一种玉木耳含铁甘露聚糖的制备方法及其产品和应用

1.本发明涉及天然产物开发利用领域，特别是涉及一种玉木耳含铁甘露聚糖的制备 方法及其产品和应用。


背景技术：

2.酒精性肝损伤是由过度饮酒所导致的肝脏损伤，酒精性肝损伤可逐步恶化，发展 为明显的肝炎、肝硬化、肝纤维化等病理现象，与非酒精性肝损伤患者相比，疾病发 展更快，发生肝衰竭、肝癌等恶性疾病的风险更高。目前，尚无酒精性肝损伤的特效 药品。玉木耳隶属于担子菌门，层菌纲，木耳目，木耳科，木耳属，是近年来兴起的 一种新型食用菌品种。多糖是玉木耳主要活性成分之一，具有抗肿瘤活性、抗疲劳、 抗氧化、抗炎等多种生物学功能，但目前玉木耳含铁甘露聚糖的制备方法及相关生物 活性的研究仍处于空白。


技术实现要素：

3.本发明的目的是提供一种玉木耳含铁甘露聚糖的制备方法及其产品和应用，以解 决上述现有技术存在的问题，本发明采用仿生提取法制备了一种玉木耳含铁甘露聚糖， 该玉木耳含铁甘露聚糖通过抗氧化及炎症调节2个途径发挥改善酒精性肝损伤的作用。
4.为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
5.本发明提供一种玉木耳含铁甘露聚糖的制备方法，包括以下步骤：
6.(1)玉木耳子实体经破壁得到玉木耳匀浆；
7.(2)所述玉木耳匀浆经过人工胃液和人工肠液的酶解，得到酶解液；
8.(3)所述酶解液经过乙醇沉淀，得到所述玉木耳含铁甘露聚糖。
9.进一步地，所述人工胃液按0.37g胃蛋白酶中加入500ml胃电解质溶液，混合均 匀，然后调ph至2.0配制；所述胃电解质溶液按6.20gnacl、2.20gkcl、0.30gcacl2、 1.20gnahco3溶于2l蒸馏水中配制。
10.进一步地，所述人工肠液由70.0mg/ml胰酶溶液100ml中加入100ml肠电解质 溶液，混合均匀，然后调节ph至7.0制成；所述肠电解质溶液由10.80gnacl，1.30gkcl， 0.66gcacl2溶于2l蒸馏水配制。
11.进一步地，在步骤(3)中，乙醇沉淀时，乙醇在酶解液中的体积浓度为70％。
12.本发明还提供一种根据上述的制备方法制备得到的玉木耳含铁甘露聚糖。
13.进一步地，所述含铁甘露聚糖的单糖组成包括岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和 甘露糖，所述岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖的质量比为(0.5-1.5)：(1-3)： (40-45)：(10-20)：(55-65)。
14.进一步地，所述含铁甘露聚糖的铁元素含量为≧240mg/kg。
15.进一步地，所述含铁甘露聚糖的分子量为为450-580kda。
16.本发明还提供上述的玉木耳含铁甘露聚糖在制备改善酒精性肝损伤的产品中的应 用。
17.进一步地，所述改善酒精性肝损伤具体为：降低谷丙转氨酶酶活力、降低谷草转 氨酶酶活力、降低甘油三酯含量、提高谷胱甘肽含量、提高谷胱甘肽过氧化物酶酶活 性、提高超氧化物歧化酶活性、降低氧化产物丙二醛生成量、降低一氧化氮生成量、 抑制免疫因子白细胞介素-1β表达水平、抑制白细胞介素-6表达水平或抑制肿瘤坏死因 子-α表达水平。
18.本发明公开了以下技术效果：
19.本发明采用仿生提取法获得玉木耳含铁甘露聚糖，其玉木耳糖含量为92.77％，并 含有≧240mg/kg的铁元素，玉木耳含铁甘露聚糖分子量450-580kda，单糖组成及比例 为岩藻糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖＝(0.5-1.5)：(1-3)：(40-45)：(10-20)：(55-65)。 通过小鼠体内实验证实，本发明制备的玉木耳含铁甘露聚糖可降低慢性酒精性肝损伤 小鼠血清谷丙转氨酶(alt)酶活力、谷草转氨酶(ast)酶活力及甘油三酯(tg) 含量，提高谷胱甘肽(gsh)含量及谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px)酶活性，提高超 氧化物歧化酶(sod)活性，降低氧化产物丙二醛(mda)及一氧化氮(no)生成量， 抑制免疫因子白细胞介素-1β(il-1β)、白细胞介素-6(il-6)和肿瘤坏死因子-α(tnf-α) 的表达水平，通过抗氧化及炎症调节2个途径发挥改善酒精性肝损伤的作用。
附图说明
20.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所 需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些 实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据 这些附图获得其他的附图。
21.图1为葡聚糖分子量标准曲线；
22.图2为玉木耳含铁甘露聚糖的高效凝胶渗透色谱图；
23.图3为玉木耳含铁甘露聚糖单糖组成hplc图；
24.图4为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠血清alt活性的影响；
25.图5为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠ast活性的影响；
26.图6为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠tg含量的影响；
27.图7为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠gsh含量的影响；
28.图8为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠gsh-px活性的影响；
29.图9为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠sod活性的影响；
30.图10为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠mda生成量的影响；
31.图11为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠no生成量的影响；
32.图12为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠il-1β水平的影响；
33.图13为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠il-6水平的影响；
34.图14为玉木耳含铁甘露聚糖对酒精性肝损伤小鼠tnf-α水平的影响。
具体实施方式
35.现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限 制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
36.应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。 另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的 每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范 围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限 可独立地包括或排除在范围内。
37.除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规 技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发 明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中 提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在 与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
38.在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多 种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其 他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
39.关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用 语，即意指包含但不限于。
40.实施例1
41.采用仿生提取法提取玉木耳含铁甘露聚糖：
42.玉木耳干燥子实体粉碎，20目过筛，加入纯净水(玉木耳干燥子实体与水的质量比 为1：50)，置于破壁机中破壁2min，重复4次，得玉木耳匀浆。将玉木耳匀浆置于烧 杯中，加入等体积的人工胃液，37℃反应4h(人工胃液按0.37g胃蛋白酶中加入500ml 胃电解质溶液，混合均匀，然后用1.00mol/l盐酸调ph至2.0配制。胃电解质溶液按 6.20gnacl、2.20gkcl、0.30gcacl2、1.20gnahco3溶于2l蒸馏水中配制)。调节ph 至7.0，按体积比5：2加入人工肠液，37℃反应4h(人工肠液由70.0mg/ml胰酶溶液 100ml中加入100ml肠电解质溶液，混合均匀，然后用1.00mol/l碳酸氢钠调节ph 至7.0制成。肠电解质溶液由10.80gnacl，1.30gkcl，0.66gcacl2溶于2l蒸馏水配 制。70.0mg/ml胰酶溶液由7.00g胰酶溶于100ml水，5000g离心10min，取上清液 制成)。80℃水浴加热1h，室温冷却，7000r/min离心15min，去除沉淀。剩余溶液静 止过夜，分层，去除析出上清液。收集剩余溶液，加入无水乙醇至乙醇在剩余溶液中 的体积浓度为70％，4℃静置过夜。7000r/min离心15min，去除上清液，剩余沉淀冻干 即为玉木耳含铁甘露聚糖。测定所得玉木耳含铁甘露聚糖的糖含量为92.77％，铁元素 含量为289mg/kg。
43.实施例1制备的玉木耳含铁甘露聚糖结构分析
44.(1)玉木耳含铁甘露聚糖分子量测定
45.采用高效凝胶渗透色谱法对实施例1制备的玉木耳含铁甘露聚糖进行分子量测定， 根据样品的保留时间，确定样品的分子量大小，保留时间越小，分子量越大。色谱条 件为rid-10a视差折光检测器，tsk-gelg-3000pwxl色谱柱(7.8
×
300nm)，流动相为 蒸馏水，流速为0.6ml/min，柱温为35℃，进样量为10μl。得到分子量标准曲线方程 y＝-0.2336x 7.6677，r2＝0.9953。根据保留时间(图2)和标准曲线(图1)，计算玉木 耳含铁甘露聚糖分子量分别为529.568kda。
46.(2)玉木耳含铁甘露聚糖单糖组成分析
47.取干净色谱瓶，称量实施例1制备的玉木耳含铁甘露聚糖样品5mg，加入配制好 的tfa酸溶液，121℃加热2小时。通氮气吹干。加入甲醇清洗再吹干，重复3次。加 入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。流动相：a相：ddh2o；b相：200mmnaoh；c 相：200mmnaoh/500mmnaac。流速：0.5ml/min。按质量比，玉木耳含铁甘露聚 糖组成为岩藻糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖＝1.000：1.421：44.229：17.997：60.629 (图3)。
48.对比例1
49.水提醇沉法提取玉木耳多糖：玉木耳干燥子实体粉碎，20目过筛，加入纯净水(玉 木耳干燥子实体与水的质量比为1：85)，放入沸水浴中，提取5h，冷却后7000r/min 离心15min，收集上清液，残渣重复提取2次，合并提取液，浓缩，加入无水乙醇至乙 醇体积浓度为70％，4℃过夜，离心收集沉淀，沉淀干燥后即得玉木耳水提多糖。
50.本对比例提取的玉木耳粗多糖，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖和 葡萄糖组成，按质量分数为9.98％、1.55％、32.7％、11.97％、7.65％和36.15％。
51.对比例2
52.酶法提取玉木耳多糖：玉木耳干燥子实体粉碎，20目过筛，加入纯净水(玉木耳干 燥子实体与水的质量比为1：85)，调节溶液ph至5.00，加入果胶酶4.0ku/g，置于50℃ 水浴锅中浸提4h，85℃灭活果胶酶活性1h。7000r/min离心15min，收集上清液，浓 缩，加入无水乙醇至乙醇体积浓度为70％，4℃过夜，离心收集沉淀，沉淀干燥后即得 玉木耳酶提多糖。
53.本对比例提取的玉木耳多糖由岩藻糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组 成，按质量分数为7.51％、0.78％、20.53％、7.64％、9.33％和54.21％组成。
54.不同的提取方法获得的玉木耳多糖的糖含量及单糖组成存在明显差异。对比例1 利用水提醇沉法提取获得的玉木耳粗多糖，由岩藻糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半 乳糖和葡萄糖组成，按质量分数分别为9.98％、1.55％、32.7％、11.97％、7.65％和36.15％； 对比例2利用酶法提取的玉木耳多糖由岩藻糖、核糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄 糖组成，按质量分数分别为7.51％、0.78％、20.53％、7.64％、9.33％和54.21％。而本 发明采用半仿生提取法获得玉木耳含铁甘露聚糖，糖含量为92.77％，远高于上述提取 方法，且由岩藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，按质量比1.000：1.421：44.229：17.997：60.629组成，并且含有289mg/kg的铁元素，所得玉木耳含铁甘露聚糖与现有 技术均存在明显差别。
55.玉木耳含铁甘露聚糖抗酒精性肝损伤活性的研究
56.1.动物实验设计及处理
57.1.1动物分组
58.将90只balb/c小鼠随机分为6组，分别为空白对照组、模型组、水飞蓟宾组、玉 木耳含铁甘露聚糖高剂量组、玉木耳含铁甘露聚糖中剂量组、玉木耳含铁甘露聚糖低 剂量组，每组15只。
59.1.2动物模型建立及给药
60.除空白组外的各组小鼠，于造模开始的第1～15天灌胃40％乙醇，空白组注射生理 盐水；实验第15～36天，除空白组外的各组小鼠灌胃40％乙醇后2h灌胃各组对应给药 药物(其中，水飞蓟宾组每日给药量为100mg/kg，玉木耳含铁甘露聚糖高、中、低剂 量组每日给药量分别为200mg/kg、100mg/kg和50mg/kg)，建立小鼠酒精性肝损伤模 型。
61.1.3血清生化指标的测定
62.眼眶取血后，血浆放置30min，在6000r/min离心10min，分离血清，4℃冰箱保 存，3d内按照试剂盒(试剂盒购自南京建成生物科技有限公司)说明书方法检测血清 中谷丙转氨酶(alt)、谷草转氨酶(ast)活力及降低甘油三酯(tg)含量，结果分 别见图4、图5和图6。结果显示，灌胃乙醇后，模型组、水飞蓟宾组、玉木耳含铁甘 露聚糖高、中、低剂量组小鼠血清ast、alt酶活力及tg含量升高，给予水飞蓟宾 和玉木耳含铁甘露聚糖后，水飞蓟宾组、玉木耳含铁甘露聚糖高、中、低剂量组血清 ast、alt酶活力及tg含量下降，水飞蓟宾组、玉木耳含铁甘露聚糖高低剂量组接近 正常组水平。
63.1.4肝组织脂质过氧化指标的测定
64.4℃预冷生理盐水冲洗肝组织并制备10％肝脏组织匀浆(生理盐水制备)，4℃，6000 r/min离心10min，收集上清液，测定肝指标，按照试剂盒(试剂盒购自南京建成生物 科技有限公司)说明书方法检测谷胱甘肽(gsh)含量、谷胱甘肽过氧化物酶(gsh-px) 酶活性、超氧化物歧化酶(sod)酶活性、氧化产物丙二醛(mda)及no含量，结 果分别见图7、图8、图9、图10和图11。结果显示，灌胃乙醇后，小鼠肝脏gsh含 量、gsh-px和sod酶活性下降，给予水飞蓟宾和玉木耳含铁甘露聚糖后，水飞蓟宾 组、玉木耳含铁甘露聚糖高、中、低剂量组肝脏gsh含量、gsh-px酶活性、sod酶 活性升高，水飞蓟宾组、玉木耳含铁甘露聚糖高、中剂量组接近正常组水平。灌胃乙 醇后，小鼠肝脏mda及no生成量上升，给予水飞蓟宾和玉木耳含铁甘露聚糖后，水 飞蓟宾组、玉木耳含铁甘露聚糖高、中、低剂量组肝脏mda及no生成量下降，水飞 蓟宾组、玉木耳含铁甘露聚糖高剂量组接近正常组水平。
65.1.5肝组织免疫因子的测定
66.4℃预冷生理盐水冲洗肝组织并制备10％肝脏组织匀浆(生理盐水制备)，4℃，6000 r/min离心10min，收集上清液，测定肝指标，按照试剂盒(试剂盒购自江苏晶美生物 科技有限公司)说明书方法检测il-1β、il-6、tnf-α含量，结果分别见图12、图13 和图14。结果显示，灌胃乙醇后，小鼠肝脏il-1β、il-6、tnf-α含量上升，给予水飞 蓟宾和玉木耳含铁甘露聚糖后，水飞蓟宾组、玉木耳含铁甘露聚糖高、中、低剂量组 肝脏il-1β、il-6、tnf-α含量下降，水飞蓟宾组、玉木耳含铁甘露聚糖高剂量组接近 正常组水平。
67.本发明采用半仿生提取法获得的玉木耳含铁甘露聚糖，糖含量为92.77％，且由岩 藻糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，按质量比1.000：1.421：44.229：17.997：60.629 组成，并且含有289mg/kg的铁元素，不仅在化学组成上与现有技术存在明显差异，而 且其具有保护慢性酒精性肝损伤的活性。
68.以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行 限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案 做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。