一种基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物及其应用

1.本发明属于纳米复合材料技术领域，涉及一种基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物及其应用。


背景技术：

2.近年来，随着ctla-4、pd-1和pd-l1阻断抗体获得临床认可，免疫检查点阻断剂(immune checkpoint blockers，icbs)在后期临床试验中取得的良好治疗效果。但仍有许多免疫治疗无响应的患者，特别是那些患有高度流行的实体瘤(如肺癌、乳腺癌和结肠癌)患者。肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)通过促进肿瘤细胞对宿主免疫的抵抗，在决定icbs的效力方面起着至关重要的作用。越来越多的证据表明，肿瘤缺氧微环境可能是肿瘤免疫逃逸的罪魁祸首。在基因水平上，缺氧基因集在没有受益于icbs免疫治疗的患者肿瘤中发生富集。在细胞水平上，缺氧能够诱导对细胞介导的细胞毒性的抵抗和促进免疫耐受，从而损害t淋巴细胞的浸润，并干扰t淋巴细胞的效应器功能。当前研究结果表明，靶向低氧联合icbs的治疗组合在多种肿瘤类型的体内小鼠模型中产生了好的治疗效果。
3.氧供应和氧消耗的平衡失衡，导致高度侵袭、快速生长的肿瘤暴露于缺氧环境中。对于癌细胞而言，其巨大的能量需求迫使氧化代谢重建，从而增强线粒体氧化磷酸化系统(mitochondrial oxidative phosphorylation system，oxphos)的应激，导致肿瘤微环境中的氧消耗过多，从而发生缺氧。一般用于改善肿瘤部位的缺氧状况的策略有两种：通过氧合剂提供额外的氧和抑制肿瘤细胞的氧消耗。第一种策略旨在增加肿瘤微环境中的氧含量，然而有激活肿瘤细胞并促进其增殖和转移的危险，从而导致临床应用受限。第二种策略主要是应用细胞呼吸抑制剂，从而有效抑制肿瘤细胞的耗氧量。在这种策略指导下，靶向线粒体动力学中的oxphos以抑制癌细胞氧消耗，目前被认为是缓解肿瘤缺氧的一种新兴和潜在的方法。虽然直接抑制oxphos方面取得了一些成功，但由于肿瘤靶向性不理想而导致的剂量限制性副作用使得该领域仍然存在重大挑战。
4.药物分子与人体内最丰富的蛋白质人血清白蛋白(hsa)结合是肿瘤靶向给药最有前景的方法之一，具有良好的安全性和可靠性。与游离药物相比，hsa改善了药物分子的肿瘤靶向性，这得益于肿瘤部位的高渗透性和滞留效应(epr)以及活性白蛋白受体介导的肿瘤细胞内吞作用。商业一线化疗药物紫杉醇就是通过这种方式实现肿瘤特异性给药，紫杉醇与hsa结合形成直径约为150nm的纳米颗粒降低了毒性并且提高了临床使用效果。然而，hsa衍生纳米颗粒的传统制造方案始终依赖于复杂且耗时的化学过程，如高压均质、ph凝聚技术和微流体方法。
5.美国食品药品监督管理局(fda)批准的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶a还原酶抑制剂氟伐他汀，能够通过降低辅酶q的合成来抑制线粒体呼吸，从而缓解肿瘤缺氧，增强肿瘤免疫治疗，在临床上极具应用潜力。但其仅只能体外抑制线粒体呼吸，在体内没有显示出对抗pd1抗体敏感性增加的现象，与抗pd1单药治疗的肿瘤相比，联合治疗效果没有差异。在体内，氟伐他汀既不能诱导肿瘤细胞凋亡，也不能改善肿瘤微环境中的缺氧。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物，以解决氟伐他汀在体内无法增强抗pd1单克隆抗体敏感性、在肿瘤细胞内无法富集、不能诱导肿瘤细胞凋亡、不能改善肿瘤微环境中的缺氧等问题。
7.基于上述目的，本技术通过提供一种基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物及其应用来解决该领域中的这种需要。
8.一方面，本发明涉及一种基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物，其包括人血清白蛋白和氟伐他汀，所述人血清白蛋白和氟伐他汀的质量配比为1:0.2～1.5。
9.进一步地，在本发明提供的基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物中，人血清白蛋白和氟伐他汀的质量配比为1:1。
10.进一步地，在本发明提供的基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物中，所述纳米复合物流体动力学直径为158.7nm。
11.进一步地，在本发明提供的基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物中，在ph值为7.4时，所述纳米复合物的zeta电位为-27.8mv。
12.另一方面，本发明提供了基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物的制备方法，其包括：将hsa溶解于pbs缓冲液中并超声处理10分钟得到第一溶液，将氟伐他汀溶于dmso试剂中得到第二溶液；以hsa加入质量和氟伐他汀加入质量计，以1:0.2～1.5的质量配比，将所述第一溶液和所述第二溶液加入到含有150mm tcep的pbs缓冲液中，超声处理30分钟，得到所述基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物。
13.具体地，在本发明提供的基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物的制备方法中，其包括：将hsa(5mg)溶解在pbs缓冲液(500μl)中，制成500μl hsa溶液并超声处理10分钟，将氟伐他汀(5mg)溶解在dmso试剂(20μl)中，获得20μl氟伐他汀溶液。然后以hsa的加入质量和氟伐他汀加入质量计，按照1:0.2～1.5的比率将500μl hsa溶液和20μl氟伐他汀溶液添加到含有150mm tcep的pbs缓冲液中，超声处理30分钟，得到所述基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物。
14.本发明通过纳米工程，结合计算机辅助预测系统，开发了一种温和有效的从头合成策略，通过部分还原性hsa和疏水性氟伐他汀之间的超分子自组装，构建了具有球形形貌的尺寸可调的纳米结构。所得纳米复合物显著提高了肿瘤细胞中的氟伐他汀浓度，并帮助氟伐他汀通过抑制肿瘤细胞的线粒体呼吸发挥改善肿瘤缺氧微环境的作用。而且，本发明提供的纳米复合物治疗显著增加了肿瘤浸润性细胞毒性t淋巴细胞的数量，同时减少了调节性t淋巴细胞的数量。本发明不仅为改善肿瘤缺氧微环境和增强肿瘤免疫治疗提供了新的候选药物，也为开发一类新的hsa衍生超分子用于多种肿瘤的定点精准治疗提供了一种颇有前景的工具。由此，本发明进一步请求保护所述纳米复合物在癌症治疗药物和化疗或免疫治疗药物增敏剂中的应用，以及基于本发明纳米复合物制备得到的癌症治疗药物和化疗或免疫治疗药物增敏剂。
15.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果或者优点：
16.与现有技术相比，本发明的主要贡献在于提供了一种基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物，其显著提高了肿瘤细胞中的氟伐他汀药物浓度，并帮助氟伐他汀通过抑制肿瘤细胞的线粒体呼吸发挥改善肿瘤缺氧微环境的作用。应用本发明提供纳米复合物治疗显著
增加了肿瘤浸润性细胞毒性t淋巴细胞的数量，同时减少了调节性t淋巴细胞的数量。本发明提供纳米复合物能增强抗pd1抗体对结直肠癌的治疗效果，同时保持了良好的安全性。
附图说明
17.图1为ab-flu的结构和功能示意图；a：负载氟伐他汀的纳米球ab-flu是通过部分还原性hsa和疏水性氟伐他汀之间的超分子自组装构建的；b：ab-flu通过增强通透性和滞留(epr)效应在肿瘤部位特异性聚集，并在肿瘤细胞中内化，通过抑制辅酶q10和电子传递链(etc)，在细胞内还原环境中以一种自发和可控的方式释放药物，从而改善肿瘤缺氧微环境，降低耗氧量。
18.图2为氟伐他汀在体内外的作用；a：用质谱法测定用氟伐他汀治疗的mc38细胞中辅酶q10的表达量；b和c：经氟伐他汀处理的mc38细胞的jc-1检测荧光图像(b)，用红/绿的相对荧光强度做统计分析(c)；d：mc38小鼠结直肠癌移植瘤模型的肿瘤生长曲线；e和f：实验结束时切除肿瘤的照片(e)和重量统计图(f)；g和h：激光共聚焦扫描显微镜(clsm)拍摄的肿瘤组织tunel和低氧探针染色的代表性图像(比例尺：60μm)；数据表示为平均值
±
标准差，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，***p《0.0001。
19.图3为ab-flu的合成机理及表征；a：氟伐他汀在hsa表面的结合位点，以及tcep对hsa二硫键的还原；b：hsa和氟伐他汀结合构象的计算机模拟；c：ab-flu的tem图像，hsa与氟伐他汀的比率分别为1:0.2、1:0.5、1:1、1:1.5；d：ph值为7.4时测得的流体动力学直径分布；e：ph值为7.4时测得的ab-flu的zeta电位；f：氟伐他汀、hsa和ab-flu的紫外-可见吸收光谱；g：hsa和ab-flu的ftir光谱，1620～1450cm-1
处的吸收带和3130cm-1
处的特征吸收峰表征了flu的苯环结构。
20.图4为ab-flu在体外破坏线粒体的正常功能。a和b：在经hsa、flu和ab-flu处理的mc38细胞中用质谱检测氟伐他汀和辅酶q10的含量；c：jc-1染色的mc38细胞的荧光图像(比例尺：60μm)；d：代谢组测序分析得出ab-flu组存在793种不同代谢产物，其中468种代谢产物表达较高，325种代谢产物表达较低；e：代谢分析系统显示ab-flu组相较hsa组的差异代谢物所在的代谢途径；f：中心碳代谢途径中ab-flu组相较hsa组之间差异代谢物的统计热图；g：泛酸和辅酶a生物合成途径的基因集富集分析；h：癌症中心碳代谢途径中差异代谢物的统计热图；i：癌症中心碳代谢途径的基因集富集分析；j：描述不同处理间基因表达差一分布，水平虚线表示调整后的p值为0.05，垂直虚线表示差异倍数为1.3的绝对对数log2值(p值是根据与数据拟合的线性模型系数的t检验分析所得)；k：线粒体电子传递从nadh到泛醌途径中不同差异基因的mrnas统计热图；l～p：线粒体功能和活性相关途径中的基因集富集分析，线粒体电子传递nadh到泛醌途径(l)，线粒体atp合成的正调控耦合电子传递途径(m)，线粒体翻译终止途径(n)，线粒体呼吸途径(o)，线粒体膜途径(p)；数据表示为平均值
±
标准差，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
21.图5为ab-flu改善缺氧微环境，增强体内肿瘤特异性t细胞的活化；a：mc38荷瘤小鼠静脉注射给药后统计分析小鼠体内ab-flu的生物分布。b，肿瘤与正常器官组织中ab-flu含量的比率；c和d：mc38荷瘤小鼠治疗后的肿瘤组织切片缺氧探针染色(c)及荧光强度的统计分析(d)(标尺：100μm)；e～h：不同治疗组中肿瘤组织切片中cd3 /cd8 (e和f)和cd4 /cd25 (g和h)细胞的免疫荧光染色图像和荧光强度的统计分析(比例尺：100μm)；数据表示
为平均值
±
标准差，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
22.图6为ab-flu在体内增强了对抗pd1抗体的免疫反应；a：mc38小鼠结直肠癌移植瘤模型的肿瘤生长曲线；b和c：实验结束时切除肿瘤的照片(b)和重量统计图(c)；d：共聚焦激光扫描显微镜(clsm)拍摄肿瘤组织切片tunel染色的代表性图像(比例尺：100μm)；e和f：不同治疗组小鼠肿瘤切片中cd3 /cd8 (e)和cd4 /cd25 (f)细胞的免疫荧光染色图像(比例尺：100μm)；数据表示为平均值
±
标准差，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
23.图7为在人源性结直肠癌异种移植小鼠模型中，ab-flu增强了对pd1免疫检查点阻断的肿瘤免疫反应；a：结直肠癌pdx模型中常见的外显子基因突变鉴定；b：pdx模型中小鼠的分组处理示意图；c：pdx模型中小鼠的肿瘤生长曲线；d和e：实验结束时切除的肿瘤的照片(d)和重量统计图(e)；f：用激光共聚焦扫描显微镜(clsm)拍摄肿瘤组织切片tunel染色的代表性图像(比例尺：60μm)；g：在10天给药期间，不同处理组的小鼠体重；数据表示为平均值
±
标准差，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001。
24.其中，ab-flu为基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物，ab为人血清白蛋白(hsa)，flu为氟伐他汀(fluvastatin)。
具体实施方式
25.下面，结合实施例对本发明的技术方案进行说明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
26.下述实施例中，若未经特别说明，则ab-flu为基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物，ab为人血清白蛋白(hsa)，flu为氟伐他汀(fluvastatin)。
27.实施例1
28.本实施例提供了氟伐他汀在体内作用的验证试验。
29.为了验证氟伐他汀在体内的作用，首先将从罗恩试剂公司购买的氟伐他汀溶解在二甲基亚砜(dmso)溶液中，制成1μm氟伐他汀溶液，然后用该溶液处理培养皿中的mc38结肠癌细胞，孵育36小时后，收集细胞，并通过液相色谱-质谱仪(lc-ms)检测细胞内辅酶q10的表达量。与模拟处理的对照组相比，氟伐他汀将辅酶q10的浓度降低约一半(图2a)，这意味着氟伐他汀可能对细胞呼吸和耗氧量产生影响。为了进一步验证，我们还进行了jc-1线粒体膜电位测定，用激光共聚焦扫描显微镜(clsm)进行了拍照分析。与对照组相比，氟伐他汀处理组导致jc-1聚集物与其单体的比率在统计学上显著降低，表明氟伐他汀处理组细胞存在线粒体功能障碍(图2b和2c)。这些结果显示，氟伐他汀能降低肿瘤细胞内辅酶q10的表达水平，并在一定程度上造成了线粒体损伤。
30.这些结果迫使我们探索氟伐他汀在体内的功能，为此我们构建了mc38同种结直肠癌移植小鼠模型，以验证氟伐他汀联合抗pd1抗体的协同效应。具体做法为将1
×
106个mc38细胞皮下接种到c57bl/6小鼠的髂窝中，然后分为以下4组通过静脉注射进行14天的治疗：(1)生理盐水(对照组)；(2)5mg/kg抗pd1抗体，每周给药1次；(3)2mg/kg氟伐他汀，每两天给药一次；(4)抗pd1抗体与氟伐他汀联合用药。
31.试验结果表明，氟伐他汀没有显示出对抗pd1抗体敏感性增加的现象，与抗pd1单药治疗的肿瘤相比，联合治疗的小鼠肿瘤体积和重量没有显著差异(图2d-f)。为了进一步探讨其机制，我们进行了末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记染色(tunel)(图2g)
和低氧探针染色(图2h)，结果显示氟伐他汀既没有诱导细胞凋亡，也没有改善肿瘤微环境中的缺氧。经过lc-ms的检测，我们发现小鼠肿瘤中几乎没有氟伐他汀，由此推测氟伐他汀体内功能的失效可能是因为它不能在体内肿瘤细胞中积累。
32.实施例2
33.本实施例提供了基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物的制备。
34.为了克服氟伐他汀在肿瘤细胞内无法富集的问题，我们设计了一种温和有效的新策略，通过部分还原性hsa和疏水性氟伐他汀之间的超分子自组装构建球形纳米药物(ab-flu)(图1)。考虑到氟伐他汀的疏水性，我们推测氟伐他汀可能与hsa结构内的疏水沟槽结合。为了从理论上验证这一点，我们首先通过计算机辅助预测系统预测了部分还原性hsa的氟伐他汀结合位点，还原性hsa来源于破坏hsa表面的二硫键暴露出内部疏水沟槽(图3a)，经分析发现，在部分还原性hsa(图3a和b)中至少存在14个氟伐他汀结合位点。为了部分还原hsa，将150mm三氯甲基磷酸盐(tcep)添加到0.5mg/ml hsa溶液中，在该tcep浓度下hsa部分保持其二级结构。在这种情况下，将不同浓度的氟伐他汀添加到部分还原的hsa溶液中，并通过透射电子显微镜对其球形形态和粒径进行表征(图3c)。值得注意的是，ab-flu的颗粒大小可以通过改变hsa与氟伐他汀的比率来调整(图3c)，本试验中使用了1:1的比率，得到ab-flu的流体动力学直径为158.7nm(图3d)，是epr效应的适当尺寸。在ph值为7.4时测得ab-flu的zeta电位为-27.8mv，表明胶体稳定性良好(图3e)。使用紫外分光光度计对ab-flu进行检测，通过氟伐他汀的吸光度分析也证实了氟伐他汀与hsa的结合(图3f)。此外，通过红外分光光度计检测了hsa和ab-flu的ft-ir光谱，其中1620～1450cm-1
处的吸收带和3130cm-1
处的特征吸收峰表征了氟伐他汀的苯环结构(图3g)。
35.经上述验证，将hsa(5mg)溶解在pbs缓冲液(500μl)中，制成500μl hsa溶液并超声处理10分钟，将氟伐他汀(5mg)溶解在dmso试剂(20μl)中，获得20μl氟伐他汀溶液。然后以hsa的加入质量和氟伐他汀加入质量计，按照1:1的比率将500μl hsa溶液和20μl氟伐他汀溶液添加到含有150mm tcep的pbs缓冲液中，超声处理30分钟，得到所述基于白蛋白和氟伐他汀的纳米复合物(图3c)。
36.综上所述，我们开发了一种温和有效的从头合成策略，通过部分还原性hsa和疏水性氟伐他汀之间的超分子自组装，构建了具有球形形貌的尺寸可调的纳米结构。
37.实施例3
38.本实施例提供了ab-flu强效损伤线粒体的功能验证试验。
39.为了验证ab-flu的作用，将mc38结肠癌细胞与1μm氟伐他汀或ab-flu孵育48小时，并通过lc-ms对细胞内氟伐他汀的含量进行检测。
40.试验结果表明，在ab-flu处理的细胞中检测到的氟伐他汀水平远高于单独使用氟伐他汀处理的细胞，而在hsa治疗组中未检测到药物分子(图4a)，表明氟伐他汀经过纳米工程化后内化效率大大提高。与此对应，ab-flu几乎完全抑制了辅酶q10的合成，与氟伐他汀单一疗法形成鲜明对比(图4b)。同时，jc-1线粒体膜电位测定结果显示，在这三组中，ab-flu治疗组线粒体基质中红色荧光的jc-1多聚体显著减少，且绿色荧光的jc-1单体数量明显增多(图4c)。这些结果表明，ab-flu比氟伐他汀单体更显著地致使肿瘤细胞线粒体膜电位降低或消失。
41.为了进一步验证，我们对hsa处理的mc38细胞和ab-flu处理的mc38细胞进行了代
谢组学检测分析，在ab-flu处理组发现了793种差异代谢物，其中468种代谢物表达升高，其他325种代谢物表达下降(图4d)。kegg信号通路的富集分析表明，与hsa治疗相比，ab-flu治疗几乎改变了所有相关的代谢途径，尤其是能量代谢和线粒体稳态两个代谢途径(图4e)。值得注意的是，“泛酸和辅酶a生物合成”途径依赖于hmg-coa还原酶的作用，而hmg-coa还原酶正是氟伐他汀的作用靶点。此外，“癌症中的中心碳代谢”途径涉及线粒体呼吸，也被严重干扰发生紊乱。如预期所示，ab-flu在统计学上显著降低了“泛酸和辅酶a生物合成”途径(图4f和4g)和“癌症中心碳代谢”途径(图4h和4i)中的代谢物水平。此外，在转录组测序分析中发现，有967个基因因ab-flu治疗而发生改变(图4j)。在基因集富集分析(gsea)中发现，与线粒体电子传递从nadh到泛醌相关的基因表达显著下调(图4k和4l)。更重要的是，在基因本体论(go)富集分析中，很多与线粒体功能和活性相关的关键基因被显著抑制，这些基因涉及线粒体atp合成耦合电子传递(图4m)、线粒体翻译终止(图4n)、线粒体呼吸小体组装(图4o)、和线粒体包膜(图4p)。总而言之，所有结果共同表明，ab-flu通过抑制hmg-coa还原酶来抑制线粒体呼吸，具有使体内肿瘤缺氧微环境正常化的巨大潜力。
42.实施例4
43.本实施例提供了ab-flu改善了肿瘤缺氧微环境，从而使免疫微环境正常化的验证试验。
44.首先我们构建mc38小鼠结直肠癌移植瘤模型，使用五周龄雌性c57bl/6小鼠，将mc38细胞(1
×
106细胞/部位)植入小鼠双侧髋关节皮下。在进行体内实验之前，我们先利用该小鼠模型验证ab-flu的肿瘤靶向性。金离子通过氯金酸和硫醇之间的自发反应标记在ab-flu表面的游离硫醇上实现体内定量。向荷瘤小鼠静脉注射2mg/kgau标记的ab-flu后，通过电感耦合等离子体质谱(icp-ms)对器官和肿瘤中的197au含量进行定量。在图5a中ab-flu的生物分布以注射剂量的百分比(id％)表示，ab-flu在注射后表现出肿瘤富集现象，这一结果也在肿瘤与器官累积比率的计算分析中得到进一步的验证(图5b)。此外，在注射6小时后，对氟伐他汀注射组和ab-flu注射组的肿瘤内氟伐他汀含量进行对比，结果也同样表明ab-flu具有肿瘤富集趋势，这种纳米工程化策略实现了肿瘤内氟伐他汀的数量级增加。
45.后续实验采用mc38小鼠结直肠癌移植瘤模型，通过尾静脉注射剂量为100μl的生理盐水(对照)、2mg/kg的氟伐他汀或2mg/kg的ab-flu来测试其体内作用。如缺氧探针染色结果所示(图5c和5d)，在用ab-flu治疗的肿瘤中可以发现显著的氧水平恢复趋势。而且，与氟伐他汀单药治疗不同，ab-flu治疗显著增加了肿瘤浸润性细胞毒性t淋巴细胞(cd3 /cd8 细胞，图5e和5f)的数量，而同时也显著降低了调节性t淋巴细胞(cd4 /cd25 细胞，图5g和5h)的数量。综上所述，这些结果表明ab-flu可以改善肿瘤缺氧微环境，并使t细胞相关免疫微环境正常化。
46.实施例5
47.本实施例提供了ab-flu增强了体内对抗pd1抗体的免疫反应的验证及其在体内安全性的验证试验。
48.我们将mc38细胞(1
×
106细胞/部位)植入小鼠双侧髋关节皮下，构建mc38小鼠结直肠癌移植瘤模型，待肿瘤长至约50～100mm3时，将模型小鼠随机分组并分别给予剂量为100μl的生理盐水(对照)、2mg/kg的hsa、2mg/kg的hsa加5mg/kg的抗pd1抗体或2mg/kg的ab-flu加5mg/kg的抗pd1抗体联合治疗的处理。
49.与hsa或hsa/抗pd1组相比，接受ab-flu和抗pd1抗体联合治疗的小鼠肿瘤体积(图6a和6b)和重量(图6c)明显减少，肿瘤抑制效率(tgi)惊人地达到了98.79％(约为hsa/抗pd1抗体联合治疗的2倍)，远远超过其他治疗组的情况。与此结果一致的是，在tunel染色结果(图6d)中，ab-flu/抗pd1抗体联合治疗的肿瘤中发现的凋亡细胞数量多于其他组。此外，ab-flu和抗pd1抗体的联合治疗显著增加了肿瘤浸润cd8阳性t细胞的数量(图6e)，同时显著减少了treg细胞的数量(图6f)，提示联合治疗可有效逆转肿瘤内t淋巴细胞浸润不足的现象，并通过可靠的肿瘤免疫治疗增敏来增强抗肿瘤效果。值得注意的是，在ab-flu和抗pd1抗体联合治疗的小鼠中，没有发现明显的体重减轻，确保了这种超分子纳米药物在体内的药物安全性。
50.实施例6
51.本实施例提供了在人源性异种移植(pdx)结直肠癌小鼠模型中，ab-flu增强了对抗pd1抗体的肿瘤免疫反应的验证试验。
52.为了进一步探究ab-flu的作用，我们构建了人源化的结直肠癌患者异种移植(pdx)小鼠模型，最大限度地模拟人源性肿瘤微环境。为了建立该小鼠模型，将通过手术获得的具有临界驱动突变(图7a)的结直肠肿瘤块剪碎重新移植到nod/scid小鼠中。肿瘤移植2周后，通过静脉注射将1
×
106人外周血单核细胞植入小鼠体内。接下来，如图7b所示，待小鼠腋窝移植的肿瘤在50～100mm3范围时，将小鼠随机分配为对照组、抗pd1抗体治疗组、ab-flu和抗pd1抗体联合治疗组，在第1天和第5天分别通过腹腔注射剂量为100μl的生理盐水、5mg/kg的抗pd1抗体或5mg/kg的抗pd1抗体加2mg/kg的ab-flu。结果清晰明确地显示，ab-flu和抗pd1抗体联合治疗能产生更强的肿瘤抑制效果，该组tgi为62.2％，而抗pd1抗体单一治疗的tgi为48.8％(图7c)。更重要的是，与抗pd1抗体单一疗法相比，ab-flu和抗pd1抗体联合疗法治疗的小鼠的肿瘤体积(图7c和7d)和重量(图7e)显著减少；而且相比其他两组，联合治疗组的肿瘤中凋亡细胞数量也明显增加(图7f)。值得注意的是，在10天的给药期内，抗pd1抗体单药疗法和ab-flu与抗pd1抗体的联合疗法并未导致小鼠体重减轻(图7g)，表明了ab-flu作为免疫治疗增敏剂的安全性。综上所述，这些结果提供了丰富的证据，证明ab-flu协同治疗增强抗pd1抗体的肿瘤免疫应答。
53.如上所述，即可较好地实现本发明，上述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种改变和改进，均应落入本发明确定的保护范围内。