料(2g)配方：植物乳杆菌lp90冻干粉0.1g，低聚果糖1.2g，菊粉0.5g，蔓越莓粉0.2g制得固体饮料。产品规格：固体饮料采用2g为1包，添加的植物乳杆菌lp90的活菌数为10
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cfu/ml。固体饮料的胆固醇去除能力测定：实验方法同实施例2。表5：固体饮料胆固醇去除率 胆固醇含量mg/l去除率0h50024h22.355.4％48h10.279.6％如表3所示，固体饮料在24小时可以降解55.4％的胆固醇，48小时降解率达到79.6％。说明固体饮料具有很好的降解胆固醇的能力。固体饮料的胆盐分解能力测定：实验方法同实施例4。表6:固体饮料胆盐降解率 胆固醇含量mmol/l水解率0h402h0.6284.5％如表4所示，2小时固体饮料能够降解84.5％的胆盐混合物。结果显示，服用本发明提供的固体饮料能显著降低胆固醇，表明本发明提供的固体饮料具有很好的实用价值以及市场应用前景。以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。