青蒿素衍生物N-杂环卡宾金(I)杂化复合物

青蒿素衍生物n-杂环卡宾金(i)杂化复合物
1.本发明涉及新的特异性青蒿素(artemisinin)衍生物n-杂环卡宾金(carbene gold)(i)杂化复合物(hybrid complexes)及其在疗法中的用途。
2.对化学疗法和放射疗法的抗性仍然是癌症的成功治疗中的主要障碍。由于多种原因，癌症治疗期间可能会出现抗性，例如未被杀死的一些癌细胞会发生突变并产生抗性，可能会发生基因扩增导致蛋白质过度表达而使得治疗无效，或者癌细胞可能会发展成一种使治疗失活的机制。
3.核因子红细胞-2相关因子2(nuclear factor erythroid-2related factor 2，nrf2或nfe2l2)是一种氧化还原敏感的转录因子，该转录因子调节亲电体和异生质解毒酶以及外排蛋白的表达，从而在正常细胞中对氧化应激和细胞凋亡提供细胞保护。
4.癌细胞显示出药物解毒酶和外排泵的更多表达。由于癌细胞从细胞中消除有毒药物(例如，化学疗法药物)的能力，该特征可以导致癌症疗法抗性。进一步地，癌症中nrf2的增加会导致药物解毒酶和外排泵的表达增加。nrf2在对化学疗法和放射疗法有抗性的肿瘤中过度表达。
5.因此，nrf2是治疗癌症和恢复对常规治疗的敏感性的首选靶标。
6.在目前市场上或正在试验的不同抗癌药物中，其中一些是已知的和/或用于不同疗法目的，并且正在重新定位。
7.目前，青蒿素(artemisinin,art)及其衍生物代表了抗击疟疾的最重要的一类药物。2010年至2017年期间，全球因疟疾导致的死亡人数下降了28％，主要是由于art类联合疗法(art-based combination therapy,act)的使用。
8.然而，对art衍生物的兴趣不仅限于疟疾，因为已经显示出这种分子对病毒性疾病和癌症的目标活性。
9.在癌症的情况下，一种作用机制是基于活性氧类(reactive oxygen species,ros)的形成，这是由于通过来自游离血红素中的铁或经由铁死亡激活了art衍生物。这种激活主要发生在线粒体中，在线粒体中不断产生新鲜的血红素。已经证明，靶向线粒体的art衍生物比非靶向线粒体的art衍生物显示出更强的抗癌活性。
10.尽管如此，art在癌症中的疗效仍然不是最佳的。
11.此外，阳离子n-杂环卡宾(n-heterocyclic carbene,nhc)金(i)复合物显示出良好的抗癌活性，并且所讨论的主要作用机制涉及由于此类复合物的抗线粒体活性引起的细胞凋亡。在所描述的不同金复合物中，金诺芬(auranofin)是所述家族的原型。金诺芬被批准用于类风湿性关节炎的治疗，但目前正在研究金诺芬在肿瘤学和其他病理学中的重新定位。
12.因此，需要开发新的、有效的抗癌药物，这些药物将在对肿瘤组织具有特异性的同时是有效的。特别地，需要用于恢复对常规治疗的敏感性和/或用于降低癌细胞对化学疗法或放射疗法的抗性的新的且有效的抗癌药物。
13.本发明提出了旨在解决这些需求的新的青蒿素-金复合物：
14.实际上，如实施例中所示的，发明人已经发现掺入双氢青蒿素的醚衍生物的阳离
子双nhc金(i)复合物对癌组织具有细胞毒性和选择性。这些复合物是杂化的，因为复合物包括阳离子nhc金(i)复合物和双氢青蒿素的醚衍生物两者，双氢青蒿素的醚衍生物通过连接子(linker)与复合物融合(“杂化复合物”)。
15.所述杂化复合物显示出具有nm量级的ic
50
的抗肿瘤活性对肿瘤细胞具有特异性，并且比单独的青蒿素和单独的金诺芬显示出更高的抗肿瘤活性。
16.此外，不受任何理论的束缚，所述杂化复合物的作用机制似乎是原创的：它们抑制nrf2的转录活性，nrf2是参与解毒和消除ros的关键转录因子。
17.如实施例所示的，令人惊讶的是，杂化复合物在任何剂量下都抑制nrf2的活性，而青蒿素、金诺芬或阳离子型双nhc金(i)复合物(即不含青蒿素，以复合物3作为示例)中的每一个都激活nrf2。
18.因此，本发明首先涉及选自式(i)的化合物及其异构体的化合物：
[0019][0020]
其中：
[0021]
每个r独立地为c1-c6烷基、喹啉、苄基或均三甲苯基(mesityl)，
[0022]
x-为阴离子，以及
[0023]
n为等于3、4或5的整数。
[0024]
所谓异构体是指α和β异构体。所谓α和β异构体是指式(i)的化合物分别具有α或β构象的双氢青蒿素。
[0025]
优选地，式(i)的化合物为β异构体，该β异构体为式(i')的化合物。因此，优选地，本发明涉及选自式(i')的化合物的化合物：
[0026][0027]
其中：
[0028]
每个r独立地为c1-c6烷基、喹啉、苄基或均三甲苯基，
[0029]
x-是阴离子，以及
[0030]
n为等于3、4或5的整数。
[0031]
根据本发明的式(i)化合物对应于具有双氢青蒿素(dihydroartemisinin，dha)的醚衍生物的阳离子型双nhc金(i)复合物。dha是art的半合成衍生物以及所有art化合物的代谢物。
[0032]
art和dha分别对应于以下式(ii)和(iii)的化合物：
[0033][0034]
根据本发明的式(i)化合物包含两个r基团，该两个r基团可以是相同的或不同的，并且选自甲基、异丙基、喹啉、苄基和均三甲苯基基团。
[0035]
所谓“c1-c6烷基”是指包含1至6个碳原子的直链烃基，或包含3至6个碳原子的支链烃基。c1-c6烷基的实施例包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正戊基、异戊基和正己基，并且优选为甲基、正丁基、正戊基、正己基、异丙基或叔丁基。更优选地，c1-c6烷基是甲基或异丙基。
[0036]
所谓喹啉基团是指基团：
[0037][0038]
所谓苄基基团是指基团-ch
2-苯基，其中苯基是未被取代的。
[0039]
最后，所谓均三甲苯基基团是指下式(a)的基团：
[0040][0041]
优选地，两个r基团是相同的。
[0042]
优选地，两个r都是甲基。替代地，优选地，两个r都是异丙基。
[0043]
优选地，x-是选自卤素、硝酸根和六氟磷酸根的阴离子，优选选自氯化物(cl-)和硝酸根(no
3-)。
[0044]
优选地，本发明的式(i)化合物选自以下化合物：
[0045][0046]
化合物2a是式(i)的化合物，其中两个r都是甲基，x-为no
3-且n＝3。
[0047]
化合物2b是式(i)的化合物，其中两个r都是甲基，x-为cl-且n＝4。
[0048]
化合物2c是式(i)的化合物，其中两个r都是甲基，x-为cl-且n＝5。
[0049]
如实施例中所示的，本发明的式(i)化合物对癌组织具有细胞毒性和选择性。实际上，如表1至表3所示，与非癌细胞系(来自前列腺、成纤维细胞和成骨细胞的上皮细胞)相
比，所述化合物对各种癌症(即前列腺癌、乳腺癌、肝癌、骨癌、膀胱癌、肺癌和白血病)的癌细胞系具有非常高的特异性。
[0050]
此外，如表3所示，本发明的式(i)化合物令人惊讶地显示出比单独的青蒿素中的一种、单独的双nhc-金(i)复合物3(不含青蒿素或dha)中的一种、单独的金诺芬的一种、以及单独的双nhc-金(i)复合物3和单独的dha的混合物(以各自的摩尔比为1:2)中的一种显著高的抗肿瘤活性。
[0051]
有趣的是，本发明的化合物还显示出目标抗炎特性。实际上，它们显示出nf-κb通路的抑制作用，nf-κb通路是调节先天性和适应性免疫功能的炎症反应的中心通路。它们以剂量依赖性方式特别显示出由tnfα诱导的nf-κb转录因子的抑制作用：例如，化合物2a显示出约615nm的ic
50
，这远低于对金诺芬而言的2.96μm的ic
50
，且远低于对双氢青蒿素而言的8.91μm的ic
50
。
[0052]
本发明的化合物的制备
[0053]
本发明的化合物可以通过以下方法制备，如实施例的方案1所示：
[0054]-第一步，将dha与溴醇(bromoalcohol)反应，优选在催化剂的存在下，以便得到对应于单一β-异构体dha-c3至dha-c5的醚；
[0055]-第二步，将第一步得到的化合物与甲基咪唑反应，以便得到相应的卡宾前体(即，如前配体(proligand)1a到1c)；以及
[0056]-第三步，得到式(i)的化合物：
[0057]
ο对于具有n＝3的式(i)化合物而言，应用使用ag2o的转移金属化路径，然后利用agno3进行离子交换，随后加入au(sme2)cl；
[0058]
ο对于具有n＝4或5的式(i)化合物而言，应用使用k2co3和au(sme2)cl的直接金属化。
[0059]
具体而言，dha和nhcs前体通过使用不同长度c3至c5(根据式(i)中n的定义)的脂肪族连接子融合。
[0060]
合成从醚的形成开始，通过将dha(可商购的)与溴醇反应，优选在催化剂(诸如三氟化硼醚合物催化剂)的存在下并根据由海恩斯(haynes)(参见参考文献1)描述的用于c3-衍生物的过程，形成单一β-异构体dha-c3至dha-c5。
[0061]
下一步是溴代烷基dha衍生物(bromoalkyl dha derivative)与甲基咪唑之间的反应，以便获得相应的卡宾前体(诸如，前配体1a到1c)。
[0062]
靶标金复合物的形成通过两种方法实现：
[0063]-对于具有n＝3的式(i)化合物而言，使用包含弱碱ag2o的转移金属化路径，然后利用agno3进行离子交换，随后加入au(sme2)cl；
[0064]-对于具有n＝4或5的式(i)化合物而言，应用包含k2co3和au(sme2)cl的直接金属化。
[0065]
本发明的化合物的前配体
[0066]
本发明还涉及式(i)化合物的前配体，该前配体为如下式(iv)所定义的。
[0067]
因此，本发明涉及选自式(iv)的化合物及其异构体的化合物：
[0068][0069]
其中：
[0070]
每个r独立地为c1-c6烷基、喹啉、苄基或均三甲苯基，
[0071]
x-是阴离子，以及
[0072]
n为等于3、4或5的整数。
[0073]
所谓异构体是指α和β异构体。所谓α和β异构体是指式(iv)的化合物分别具有α或β构象的双氢青蒿素。优选地，式(iv)的化合物为β异构体，该β异构体为式(iv')的化合物。
[0074]
因此，优选地，本发明涉及式(iv')的化合物：
[0075][0076]
式(i)的化合物的所有上述定义也适用于式(iv)和(iv')的化合物。
[0077]
优选地，两个r基团是相同的，并且优选地是甲基或异丙基。
[0078]
优选地，x-是选自卤素、硝酸根和六氟磷酸根的阴离子，优选为溴化物(br-)。
[0079]
优选地，式(iv)或(iv')的化合物选自3'-甲基-1'-[10β-(20-丙氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓卤化物、3'-甲基-1'-[10β-(21-丁氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓卤化物和3'-甲基-1'-[10β-(21-戊氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓卤化物。
[0080]
优选地，式(iv)或(iv')的化合物选自3'-甲基-1'-[10β-(21-丙氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓溴化物、3'-甲基-1'-[10β-(21-丁氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓溴化物和3'-甲基-1'-[10β-(21-戊氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓溴化物。这些化合物在实施例中分别被描述为前配体1a、1b和1c。
[0081]
组合物和用途
[0082]
本发明还涉及一种组合物，该组合物包括在药学上可接受的介质中的至少一种根据本发明的式(i)化合物。
[0083]
本发明还涉及根据本发明的式(i)化合物作为药物的用途。
[0084]
本发明还涉及根据本发明的式(i)化合物用于预防和/或治疗癌症的用途。
[0085]
本发明还涉及根据本发明的式(i)化合物用于预防和/或治疗炎症的用途。
systems))、cdp-791(聚乙二醇化的difab、vegfr-2、细胞技术(celltech))、2c3(mab、vegf-a、百富勤药物(peregrine pharmaceuticals))、vegf-trap(可溶性杂合受体vegf-a、pigf(胎盘生长因子)安内特/再生元(aventis/regeneron))。
[0105]
优选地，免疫疗法是单克隆抗体，优选地是抗检查点抗体。
[0106]
抗检查点抗体包括直接针对免疫检查点的抗体，该抗体可以选自pd1、pdl1、pdl2、ctla4、btla、cd27、cd40、ox40、gitr(也称为“肿瘤坏死因子受体超家族成员18(tumor necros
ì
s factor receptor superfamily member 18)”或tnfrsf18)、cd137(也称为4-1bb或tnfrs9)、cd28、icos、ido(吲哚胺2,3-双加氧酶)、b7h3(也称为cd276)、kir2dl2(也称为杀伤细胞免疫球蛋白样受体2dl2(killer cell immunoglobulinlike receptor 2dl2))、nkg2(c型外源凝集素受体家族(a family of the c-type lectin receptors))、lag3(也称为淋巴细胞激活基因-3(lymphocyte activation gene-3))和cd70。优选地，抗检查点抗体是抗pd1、抗pdl1、抗pdl2或抗ctla4抗体。抗pd1抗体包括纳武利尤单抗(nivolumab)和派姆单抗(pembrolizumab)。抗ctla4抗体包括伊匹单抗(ipilimumab)和曲美木单抗(tremelimumab)。
[0107]“化学疗法”或“化学治疗剂”是指在治疗癌症中使用的、并且具有抑制人类肿瘤(特别是恶性(癌性)病变)的发展或进展的功能特性的化合物。
[0108]
化学治疗剂具有不同的作用模式，例如，通过影响dna或rna并干扰细胞周期复制。
[0109]
在dna水平或rna水平上作用的化学治疗剂的实施例是：
[0110]-抗代谢物，例如硫唑嘌呤、阿糖胞苷、磷酸氟达拉滨、氟达拉滨、吉西他滨、阿糖胞苷、克拉屈滨、卡培他滨6-巯基嘌呤、6-硫代鸟嘌呤、甲氨蝶呤、5-氟尿嘧啶(5-fluoroouracil)和羟基脲；
[0111]-烷基化剂，例如美法仑、白消安、顺铂、卡铂、环磷酰胺、异环磷酰胺、达卡拉巴嗪(dacarabazine)、福莫司汀、丙卡巴肼、苯丁酸氮芥、噻替派、洛莫司汀、替莫唑胺；
[0112]-抗有丝分裂剂，例如长春瑞滨、长春新碱、长春花碱、多西紫杉醇、紫杉醇；
[0113]-拓扑异构酶抑制剂，例如多柔比星(doxorubincin)、安吖啶、伊立替康、柔红霉素、表柔比星、丝裂霉素、米托蒽醌、伊达比星、替尼泊苷、依托泊苷、拓扑替康；
[0114]-抗生素，例如放线菌素和博来霉素；
[0115]-天冬酰胺酶；
[0116]-蒽环类或紫杉烷。
[0117]
其他化学治疗剂是酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitors，tki)。大量tki正处于晚期和早期开发阶段，以用于治疗各种类型的癌症。示例性tki包括但不限于：bay43-9006(索拉非尼，)和su11248(舒尼替尼，、甲磺酸伊马替尼(诺华)；吉非替尼(阿斯利康)；盐酸埃罗替尼(基因技术)；凡德他尼(阿斯利康)、替吡法尼(杨森制药)；达沙替尼(百时美施贵宝)；洛那法尼(先灵葆雅)；琥珀酸瓦他拉尼(诺华，先灵制药)；拉帕替尼(葛兰素史克)；尼罗替尼(诺华)；来他替尼(瑟法隆)；盐酸帕唑帕尼(葛兰素史克)；阿昔替尼(辉瑞)；卡那替尼二盐酸盐(辉瑞)；培利替尼(国家癌症研究所，惠氏)；坦度替尼(millennium)；博舒替尼(惠氏)；司马沙尼(sugen,taiho)；azd-2171
(阿斯利康)；vx-680(默克，威泰克斯(vertex))；exel-0999(exelixis)；arry-142886(array生物制药，阿斯利康)；pd-0325901(辉瑞)；amg-706(安进)；bibf-1120(勃林格殷格翰)；su-6668(taiho)；cp-547632(osi)；(aee-788(诺华)；bms-582664(布里斯托尔-迈尔斯斯奎布)；jnk-401(新基生物制药)；r-788(rigel)；azd-1152hqpa(阿斯利康)；nm-3(健赞公司oncology)；cp-868596(辉瑞)；bms-599626(百时美施贵宝)；ptc-299(ptc疗法)；abt-869(雅培)；exel-2880(exelixis)；ag-024322(辉瑞)；xl-820(exelixis)；osi-930(osi)；xl-184(exelixis)；krn-951(kirin brewery)；cp-724714(osi)；e-7080(eisai)；hki-272(惠氏)；chir-258(chiron)；zk-304709(先灵制药ag)；exel-7647(exelixis)；bay-57-9352(拜耳)；bibw-2992(勃林格殷格翰)；av-412(aveo)；yn-968d1(advenchen laboratories)；星形孢菌素、米哚妥林(pkc412，诺华)；哌立福辛(aeterna zentaris，keryx，国家癌症研究所)；ag-024322(辉瑞)；azd-1152(阿斯利康)；on-01910na(onconova)；以及，azd-0530(阿斯利康)。
[0118]
本文中还描述了(i)用于预防或治疗癌症的方法，(ii)用于增加癌症对化学治疗剂敏感性的方法，和(iii)用于降低癌症相对于化学治疗药物抗性的方法，每种所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种如上定义的式(i)化合物，优选连同化学治疗药物一起施用。
[0119]
抗炎用途
[0120]
本发明的式(i)化合物可以用于预防和/或治疗炎症。
[0121]
所谓“预防”是指避免炎症发生。
[0122]
所谓“治疗”是指炎症的治愈性治疗。治愈性治疗被定义为完全治疗(治愈)或部分治疗炎症的治疗。
[0123]“受试者”是指任何受试者并且通常是定名为受炎症折磨的患者，或正在接受炎性疾病治疗的受试者，或处于发展为炎性疾病的风险中或疑似处于发展为炎性疾病风险中的受试者。在任何情况下，受试者优选地是脊椎动物，更优选地是哺乳动物，甚至更优选地是人。
[0124]
炎性疾病优选为慢性炎性疾病，并且可以选自类风湿性关节炎、克罗恩病、炎性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)、骨关节炎、骨质疏松症、皮炎、牛皮癣、哮喘、呼吸窘迫综合征和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，copd)。
[0125]
本文中还描述了一种预防和/或治疗炎性疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的至少一种如上定义的式(i)化合物。
[0126]
本发明的式(i)化合物优选以治疗有效量或剂量来施用。如本文所使用的，“治疗有效量或剂量”是指本发明化合物在受试者(优选人类)中预防、消除、减缓疾病，或减少或延迟由所述疾病引起或与所述疾病相关的一种或几种症状或病症的量。本领域技术人员可以确定和调整本发明化合物及其药物组合物的有效量，更一般地说是施用方案。可以通过常规技术的使用并通过观察在类似情况下获得的结果来确定有效剂量。本发明化合物的治疗有效剂量将根据待治疗或预防的疾病、疾病的严重程度、施用途径、涉及的任何联合疗法、患者的年龄、体重、一般医疗状况、病史等而变化。
[0127]
通常，对患者施用的化合物的量可以在人类患者体重的约0.01mg/kg至500mg/kg的范围内。在一个具体实施方案中，根据本发明的药物组合物包含0.01mg/kg至300mg/kg、
优选0.01mg/kg至3mg/kg(例如25mg/kg至300mg/kg)的本发明化合物。
[0128]
在一个特定方面，本发明的化合物可以通过肠胃外途径、局部途径、口服途径或静脉内注射向受试者进行施用。本发明的化合物或纳米颗粒可以在连续几天内(例如在连续2至10天，优选地连续3至6天)每天(例如每天1、2、3、4、5、6或7次)向受试者进行施用。所述治疗可在1、2、3、4、5、6或7周期间、或每两周或每三周、或每一个月、每二个月或每三个月重复。替代地，可以执行几个治疗周期，任选地在两个治疗周期之间有一个间断周期，例如1、2、3、4或5周。本发明的化合物可以例如每周一次、每两周一次或每月一次以单剂量施用。治疗可以每年重复一次或多次。以适当的间隔施用剂量，该间隔可以由技术人员确定。选择的量将取决于多种因素，包括：施用途径，施用持续时间，施用时间，化合物或与所述化合物组合使用的各种产品的消除速率，患者的年龄、体重和身体状况和他/她的病史，以及医学上已知的任何其他信息。
[0129]
施用途径可以是口服、局部或肠胃外，通常是直肠、舌下、鼻内、腹膜内(intra-peritoneal，ip)、静脉内(intra-venous，iv)、动脉内(intra-arterial，ia)、肌肉内(intra-muscular，im)、小脑内、鞘内(intrathecal)、瘤内和/或皮内。该药物组合物适用于上述途径中的一种或几种。药物组合物优选通过注射或通过适合无菌溶液的静脉输注、或以液体或固体剂量的形式经由消化道施用。
[0130]
本发明还涉及一种组合物，该组合物包括在药学上可接受的介质中的至少一种根据本发明的式(i)化合物。这种组合物包含药学上可接受的介质(或载体)。
[0131]
在与制剂的其他成分相容并且对其接受者无害的意义上，载体必须是“可接受的”。
[0132]
药物组合物可以以本领域已知的方式配制为药学相容溶剂中的溶液，或配制为凝胶、油、乳剂、悬浮液或在合适药用溶剂或赋形剂中的分散体，或配制位含有固体媒介物的丸剂、片剂、胶囊、粉剂、栓剂等，可能通过提供持续和/或延迟释放的剂型或装置。对于这种类型的制剂而言，使用诸如纤维素、脂质、碳酸盐(酯)或淀粉的试剂是有利的。
[0133]
可以在制剂(液体和/或注射剂和/或固体)中使用的试剂或媒介物是赋形剂或惰性媒介物，即药学上无活性且无毒的媒介物。
[0134]
可以提及例如是盐水、生理溶液、等渗溶液和/或缓冲溶液，其与药物用途相容并且是本领域技术人员已知的。组合物可包含一种或多种选自分散剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂等的试剂或媒介物。
[0135]
具体实施例是甲基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、环糊精、聚山梨醇酯80、甘露醇、明胶、乳糖、脂质体、植物油或动物油、阿拉伯树胶等。优选使用植物油。
[0136]
适用于口服施用的本发明的制剂可以是以作为胶囊、散剂(sachet)、片剂或锭剂的离散单元形式，每个都含有预定量的活性成分；以粉末或颗粒形式；以在水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液的形式；或以水包油乳液或油包水乳液的形式。
[0137]
适合肠胃外便利地施用的制剂包含活性成分的无菌油性或水性制剂，该制剂优选与接受者的血液等渗。每个这样的制剂还可以包含其他药学相容且无毒的助剂，例如稳定剂、抗氧化剂、粘合剂、染料、乳化剂或调味物质。
[0138]
本技术中使用的附图如下，且仅用于说明性目的：
[0139]
图1：在不同时间处理后，双氢青蒿素(dha)和金复合物(金诺芬和复合物2a))对
pc-3、a549、mcf-7和hepg2细胞ros的诱导。与0h时的ros生成相比，*p《0.05，**p《0.005，***p《0.001。
[0140]
图2：n-乙酰-l-半胱氨酸(nac)和还原型谷胱甘肽(gsh)对复合物2a细胞毒性的影响。在不存在或存在不同浓度nac和gsh的情况下，用复合物2a(1mm)处理hepg2细胞24小时。通过mtt试验测定细胞活力(cell viability)。数据表示为三个独立实验的平均值
±
sem。与单独的复合物2a的细胞活力相比，*p《0.05,**p《0.005,***p《0.001。
[0141]
图3：复合物2a对离体的哺乳动物trxr的ic
50
值。
[0142]
图4：nrf2转录活性。
[0143]
稳定整合到hepg2细胞中的含有在are控制下的萤火虫荧光素酶基因的are报告基因(reporter)—hep g2细胞系用于在用指定剂量的不同复合物处理16小时后量化nrf2转录活性。结果显示为are荧光素酶报告基因表达的诱导倍数。虚线表示1倍的诱导(值》1的平均激活和值《1的平均抑制)。
[0144]
根据制造商的说明，验证细胞系对叔丁基氢醌(tert-butylhydroquinone，tbhq)刺激的响应(a)。
[0145]
显示出are报告基因-hep g2细胞对金诺芬(b)、dha(c)、化合物3(d)和化合物2a(e)的剂量响应，其中“对数(抑制剂)比响应(log(inhibitor)vs.response)”以连续的浅灰色线(e)表示。
[0146]
图5：nf-κb转录活性。
[0147]
使用nf-κb报告基因(luc)-a549稳定细胞系以量化指定剂量的本发明分子对由1ng/ml tnfα活化的(处理7小时)nf-κb转录活性的抑制作用。
[0148]
使用光度计读取发光，并且将读数归一化为仅包含介质的孔，以获得相对发光单位(relative luminescence units，rlu)。
[0149]
误差条＝标准偏差(sd)。
[0150]
由tnfα活化的nf-κb报告基因-a549细胞对金诺芬(a)、dha(b)、化合物3(c)和化合物2a(d)的剂量响应，其中“对数(抑制剂)与响应”以连续的浅灰色线(a至d)表示。
实施例
[0151]
1.材料
[0152]
所有络合反应均在干燥氮气的惰性气氛下、通过使用标准真空管线和施兰克(schlenk)管技术执行。在排除光的情况下执行涉及银化合物的反应。ch3cn在cah2上干燥并随后蒸馏。10β-(20-溴丙氧基)双氢青蒿素(dha-c3)是根据修改后的文献
[1]
合成的。所有其他试剂均按从商业供应商处收到的原样使用。
[0153]
人前列腺癌pc-3和肺癌a549细胞系获自dsmz(布伦瑞克，德国)。人膀胱癌t24、人骨肉瘤u-2os、人乳腺癌mcf-7、人肝癌hepg2细胞、人正常上皮前列腺rpwe-1、人慢性髓样白血病(human chronic myeloid leukemia)lama、小鼠成骨细胞mc3t3和鼠成纤维细胞nih3t3来自atcc-lgc标准(莫尔塞姆，法国)。所有细胞培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)和磷酸盐缓冲盐水(pbs)均购自赛默飞世尔科技公司。n-乙酰基-l-半胱氨酸(n-acetyl-l-cysteine，nac)、还原型谷胱甘肽(gsh)和3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，
mtt)购自西格玛-奥德里奇。
[0154]
2.装设仪器
[0155]1h(300mhz或400mhz)和
13
c nmr谱(75mhz或101mhz)以及二维实验在bruker av300、bruker av400或bruker avance 500光谱仪上、以cdcl3作为溶剂、在298k来记录。对1h和
13
c的所有化学位移都是相对于使用溶剂的1h(残余的)或
13
c化学位移作为二级标准的tms而言的。基于化学位移、自旋-自旋耦合常数、分块模式和信号强度对所有1h和
13
c信号进行分配，并通过使用1h-1
h cosy45、1h-13
c hmbc和1h-13
c hsqc/hmqc对复合物2a-2c进行实验。实现了包括每个增量2次扫描的梯度增强的1h cosy45。使用梯度增强的hsqc/hmqc序列的1h-13
c相关光谱(对145hz的1j
ch
而言的延迟是优化的)是利用每个增量的2次扫描来获得的。执行了梯度增强的hmbc实验，以允许62.5ms的长程耦合演化(累积8次扫描)。通常，对于256个t1增量而言，收集1024个t2数据点。通过“service de spectrom
é
trie de masse de chimie ups-cnrs(图卢兹)”使用电喷雾电离(electrospray ionization，esi)来利用x
é
vo g2 qtof waters光谱仪进行高分辨率质谱(high resolution mass spectrometry，hrms)分析。元素分析通过“service de microanalysis du laboratoire de chimie de coordination(图卢兹)”来进行。使用promega e7031酶标仪测量mtt试验的吸光度。
[0156]
3.前配体1a-1c和复合物2a-2c的合成
[0157]
用于制备复合物2a-2c的一般方案如下：
[0158]
方案一、前配体1a-1c和金(i)复合物2a-2c的合成。
[0159][0160]
复合物2a-2c是根据本发明的式(i)的化合物。
[0161]
为了融合dha和nhc前体，发明人使用了不同长度c3至c5的脂肪族连接子。合成(方案1)从醚的形成开始，在三氟化硼醚合物催化剂的存在下、根据由海恩斯(haynes)描述的
c3-衍生物的过程、通过将dha与溴醇反应来形成单一β-异构体dha-c3至dha-c5(参见文献1)。下一步是溴代烷基dha衍生物与甲基咪唑之间的反应，以便获得相应的卡宾前体1a到1c，产率在39％至92％的范围内。靶标金复合物的形成通过以下两种方法实现。对于c3衍生物而言，使用了包含弱碱ag2o的便利转移金属化路径，然后用agno3进行离子交换并且随后加入au(sme2)cl。对于c4和c5衍生物而言，应用了包含k2co3和au(sme2)cl的直接金属化。金(i)复合物2a-2c通过色谱法纯化后分离为白色固体，产率为31％至84％。所有化合物通过1h和
13
c nmr光谱、高分辨率质谱和元素分析表征。
[0162]
3.1.前配体1a-1c的合成
[0163]
下图描述了h(1h nmr)和c(
13
c nmr)的编号。这些符号用于以下实验章节。
[0164][0165]
10β-(20-溴丙氧基)双氢青蒿素(dha-c3)
[1]
[0166]
在氮气气氛下，将双氢青蒿素(dha)(2g，7.0mmol)溶解在200ml et2o中。加入3-溴丙烷-1-醇(0.76ml,8.4mmol,1.2当量)和bf3.et2o(6滴)，并将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后该溶液用nahco3的饱和溶液处理，且产物用et2o(3
×
20ml)萃取。合并的有机相用na2co3干燥、过滤，且将溶剂蒸发至干燥。粗产物通过硅胶柱色谱、使用己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂(100/0至100/20)来纯化，以得到白色固体(1.277g，45％产率)。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝5.44(s,1h,h12),4.82(d,j＝3.4hz,1h,h10),4.04-3.97(m,1h,h18),3.54-3.47(m,3h,h18、h20),2.70-2.60(m,1h,h9),2.43-2.33(m,1h,h4),2.15-2.06(m,2h,h19),2.03-2.01(m,1h,h4),1.94-1.85(m,1h,h5),1.80-1.72(m,2h,h8),1.68-1.62(m,1h,h7),1.54-1.50(m,1h,h8a),1.49-1.47(m,1h,h5),1.46(s,3h,h14),1.37-1.30(m,1h,h6),1.29-1.23(m,1h,h5a),0.97(d,j＝6.3hz,3h,h15),0.94-0.89(m,1h,h7),0.92(d,j＝7.4hz,3h,h16)。
13
c nmr(75mhz,cdcl3):δ＝104.05(1c,c3),102.07(1c,c10),87.89(1c,c12),80.99(1c,c12a),65.66(1c,c18),52.56(1c,c5a),44.36(1c,c8a),37.42(1c,c6),36.40(1c,c4),34.62(1c,c7),32.52(1c,c19),30.86(1c,c9),30.57(1c,c20),26.16(1c,c14),24.65-24.49(2c,c5,c8),20.35(1c,c15),12.96(1c,c16)。
[0167]
10β-(21-溴丁氧基)双氢青蒿素(dha-c4)
[0168]
在氮气气氛下，将双氢青蒿素(dha，500mg，1.76mmol)溶解在200ml et2o中。加入3-溴丁烷-1-醇(398ml,2.6mmol,1.48当量)和bf3.et2o(6滴)，并将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后该溶液用nahco3的饱和溶液处理，且产物用et2o(3
×
20ml)萃取。合并的有机相用na2co3干燥、过滤，且将溶剂蒸发至干燥。粗产物通过硅胶柱色谱、使用己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂(100/0至100/20)来纯化，以得到白色固体(220.3mg，29％产率)。分析计算(anal.calcd.)的c
19h31
bro5:c,54.42；h,7.45。发现的：c,54.36；h,7.38。1h nmr(400mhz,
cdcl3):δ＝5.40(s,1h,h12),4.80(d,j＝3.2hz,1h,h10),3.9-3.88(m,1h,h18),3.50-3.36(m,3h,h18,h21),2.71-2.59(m,1h,h9),2.45-2.32(m,1h,h4),2.08-2.03(m,1h,h4),1.99-1.86(m,3h,h19,h5),1.83-1.74(m,4h,h8,h20),1.70-1.63(m,1h,h7),1.56-1.53(m,1h,h8a),1.51-1.49(m,1h,h5),1.46(s,3h,h14),1.38-1.32(m,1h,h6),1.30-1.26(m,1h,h5a),0.98(d,j＝6.3hz,3h,h15),0.97-0.95(m,1h,h7),0.92(d,j＝7.4hz,3h,h16)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3):δ＝104.10(1c,c3),102.02(1c,c10),87.92(1c,c12),81.10(1c,c12a),67.44(1c,c18),52.58(1c,c5a),44.42(1c,c8a),37.49(1c,c6),36.44(1c,c4),34.64(1c,c7),33.63(1c,c21),30.90(1c,c9),29.83(1c,c19),28.34(1c,c20),26.22(1c,c14),24.69-24.51(2c,c5,c8),20.37(1c,c15),13.04(1c,c16)。hrms(es

):计算的c
19h31
brnao
5 m/z＝441.1253；发现的441.1251。
[0169]
10β-(22-溴戊氧基)双氢青蒿素(dha-c5)
[0170]
在氮气气氛下，将双氢青蒿素(dha，1g，3.5mmol)溶解在200ml et2o中。加入3-溴戊烷-1-醇(601ml,3.6mmol,1.03当量)和bf3.et2o(6滴)，并将反应混合物在室温下搅拌4小时。然后该溶液用nahco3的饱和溶液处理，且产物用et2o(3
×
20ml)萃取。合并的有机相用na2co3干燥、过滤，且将溶剂蒸发至干燥。粗产物通过硅胶柱色谱、使用己烷-乙酸乙酯作为洗脱剂(100/0至100/20)来纯化，以得到白色固体(314.4mg，21％产率)。分析计算的c
20h33
bro5:c,55.43；h,7.68。发现的：c,55.49；h,7.82。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝5.41(s,1h,h12),4.79(d,j＝3.2hz,1h,h10),3.87(dt,j＝9.8,6.2hz,1h,h18),3.45-3.37(m,3h,h18,h22),2.66-2.61(m,1h,h9),2.39(ddd,j＝14.5,13.4,3.9hz,1h,h4),2.08-2.02(m,1h,h4),1.94-1.87(3h,h5,h21),1.82-1.77(m,1h,h7),1.67-1.48(m,8h,h5,h8,h8a,h19,h20),1.50(s,3h,h14),1.40-1.32(m,1h,h6),1.29-1.22(m,1h,h5a),0.97(d,j＝6.3hz,3h,h15),0.98-0.91(m,1h,h7),0.92(d,j＝7.4hz,3h,h16)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3):δ＝104.05(1c,c3),101.99(1c,c10),87.92(1c,c12),81.12(1c,c12a),68.01(1c,c18),52.58(1c,c5a),44.45(1c,c8a),37.46(1c,c6),36.44(1c,c4),34.66(1c,c7),33.81(1c,c22),32.41(1c,c21),30.92(1c,c9),28.82(1c,c19),26.21(1c,c14),24.96(1c,c20),24.68-24.48(2c,c5,c8),20.36(1c,c15),13.04(1c,c16)。hrms(es

):计算的c
20h33
brnao
5 m/z＝455.1409；发现的455.1409。
[0171][0172]
3'-甲基-1'-[10β-(20-丙氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓溴化物(1a)
[0173]
在回流条件下、向搅拌的dha-c3(304mg,0.75mmol)的ch3cn(6ml)溶液中加入1-甲基咪唑(60μl，0.75mmol)，并将反应混合物在回流条件下搅拌3天。溶剂在减压条件下蒸发，且粘性残留物通过硅胶色谱、用ch2cl
2-meoh作为洗脱剂(1/0.1至1/0.25)来纯化，以获得白色固体(238mg，65％产率)。分析计算的c
22h35
brn2o5:c,54.21；h,7.24；n,5.75。发现的c,
54.12；h,7.26；n,5.68。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝10.44(s,1h,h2'),7.48(s,1h,h4'),7.38(s,1h,h5'),5.38(s,1h,h12),4.79(d,j＝3.6hz,1h,h10),4.44(t,j＝7.2hz,2h,h20),4.14(s,3h,h6'),3.92-3.86(m,1h,h18),3.53-3.47(m,1h,h18),2.68-2.61(m,1h,h9),2.37(ddd,j＝14.6,13.4,4.0hz,1h,h4),2.29-2.22(m,2h,h19),2.04(ddd,j＝14.6,4.9,2.9hz,1h,h4),1.93-1.86(m,1h,h5),1.81-175(m,1h,h7),1.72-1.61(m,2h,h8),1.51-1.44(m,2h,h5,h8a),1.42(s,3h,h14),1.38-1.31(m,1h,h6),1.29-1.23(m,1h,h5a),0.97(d,j＝6.3hz,3h,h15),0.95-0.89(m,1h,h7),0.92(d,j＝7.4hz,3h,h16)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3):δ＝137.90(1c,c2'),123.37(1c,c4'),122.15(1c,c5'),104.23(1c,c3),102.20(1c,c10),87.96(1c,c12),80.92(1c,c12a),64.60(1c,c18),52.42(1c,c5a),47.48(1c,c20),44.16(1c,c8a),37.45(1c,c6'),36.90(1c,c6),36.33(1c,c4),34.45(1c,c7),30.77(1c,c9),30.60(1c,c19),26.10(1c,c14),24.63-24.57(2c,c5,c8),20.29(1c,c15),13.13(1c,c16)。hrms(es

)：计算的c
22h35
n2o
5 m/z＝407.2545；发现的407.2546。
[0174]
3'-甲基-1'-[10β-(21-丁氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓溴化物(1b)
[0175]
在回流条件下、向搅拌的dha-c4(75mg,0.18mmol)的ch3cn(3ml)溶液中加入1-甲基咪唑(57μl，0.72mmol，4当量)，并将反应混合物在回流条件下搅拌5天。溶剂在减压条件下蒸发，粘性残留物通过硅胶色谱、用ch2cl
2-meoh作为洗脱剂(1/0.1至1/0.25)来纯化，以获得白色固体(83mg，92％产率)。分析计算的c
23h37
brn2o5:c,55.09；h,7.44；n,5.59。发现的为c,55.12；h,7.56；n,5.58。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝10.38(s,1h,h2'),7.55(t,1h,j＝1.8hz,h4'),7.42(t,1h,j＝1.8hz,h5'),5.34(s,1h,h12),4.75(d,j＝3.4hz,1h,h10),4.37(t,j＝7.4hz,2h,h21),4.10(s,3h,h6'),3.83(dt,1h,j＝9.9,6.0hz,h18),3.40(dt,1h,j＝9.9,6.4hz,h18),2.62-2.52(m,1h,h9),2.37-2.29(m,1h,h4),2.04-1.83(m,3h,h4,h20),1.90-1.83(m,1h,h5),1.73-1.59(m,5h,h7,h8,h19),1.51-1.41(m,2h,h8a,h5),1.39(s,3h,h14),1.35-1.27(m,1h,h6),1.25-1.17(m,1h,h5a),0.94(d,j＝6.3hz,3h,h15),0.91-0.83(m,1h,h7),0.87(d,j＝7.3hz,3h,h16)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3):δ＝137.95(1c,c2'),123.41(1c,c4'),121.59(1c,c5'),104.13(1c,c3),102.12(1c,c10),87.91(1c,c12),81.03(1c,c12a),67.43(1c,c18),52.49(1c,c5a),49.88(1c,c21),44.29(1c,c8a),37.43(1c,c6'),36.82(1c,c6),36.38(1c,c4),34.51(1c,c7),30.84(1c,c9),27.28-26.44(2c,c19,c20),26.17(1c,c14),24.65-24.52(2c,c5,c8),20.32(1c,c15),13.09(1c,c16)。hrms(es

)：计算的c
23h37
n2o5m/z＝421.2702；发现的421.2704。
[0176]
3'-甲基-1'-[10β-(22-戊氧基)双氢青蒿素]1h-咪唑-3-鎓溴化物(1c)
[0177]
在回流条件下、向搅拌的dha-c5(189mg,0.45mmol)的ch3cn(6ml)溶液中加入1-甲基咪唑(143μl，1.80mmol，4当量)，并将反应混合物在回流条件下搅拌3天。溶剂在减压条件下蒸发，粘性残留物通过硅胶色谱、用ch2cl
2-meoh作为洗脱剂(1/0.1至1/0.25)来纯化，以获得白色固体(91mg，39％产率)。分析计算的c
24h39
brn2o5:c,55.92；h,7.63；n,5.43。发现的为c,55.86；h,7.56；n,5.38。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ＝10.40(s,1h,h2'),7.54(t,1h,j＝1.8hz,h4'),7.43(t,1h,j＝1.8hz,h5'),5.34(s,1h,h12),4.73(d,j＝3.6hz,1h,h10),4.33(t,j＝7.5hz,2h,h22),4.12(s,3h,h6'),3.79(dt,1h,j＝9.8,6.3hz,h18),3.45(dt,1h,j＝9.8,6.5hz,h18),2.62-2.54(m,1h,h9),2.38-2.30(m,1h,h4),2.04-1.92(m,3h,h4,h21),1.89-1.83(m,1h,h5),1.74-1.58(m,5h,h7,h8,h19),1.53-1.37(m,4h,h5,h8a,h20),
1.40(s,3h,h14),1.35-1.29(m,1h,h6),1.27-1.18(m,1h,h5a),0.94(d,j＝6.3hz,3h,h15),0.90-0.83(m,1h,h7),0.86(d,j＝7.3hz,3h,h16)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3):δ＝137.60(1c,c2'),123.51(1c,c4'),121.89(1c,c5'),104.07(1c,c3),101.99(1c,c10),87.88(1c,c12),81.09(1c,c12a),67.86(1c,c18),52.52(1c,c5a),50.00(1c,c22),44.37(1c,c8a),37.44(1c,c6'),36.77(1c,c6),36.40(1c,c4),34.56(1c,c7),30.88(1c,c9),30.06-29.01(2c,c19,c21),26.19(1c,c14),24.66-24.48(2c,c5,c8),23.00(1c,c20),20.35(1c,c15),13.05(1c,c16)。hrms(es

)：计算的c
24h39
n2o
5 m/z＝435.2859；发现的435.2861。
[0178]
3.2.复合物2a-2c的合成
[0179]
复合物2a
[0180]
在施兰克管中，在氮气气氛下、1a(102mg，0.21mmol)和ag2o(25mg,0.11mmol)溶解在ch3cn(3ml)，并且避光且在室温下搅拌过夜。加入在2ml ch3cn中的agno3(19mg,0.11mmol)的溶液，并将混合物搅拌2小时。最后，加入au(sme2)cl(32mg,0.11mmol)，并在室温下搅拌1h后，将溶液通过硅藻土垫过滤，并且在减压条件下除去溶剂，以获得白色固体(95mg,84％产率)。通过et2o在该复合物的ch3cn溶液中的缓慢扩散获得适用于x射线衍射分析的晶体。分析计算的c
44h68
aun5o
13
：c,49.30；h,6.39；n,6.53。发现的为c,49.32；h,6.45；n,5.49。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ7.26(d,j＝1.8hz,1h,h4'),7.16(d,j＝1.9hz,1h,h5'),5.37(s,1h,h12),4.79(d,j＝3.5hz,1h,h10),4.28(t,j＝7.0hz,2h,h20),3.95(s,3h,h6'),3.91-3.89(m,1h,h18),3.46-3.43(m,1h,h18),2.64-2.62(m,1h,h9),2.37-2.34(m,1h,h4),2.19-2.16(m,2h,h19),2.04-2.02(m,1h,h4),1.89-1.87(m,1h,h5),1.73-1.71(m,2h,h8),1.61-1.59(m,1h,h7),1.48-1.46(m,1h,h8a),1.46-1.43(m,1h,h5),1.42(s,3h,h14),1.32-1.30(m,1h,h6),1.25-1.20(m,1h,h5a),0.96(d,j＝6.2hz,3h,h15),0.95-0.92(m,1h,h7),0.91(d,j＝7.4hz,3h,h16)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3):δ183.71(1c,c2'),123.26(1c,c4'),121.84(1c,c5'),104.19(1c,c3),101.98(1c,c10),87.93(1c,c12),80.89(1c,c12a),64.81(1c,c18),52.46(1c,c5a),48.50(1c,c20),44.22(1c,c8a),38.21(1c,c6'),37.52(1c,c6),36.35(1c,c4),34.50(1c,c7),31.70(1c,c19),30.75(1c,c9),26.11(1c,c14),24.66-24.54(2c,c5,c8),20.31(1c,c15),13.10(1c,c16)hrms(es

):计算的c
44h68
aun4o
10 m/z 1009.4601；发现的1009.4591。
[0181]
复合物2b
[0182]
在氮气气氛下，将碳酸钾(27.7mg，0.20mmol)加入到在无水ch3cn(5ml)中的1b(80mg，0.16mmol)和ag(sme2)cl(26.5mg,0.09mmol)的混合物中。然后将混合物加热至60℃并搅拌2小时。冷却至室温后，将溶液通过硅藻土垫过滤并在减压条件下除去溶剂。复合物通过制备色谱在硅胶板上、用ch2cl
2-meoh作为洗脱剂(100/8)来纯化，以得到白色固体(68.7mg,80％产率)。分析计算的c
46h72
aucln4o
10
。c,51.47；h,6.76；n,5.22。发现的为c,51.39；h,6.68；n,5.18。1h nmr(400mhz,cdcl3):δ7.37(d,j＝1.9hz,1h,h4'),7.22(d,j＝1.9hz,1h,h5'),5.33(s,1h,h12),4.74(d,j＝3.2hz,1h,h10),4.25(t,j＝7.0hz,2h,h21),3.97(s,3h,h6'),3.86-3.80(m,1h,h18),3.42-3.37(m,1h,h18),2.61-2.57(m,1h,h9),2.38-2.30(m,1h,h4),2.04-1.84(m,4h,h4,h5,h20),1.76-1.58(m,5h,h7,h8,h19),1.46-1.37(m,2h,h5,h8a),1.40(s,3h,h14),1.30-1.19(m,2h,h5a,h6),0.94(d,j＝5.9hz,3h,
h15),0.95-0.84(m,1h,h7),0.86(d,j＝7.3hz,3h,h16)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3):δ183.57(1c,c2'),123.45(1c,c4'),121.53(1c,c5'),104.10(1c,c3),101.99(1c,c10),87.87(1c,c12),80.97(1c,c12a),67.50(1c,c18),52.40(1c,c5a),51.04(1c,c21),44.27(1c,c8a),38.42(1c,c6’),37.49(1c,c6),36.35(1c,c4),34.53(1c,c7),30.79(1c,c9),28.34(1c,c20),26.73,(1c,c19),26.16(1c,c14),24.65-24.48(2c,c5,c8),20.35(1c,c15),13.08(1c,c16)hrms(es

):计算的c
46h72
aun4o
10 m/z 1037.4914；发现的1037.4929。
[0183]
复合物2c
[0184]
在氮气气氛下，将碳酸钾(38.7mg，0.28mmol)加入到在无水ch3cn(5ml)中的1c(118.5mg，0.23mmol)和ag(sme2)cl(35.3mg,0.12mmol)的混合物中。然后将混合物加热至60℃并搅拌2小时。冷却至室温后，将溶液通过硅藻土垫过滤，并在减压条件下除去溶剂。复合物通过制备色谱在硅胶板上、用ch2cl
2-meoh作为洗脱剂(100/8)来纯化，以得到白色固体(39.3mg,31％产率)。分析计算的c
48h76
aucln4o
10
。c,52.34；h,6.95；n,5.09。发现的为c,52.39；h,6.98；n,5.08。1h nmr(300mhz,cdcl3):δ7.32(d,j＝1.9hz,1h,h4'),7.22(d,j＝1.9hz,1h,h5'),5.36(s,1h,h12),4.75(d,j＝3.6hz,1h,h10),4.25(t,j＝7.0hz,2h,h22),3.99(s,3h,h6’),3.88-3.78(m,1h,h18),3.41-3.33(m,1h,h18),2.63-2.58(m,1h,h9),2.43-2.32(m,1h,h4),2.08-1.97(m,4h,h4,h5,h21),1.78-1.59(m,5h,h7,h8,h19),1.53-1.38(m,4h,h5,h8a,h20),1.43(s,3h,h14),1.30-1.24(m,2h,h5a,h6),0.97(d,j＝6.1hz,3h,h15),0.97-0.84(m,1h,h7),0.87(d,j＝7.4hz,3h,h16)。
13
c nmr(101mhz,cdcl3):δ183.59(1c,c2'),123.28(1c,c4'),121.65(1c,c5'),104.08(1c,c3),101.91(1c,c10),87.86(1c,c12),81.01(1c,c12a),67.85(1c,c18),52.49(1c,c5a),51.22(1c,c22),44.32(1c,c8a),38.38(1c,c6'),37.48(1c,c6),36.37(1c,c4),34.58(1c,c7),31.22(1c,c21),30.82(1c,c9),29.13(1c,c19),26.18(1c,c14),24.66-24.46(2c,c5,c8),23.23(1c,c20),20.37(1c,c15),13.02(1c,c16)hrms(es

):计算的c
48h76
aun4o
10 m/z 1065.5221；发现的1065.5226。
[0185]
13
c nmr光谱明确证明了阳离子金(i)复合物的形成，具有位于183.6-183.7ppm处的卡宾碳(carbenic carbons)的共振。2a-c的hrms谱表现出阳离子片段[m
–
x-]

的经典峰和与常规的[aul2][x]公式的对应的元素分析。
[0186]
4.2a的晶体学数据
[0187]
已经通过从乙醚到在乙腈中的2a饱和溶液的气相扩散获得了适用于x射线结构分析的单晶。在固体状态下，金(i)显示出由两个nhc配体稳定的典型线性配位。nhc平面围绕c-au-c轴线交叉，具有的扭转角从116
°
到138
°
。值得注意的是，块状(bulky)dha衍生物基团位于中心双nhc金基序的同一侧。这是由于亲金相互作用(aurophilic interaction)导致了具有345.0pm的au-au距离的复合物的二聚体形式。
[0188]
所有数据都是在低温下、在bruker-axs apex ii衍射仪上施用油涂覆的骤冷晶体、利用moka辐射进行收集。结构通过直接方法
[2]
求解，且所有非氢原子都使用最小二乘法对f2进行各向异性细化(refine)
[3]
。已经使用flack方法对绝对结构参数进行细化。
[4]
[0189]
复合物2a：c
44h68
aun5o
13.12
，mr＝1074.0，晶体尺寸＝0.40
×
0.30
×
0.05mm3，正交，
空间群i222，空间群i222，反射收集的z＝8,59886，6963个单一反射(r
int
＝0.1151)，r1＝0.0568,wr2＝0.1300[i》2c4),34.58(1c,c7),31.22(1c,c所有数据)，绝对结构因子x＝-0.021(8)，
[0190]
5.细胞培养和细胞活力试验(mtt试验)
[0191]
pc-3人前列腺癌细胞和lama慢性髓样白血病在含有10％胎牛血清和1％抗生素(100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的rpmi 1640中、在37℃和5％co2润湿培养箱中培养。hl60慢性髓样白血病在含有15％胎牛血清和1％抗生素(100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素)的rpmi 1640中、在37℃和5％co2润湿培养箱中培养。hepg-2人肝癌细胞在含有10％fbs、1％非必需氨基酸、1mm丙酮酸钠、1％链霉素抗生素和600μg/ml遗传霉素的emem中培养。a549人肺癌细胞、t24人膀胱癌细胞、mcf-7人乳腺癌细胞、u-2os人骨肉瘤和nih3t3鼠成纤维细胞在含有10％胎牛血清和1％抗生素的dmem培养基中、在37基中、5％co2润湿培养箱中培养。mc3t3小鼠成骨细胞在含有10％胎牛血清和1％抗生素的mem培养基中、在37基中、5％co2润湿培养箱中培养。rwpe-1人前列腺正常细胞在含有0.05mg/ml牛垂体提取物(bovine pituitary extract，bpe)和5ng/ml表皮生长因子(epidermal growth factor，egf)的k-sfm培养基中，在37℃、5％co2润湿培养箱中培养。
[0192]
mtt试剂(3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑)用于确定细胞死亡，如mosmann
[5]
最初所述的并由cuvillier等人
[6]
修改的。简而言之，根据细胞类型，将细胞以5,000至10,000个细胞/孔接种在24孔板中，并允许细胞附着过夜。所有的复合物都溶解在dmso中。根据通过元素分析确定的复合物的元素组成计算复合物的浓度。在存在测试复合物的培养基中添加并连续稀释至各种浓度(从5μm到0.01μm)。在这些浓度之后，对于dha而言，已经使用了50μm、20μm和10μm，并且对于阳离子双nhc金(i)复合物3而言，已经使用了0.001μm。培养基中dmso的最大浓度不超过0.5％(v/v)。处理72小时后，将细胞在37℃和5％co2下、用25μl mtt溶液(5mg/ml；西格玛奥德里奇)在24孔板中温育约3到4小时。用500μl裂解缓冲液(dmso)溶解后，在570nm的吸光度下、通过利用酶标仪分光光度法来量化甲臜。与引起细胞增殖的50％抑制的浓度对应的gl
50
值从通过非线性回归分析(prism 8，graphpad software)获得的剂量响应曲线来计算。所有结果均从三个独立实验中获得的数据计算得出。
[0193]
对前体1a-1c和复合体2a-2c对pc-3前列腺癌细胞系和三种非癌细胞系(成纤维细胞nih3t3、成骨细胞mc3t3和上皮前列腺rpwe-1)(下表1)的体外毒性能力进行了评估。有趣的是，咪唑鎓盐1a-1c显示出无细胞毒性效果(gi
50
》20μm)，而复合物2a-2c表现出具有在20nm与70nm之间的gi
50
值的强烈抗增殖活性。2a-2c的选择性指数(si＝gi
50
(非癌细胞系)/gi
50
(癌细胞系))给出了与nih3t3细胞几乎相同的、范围从15.5到16.7的值，而rpwe-1细胞给出了具有对2a最高si＝6.9的、更高的分化结果。作为参考药物，对金诺芬(抗关节炎药物，目前作为抗癌药物处于临床i期和ii期试验中)以及dha进行了测试。此外，对公开的阳离子双nhc金(i)复合物3(含有甲基和喹啉取代基
[7]
),以及3和dha(1:2)的混合物进行了研究，以便评价杂化复合物的潜在协同作用。阳离子双nhc金(i)复合物3的结构如下：
[0194][0195]
出人意料的是，复合物2a-2c对pc-3细胞的效价比金诺芬和dha分别高16至55倍、和22至78倍。此外，与两种药物参照相比，它们对癌细胞的选择性比nih3t3高6.2到16.7。值得注意的是，复合物2a的si pc-3/rpwe-1值显示为接近dha的si pc-3/rpwe-1值，但比金参照、金诺芬和复合物3的si pc-3/rpwe-1值分别高69和35倍。复合物3的活性显示为比2a-2c低10到35倍，且3和dha的混合物具有的效率在dha与3之间，具有低选择性。总体而言，这些结果突出了将dha衍生物连接到双nhc金(i)单元的nhc骨架(scaffold)上会产生协同作用，通过与高选择性结合的高细胞毒性来表达。
[0196]
由于复合物2a更好的选择性，发明人选择了复合物2a以用于进一步的生物学研究。2a已经在七种其他具有代表性的人类癌细胞系上进行了测试，即a549(肺)、mcf-7(乳腺)、t24(膀胱)、u-2os(骨)、lama(白血病)、hl60(急性髓样白血病,acute myeloid leukemia)和hep-g2(肝脏)(见表2)。与pc-3细胞的情况一样，六种癌细胞系的gi
50
值在较低的nm范围内，从22nm跨越至175nm。对于所有测试的癌细胞系，甚至对于总是更难以治疗的肝细胞癌(目前用于治疗肝癌的商业药物索拉非尼显示出对hepg-2细胞系为6.4μm的ic
50
)，复合体2a仍然比本研究中使用的对照分子更有效。三氧化二砷对人肝肿瘤和星状细胞系中化疗增敏的差异效果(f.rangwala,k.p.williams,g.r.smith,z.thomas,j.l.allensworth,h.k.lyerly,a.m.diehl,m.a.morse,g.r.devi,bmc cancer 2012,12,402)，验证了金(i)-青蒿素类杂化复合物的概念。
[0197]
表1. 1a-1c和2a-2c在pc-3、nih3t3和rwpe-1细胞系(gi
50
[μm]，72小时，mtt试验)上的细胞毒性和选择性。
[a]
[0198][0199]
[a]gi
50
数值代表导致50％的细胞生长抑制的化合物浓度。三个独立实验的平均值。
[0200]
[b]选择性指数。
[0201]
表2. 2a在a549、mcf-7、t24、u2os、lama、hl60和hepg-2细胞系(gi
50
[μm]，72小时，mtt试验)的细胞毒性。
[a]
[0202][0203][0204]
[a]gi
50
数值代表导致50％的细胞生长抑制的化合物浓度。三个独立实验的平均值。
[0205]
下面的表3还显示了对于不同的测试分子、对每个细胞系观察到的ic
50
，测试分子为：本发明的化合物(i)(化合物2a)、金诺芬、dha、单独的nhc-金(i)复合物3(不含任何青蒿
素或dha)、和单独的nhc-金(i)复合物3和单独的dha的混合物(摩尔比为1:2)。
[0206]
表3. 2a、金诺芬、dha、单独的nhc-(i)复合物单独的3、和单独的3和单独的dha的混合物(以1:2的摩尔比)对癌细胞a549、mcf-7、t24、u-2os、pc-3、lama和hl60，以及mc3t3、nih3t3和rwpe-1非癌细胞系的ic
50
。
[0207][0208][0209]
*显示出该化合物2a的非常高的特异性
[0210]
6.细胞内活性氧类(ros)的测量和ros生成的确定
[0211]
根据先前报道的方案，通过dcf荧光强度的增加显示了细胞ros的产生
[8]
。简而言之，pc-3、a549、mcf-7和hepg2细胞以50,000个细胞/孔的密度接种在24孔板中，持续24小时。细胞用pbs缓冲液洗涤并用dcfh-da(终浓度20μm)染色45分钟。然后细胞用pbs缓冲液洗涤，将不含酚红的含金复合物的培养基加入到细胞中。dcf的荧光强度(激发/发射，485/535nm)通过荧光酶标仪在不同时间点进行测量。
[0212]
对于n-乙酰半胱氨酸(nac)和还原型谷胱甘肽(gsh)处理而言，细胞用不同浓度的nac和gsh(2mm、5mm和10mm)预处理1小时，然后加入金复合物2a温育72小时。之后，细胞在37℃和5％co2、用25μl mtt溶液(5mg/ml；西格玛奥德里奇)在24孔板中进一步温育约3小时。如上所述确定细胞毒性。
[0213]
结果在图1和图2中。
[0214]
7.哺乳动物trxr的抑制
[0215]
为了确定对哺乳动物trxr的抑制，用较小的修改执行已建立的基于酶标仪的试验
[9]
。为此，使用市售的大鼠肝脏trxr(来自西格玛奥德里奇)并用蒸馏水稀释达到3.5u/ml。复合物2a新鲜地溶解在无菌dmso中作为原液(stock solution)。加入25μl等份的酶和25μl含有梯度浓度的复合物2a的磷酸钾缓冲液(ph 7.0)或25μl不含复合物但含有dmso的缓冲液(阳性对照)。将所得溶液(dmso的最终浓度为0.5％v/v)在96孔板中在37℃下、利用温和摇动温育75分钟。对于每孔，加入225μl反应混合物(1.0ml反应混合物由500μl100mm磷酸钾缓冲液ph 7.0、80μl 100mm edta溶液ph 7.5、20μl0.2％bsa、100μl 20mm nadph和300μl蒸馏水构成)，并通过加入25μl 20mm的dtnb溶液立即引发反应。彻底混合后，通过酶标仪在405nm处、间隔1分钟监测10次来测量tnb的形成。tnb浓度随时间的增加呈线性趋势(r2≥0.99)，酶活性计算为斜率(每秒吸光度增加)。通过使用无酶测试化合物的阴性对照实验证实了对测定组分的无干扰作用。ic
50
值计算为使未处理对照的酶活性降低50％的化合物浓度。结果在图3中。
[0216]
8.nrf2转录活性
[0217]
从生长培养基1k中的培养物中获得are报告基因-hepg-2细胞，并将are报告基因-hepg-2细胞以40,000个细胞/孔的浓度接种到45μl不含遗传霉素的生长培养基1k中的白色透明底部96孔微孔板中。细胞允许附着过夜，然后用不同浓度的复合物2a(从0.01μm到20μm)、金诺芬(从0.01)m到20 1)或dha(从0.01)m到3μm、5μm、10μm、20μm和50μm)和复合物(从0.01μm到20μm)来处理。在37℃和5％co2温育16小时后，加入one-step荧光素酶试验试剂(100μl)并在室温下振荡超过15分钟。然后通过clariostar酶标仪测定每个孔的发光，以量化are的诱导。三个独立的实验作为生物学一式三份执行。结果在图4中。
[0218]
9.nf-κb转录活性
[0219]
结果在图5中。
[0220]
10.参考文献
[0221]
[1]r.k.haynes,h.-w.chan,m.-k.cheung,w.-l.lam,m.-k.soo,h.-w.tsang,a.voerste,i.d williams,eur.j.org.chem.,2002,1,113-132.
[0222]
[2]g.m.sheldrick,acta crystallogr.,1990,a46,467-473.
[0223]
[3]g.m.sheldrick,acta crystallogr.,2008,a64,112-122.
[0224]
[4](a)h.d.flack,acta crystallogr.1983,a39,876-881；(b)s.parsons,
h.d.flack,t.wagner,acta cryst.2013,b69,249-259.
[0225]
[5]t.mosmann,j.immunol.methods,1983,65(1-2),55-63.
[0226]
[6]o.cuvillier,v.e.nava,s.k.murthy,l.c.edsall,t.levade,s.milstien,s.spiegel,cell death differ.,2001,2,162-171.
[0227]
[7]c hemmert,a.fabi
ꢀé
,a.fabre,f.benoit-vical,h.gornitzka,eur.j.med.chem.,2013,60,64-75.
[0228]
[8]z.zhao,p.gao,y.you,t.chen,chem.eur.j.,2018,24,3289-3298.
[0229]
[9]r.rubbiani,i.kitanovic,h.alborzinia,s.can,a.kitanovic,l.a.onambele,m.stefanopoulou,y.geldmacher,w.s.sheldrick,g.wolber,a.prokop,s.i.ott,j.med.chem.,2010,53,8608-8618.