基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法

1.本发明属生物技术领域，涉及一种蛋白分离方法，具体是一种采用高浓度琼脂糖堆叠凝胶对蛋白进行电泳分离的方法。


背景技术：

2.蛋白质作为生命活动的重要物质存在于一切生物体中，在生物体的生活周期中扮演了至关重要的角色，担负着生物催化、物质运输、运动、防御、调控、记忆、识别等多种生理功能，因此，针对蛋白质的研究技术是生命科学领域中的一个关键点。由于深入研究蛋白质的结构与功能需要用到高纯度的蛋白质，因此蛋白质的分离与纯化是生物产业中的核心技术，通过分离蛋白，得到纯化的蛋白质样品，才能对其进行结构大小、物理及化学性质等方面的鉴定研究。
3.电泳是一种分离生物大分子物质的常用方法，而电泳分离过程中常用的电泳支持介质是凝胶，例如琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶。一般情况下，电泳分离核酸分子时使用的凝胶是琼脂糖凝胶，电泳分离蛋白分子时使用的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶。同样浓度的聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶对蛋白和核酸的分离程度是大致相同的，只是聚丙烯酰胺更适合制备浓度较高的凝胶(≥4％)，琼脂糖更适宜制备浓度较低的凝胶(≤4％)，所以聚丙烯酰胺凝胶被用来分离分子量较小的蛋白质，琼脂糖凝胶被用来分离分子量较大的核酸分子。况且，琼脂糖垂直凝胶制备中除了高浓度琼脂糖不易均匀融化外，还存在三个瓶颈问题：一个是黏稠的琼脂糖溶胶如何轻松的灌制进入垂直玻璃板的超窄夹缝中；二是琼脂糖堆叠凝胶的下层凝胶制备时，胶面不能水平，如何保证上层凝胶和下层凝胶交叠面的水平状态；三是选用什么缓冲液在什么电泳条件下进行高浓度琼脂糖堆叠凝胶电泳。由于这些原因，一直以来仅利用中低浓度的琼脂糖凝胶分离大分子量蛋白或蛋白复合物，极大的限制了琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离中的适用范围。


技术实现要素：

4.本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法，以琼脂糖配合相应的缓冲液，采用层叠的方式制备琼脂糖堆叠垂直凝胶，利用设定的电泳条件，能够在较高浓度条件下利用琼脂糖凝胶对蛋白进行电泳分离，提高了琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离中的适用范围。
5.本发明所采用的技术方案：
6.一种基于琼脂糖堆叠凝胶的蛋白电泳分离方法，其步骤如下：
7.1、凝胶灌制前准备
8.用tris-cl、nacl配置凝胶缓冲液，浓度分别为0.25m tris-cl、0.04～0.2％nacl，备用；
9.用tris-cl、sds配置电泳缓冲液，浓度分别为0.25m tris-cl、0.2～1.0％sds，备用；
10.顶层胶盒的制作：取长方形盒子，其长度略小于玻璃板灌胶器的内孔长度，在盒子底部平行于长边方向开设一个细缝，细缝宽度略大于玻璃板灌胶器的内孔宽度，在盒子底部的外侧于细缝两侧对称设置两条硅胶条，硅胶条之间的距离等于玻璃板灌胶器的厚度。
11.2、琼脂糖堆叠凝胶灌制：
12.s1、琼脂糖堆叠凝胶下层凝胶灌制：按浓度为8～14％的琼脂糖溶液的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖混合后，在蒸汽环境中于高温、高压的条件下溶解得到澄清的8～14％琼脂糖溶胶，备用；玻璃板灌胶器和顶层胶盒于75～85℃进行预热，然后在75～85℃的环境中将玻璃板灌胶器竖向放置，把顶层胶盒安装在玻璃板灌胶器顶部，顶层胶盒底部的细缝对准玻璃板灌胶器的内孔(玻璃板之间的扁平状孔)，将温度为75～85℃的琼脂糖溶胶倒入顶层胶盒中，待溶胶流满玻璃板灌胶器的内孔后室温放置20～40min，等待溶胶凝固。
13.在琼脂糖溶胶制备过程中，所述的高温、高压是指温度为115～121℃，压力为1.6
×
105pa～2.1
×
105pa。
14.s2、琼脂糖堆叠凝胶上层凝胶灌制：
15.溶胶凝固后，用梳子由下朝上把凝胶从玻璃板灌胶器中推出2.5～3.0cm，然后对齐玻璃板灌胶器边沿切除推出的琼脂糖凝胶；将玻璃板灌胶器倒转180度，取出梳子，重新于75～85℃进行预热3～5分钟；按浓度为3～4％的琼脂糖溶液的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖混合后加热溶解得到3～4％琼脂糖溶胶，将3～4％琼脂糖溶胶从上部注入玻璃板灌胶器的内孔中，插入梳子到1.5～2cm，室温放置20～40min，等待溶胶完全凝固。
16.3、琼脂糖堆叠凝胶电泳分离蛋白：
17.在电泳仪中将目标蛋白样本上样后，按9～11v/cm凝胶长度的标准用电泳缓冲液进行恒电压电泳4～5小时至溴酚蓝前沿到达凝胶底部，凝胶放入考马斯亮蓝r-250染色液中染色过夜，然后转移到脱色液中脱色4～5小时，用凝胶扫描仪扫描获得了电泳图谱，获得不同的蛋白条带。
18.本发明工艺简单，操作简便，以琼脂糖配合相应的凝胶缓冲液，采用层叠的方式将高浓度的琼脂糖凝胶进行垂直堆叠，利用设定的电泳条件，能够在较高浓度条件下利用琼脂糖凝胶对蛋白进行电泳分离，提高了琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离中的适用范围。
附图说明
19.图1是本发明的顶层胶盒的俯视结构示意图。
20.图中：1、长方形盒子；2、细缝；3、硅胶条。
21.图2是本发明的顶层胶盒的侧视结构示意图。
22.图中：1、长方形盒子；3、硅胶条。
23.图3是8％的聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳对蛋白的分离效果比较。page、聚丙烯酰胺堆叠凝胶电泳；agarose、琼脂糖堆叠凝胶电泳。a、10-170kda蛋白分子量标准；b、6.5-270kda蛋白分子量标准；c、大肠杆菌蛋白；d、加入iptg诱导后的大肠杆菌蛋白。
24.图4是12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳和琼脂糖凝胶电泳对蛋白的分离效果比较。page：聚丙烯酰胺堆叠凝胶电泳；agarose：琼脂糖堆叠凝胶电泳。a、10-170kda蛋白分子量标准的蛋白marker；b、6.5-270kda蛋白分子量标准的蛋白marker；c、大肠杆菌蛋白；d、加入
iptg诱导后的大肠杆菌蛋白。
具体实施方式
25.下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
26.顶层胶盒的制作：如图1、2所示，购买一个长度略小于玻璃板灌胶器的内孔长度的pp塑料长方形盒子1(不同厂家生产的玻璃板灌胶器的内孔规格会有所不同)，在盒子底部平行于长边方向开设一个细缝2，细缝2宽度略大于玻璃板灌胶器的内孔宽度，在盒子底部的外侧于细缝2两侧对称设置两条硅胶条3，硅胶条之间的距离等于玻璃板灌胶器的厚度。
27.实施例一
28.1、凝胶灌制前准备
29.用tris-cl、nacl配置凝胶缓冲液，浓度分别为0.25m tris-cl、0.1％nacl，备用；
30.用tris-cl、sds配置电泳缓冲液，浓度分别为0.25m tris-cl、0.5％sds，备用；
31.2、琼脂糖堆叠凝胶灌制：
32.s1、琼脂糖堆叠凝胶下层凝胶灌制：按浓度为8％的琼脂糖溶液的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖置于试剂瓶中混合后，放入高压灭菌器中，设置温度为115℃(对应压力为1.68
×
105pa)，加热20min，使琼脂糖溶解得到澄清的8％琼脂糖溶胶，备用；玻璃板灌胶器和顶层胶盒放入电加热箱中，于80℃进行预热，然后在电加热箱(控制温度在80℃左右)中将玻璃板灌胶器竖向放置，把顶层胶盒安装在玻璃板灌胶器顶部(利用顶层胶盒底部的两条硅胶条卡住玻璃板灌胶器的外侧)，顶层胶盒底部的细缝对准玻璃板灌胶器的内孔，将冷却至80℃左右的8％琼脂糖溶胶倒入顶层胶盒中，待溶胶流满玻璃板灌胶器的内孔后室温放置30min，等待溶胶凝固。
33.s2、琼脂糖堆叠凝胶上层凝胶灌制：
34.溶胶凝固后，用梳子由下朝上把凝胶从玻璃板灌胶器中推出2.5～3.0cm，然后对齐玻璃板灌胶器边沿切除推出的琼脂糖凝胶；将玻璃板灌胶器倒转180度，取出梳子，重新放入电加热箱中，于75～85℃进行预热4分钟；按浓度为4％的琼脂糖凝胶的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖混合后加热溶解得到4％琼脂糖凝胶，将4％琼脂糖凝胶从上部注入玻璃板灌胶器的内孔中，插入梳子到1.5～2cm，室温放置40min，等待溶胶完全凝固。
35.3、琼脂糖堆叠凝胶电泳分离蛋白：
36.分别取10-170kda蛋白分子量标准的蛋白marker(市售，标记为a)、6.5-270kda蛋白分子量标准的蛋白marker(市售，标记为b)、大肠杆菌蛋白(自行提取，标记为c)、加入iptg诱导后的大肠杆菌蛋白(自行提取，标记为d)，共四种蛋白。
37.在电泳仪中将目标蛋白样本上样后，按10v/cm凝胶长度的标准用电泳缓冲液进行恒电压电泳4小时至溴酚蓝前沿到达凝胶底部，凝胶放入考马斯亮蓝r-250染色液中染色过夜，然后转移到脱色液中脱色5小时，用凝胶扫描仪【具体为爱普生(epson)公司的expression 10000xl】扫描获得电泳图谱，如图3所示。
38.实施例二
39.1、凝胶灌制前准备
40.用tris-cl、nacl配置凝胶缓冲液，浓度分别为0.25m tris-cl、0.2％nacl，备用；
41.用tris-cl、sds配置电泳缓冲液，浓度分别为0.25m tris-cl、1.0％sds，备用；
42.2、琼脂糖堆叠凝胶灌制：
43.s1、琼脂糖堆叠凝胶下层凝胶灌制：按浓度为12％的琼脂糖溶液的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖置于试剂瓶中混合后，放入高压灭菌器中，设置温度为121℃(对应压力为2.05
×
105pa)，加热20min，使琼脂糖溶解得到澄清的12％琼脂糖溶胶，备用；玻璃板灌胶器和顶层胶盒放入电加热箱中，于85℃进行预热，然后在电加热箱(控制温度在80℃左右)中将玻璃板灌胶器竖向放置，把顶层胶盒安装在玻璃板灌胶器顶部(利用顶层胶盒底部的两条硅胶条卡住灌胶玻璃板的外侧)，顶层胶盒底部的细缝对准玻璃板灌胶器的内孔，将冷却至80℃左右的12％琼脂糖溶胶倒入顶层胶盒中，待溶胶流满玻璃板灌胶器的内孔后室温放置30min，等待溶胶凝固。
44.s2、琼脂糖堆叠凝胶上层凝胶灌制：
45.溶胶凝固后，用梳子由下朝上把凝胶从玻璃板灌胶器中推出2.5～3.0cm，然后对齐玻璃板灌胶器边沿切除推出的琼脂糖凝胶；将玻璃板灌胶器倒转180度，取出梳子，重新放入电加热箱中，于80℃进行预热5分钟；按浓度为4％的琼脂糖溶液的配制标准，将凝胶缓冲液、琼脂糖混合后加热溶解得到4％琼脂糖溶胶，将4％琼脂糖溶胶从上部注入玻璃板灌胶器的内孔中，插入梳子到1.5～2cm，室温放置40min，等待溶胶完全凝固。
46.3、琼脂糖堆叠凝胶电泳分离蛋白：
47.分别取10-170kda蛋白分子量标准的蛋白marker(市售，标记为a)、6.5-270kda蛋白分子量标准的蛋白marker(市售，标记为b)、大肠杆菌蛋白(自行提取，标记为c)、加入iptg诱导后的大肠杆菌蛋白(自行提取，标记为d)，共四种蛋白。
48.在电泳仪中将目标蛋白样本上样后，按11v/cm凝胶长度的标准用电泳缓冲液进行恒电压电泳4小时至溴酚蓝前沿到达凝胶底部，凝胶放入考马斯亮蓝r-250染色液中染色过夜，然后转移到脱色液中脱色5小时，用凝胶扫描仪【具体为爱普生(epson)公司的expression 10000xl】扫描获得电泳图谱，如图4所示。
49.对比试验：
50.对比例一
51.以高浓度聚丙烯酰胺凝胶(8％)作为电泳支持介质，以10-170kda蛋白分子量标准的蛋白marker(市售，标记为a)、6.5-270kda蛋白分子量标准的蛋白marker(市售，标记为b)、大肠杆菌蛋白(自行提取，标记为c)、加入iptg诱导后的大肠杆菌蛋白(自行提取，标记为d)，共四种蛋白为目标蛋白(目标蛋白来源均与实施例一相同)，采用常规电泳分离过程获得电泳图谱，如图3所示。
52.对比例二：
53.以高浓度聚丙烯酰胺凝胶(12％)作为电泳支持介质，以10-170kda蛋白分子量标准的蛋白marker(市售，标记为a)、6.5-270kda蛋白分子量标准的蛋白marker(市售，标记为b)、大肠杆菌蛋白(自行提取，标记为c)、加入iptg诱导后的大肠杆菌蛋白(自行提取，标记为d)，共四种蛋白为目标蛋白(目标蛋白来源均与实施例一相同)，采用常规电泳分离过程获得电泳图谱，如图4所示。
54.上述蛋白电泳图谱的结果表明，本发明以合适的凝胶缓冲液，采用层叠的方式将
高浓度的琼脂糖凝胶进行垂直堆叠，能够在较高浓度条件下利用琼脂糖凝胶对蛋白进行电泳分离，分离效果与高浓度聚丙烯酰胺凝胶的分离效果相似，都具有较高的条带分辨率，提高了琼脂糖凝胶电泳在蛋白质分离中的适用范围。
55.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。