一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法及其应用

1.本发明属生物技术领域，涉及一种电泳分离介质的制备方法及其应用，具体是一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法及其在低分子量核酸分离中的应用。


背景技术：

2.核酸作为生命的最基本物质之一，分为核糖核酸(简称rna)和脱氧核糖核酸(简称dna)，其中，dna是储存、复制和传递遗传信息的主要物质基础，因此，针对dna的研究是生命科学领域中的一个关键点。
3.按相对分子质量大小分离dna的凝胶电泳技术，能够用于分离、鉴定和纯化dna片段(核酸片段)，已经发展成为一种分析鉴定dna分子的重要实验手段，是基因操作的核心技术之一。
4.琼脂糖凝胶因其结构均匀、对样品吸附小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好等优点，已成为实验室凝胶电泳中最常用的分离支持介质，普遍用于分离、鉴定、纯化核酸。目前，实验室中常以常压加热的方式(微波炉加热)制备中低浓度的琼脂糖凝胶(0.6％-3％)，根据“核算分子量越大，电泳时凝胶浓度越小”的规律，中低浓度的琼脂糖凝胶常常被用来分离100bp-20kbp的核酸片段(dna片段)。但在实验室实际操作过程中，中低浓度的琼脂糖凝胶对于200bp以下的小分子量核酸片段，条带分离度差，分辨率低。因此，小分子量核酸片段的高分辨率分离，需要更高浓度(≥4％)的琼脂糖凝胶。由于琼脂糖自身的特性，高浓度的琼脂糖凝胶难于制备，实验室常常使用聚丙烯酰胺凝胶替代其进行小分量核酸的高分辨率分离，局限了琼脂糖凝胶在小分量核酸的应用，而且，过往的研究也发现，在琼脂糖凝胶中而不是聚丙烯酰胺凝胶中观察到的迁移率准确地反映了核酸分子量，况且核酸分子中如果存在连续的腺嘌呤残基会导致它们在聚丙烯酰胺凝胶中移动缓慢，不能反映它们的真实大小。


技术实现要素：

5.本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法，在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，形成均匀的溶胶，在高温环境下进行琼脂糖凝胶灌制得到高浓度琼脂糖电泳凝胶，解决了常规微波炉加热或煮沸加热方法制备琼脂糖凝胶时，高浓度琼脂糖(6％及以上)难于溶解和产生大量气泡、均匀度差等问题。
6.本发明所采用的技术方案：
7.一种高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备方法，其步骤如下：
8.1、配制缓冲液和琼脂糖溶液：在tbe(tris-硼酸)中加入0.1～0.2％nacl作为琼脂糖凝胶制备的缓冲液；按浓度为6～16％的琼脂糖凝胶的配制标准，将缓冲液、琼脂糖混合配置琼脂糖溶液；
9.2、琼脂糖溶解：将配制好的琼脂糖溶液，在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，得到溶解均匀的琼脂糖溶胶；
10.所述蒸汽环境中的高温高压条件是：温度为115～121℃，压力为1.6
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105pa～2.1
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105pa。
11.3、琼脂糖电泳凝胶灌制：将玻璃板灌胶器加热至75～85℃进行预热，然后在75～85℃的环境中将冷却至75～85℃的琼脂糖溶胶注入到玻璃板灌胶器中，插入梳子，室温下冷却凝固，得到高浓度琼脂糖电泳凝胶。
12.本发明的另一个目的在于提供上述高浓度琼脂糖电泳凝胶在低分子量核酸分离中的应用。
13.所述低分子量核酸是指500bp以下的小分子量核酸片段。
14.所述低分子量核酸是指单链dna。
15.本发明工艺简单，操作方便，将琼脂糖在蒸汽环境中于高温高压条件下进行溶解，形成均匀的溶胶，解决了常规微波炉加热或煮沸加热方法制备琼脂糖凝胶时，高浓度琼脂糖(6％及以上)难于溶解和产生大量气泡、结构均匀差等问题，同时，在高温环境下进行琼脂糖凝胶灌制得到高浓度琼脂糖电泳凝胶，解决了高浓度琼脂糖凝胶室温灌制时迅速凝固，结构均匀度差的问题，所得高浓度琼脂糖电泳凝胶在电泳分离低分子量核酸片段时电泳图谱清晰，分辨率高。
附图说明
16.图1是本发明的高浓度琼脂糖溶胶溶解效果。a：100ml凝胶缓冲液中加入6g、8g、10g、12g、14g、16g琼脂糖后的状态；b：加压加温溶解后的溶胶状态。
17.图2不同浓度的琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶对dna片段的电泳分离效果。a：琼脂糖凝胶对dna片段的分离；b：聚丙烯酰胺凝胶对dna片段的分离。marker为80-300bp的商品化dna分子量标准，59bp至204bp的dna片段来源于对hptii基因orf区域对应长度的扩增。
18.图3高浓度琼脂糖凝胶对单链dna的分离效果。a：10％的琼脂糖凝胶电泳；b：12％的琼脂糖凝胶电泳；c：14％琼脂糖凝胶电泳；d：14％page凝胶电泳。marker为80-300bp的商品化dna分子量标准，19b至93b的单链dna分子由上海生工生物工程公司合成。
具体实施方式
19.下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
20.一、高浓度琼脂糖电泳凝胶的制备
21.实施例：
22.s1、配制缓冲液和琼脂糖溶液：1
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tbe中加入0.1％nacl作为琼脂糖凝胶制备的缓冲液；根据6％、8％、10％、12％、14％、16％的凝胶浓度计算琼脂糖和缓冲液的用量，分别配置琼脂糖溶液，置于试剂瓶中(图1a)。
23.s2、琼脂糖溶解：分别将已配制好琼脂糖溶液的试剂瓶放入高压灭菌器中，设置温度为115～121℃(对应压力为1.6
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105pa～2.1
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105pa)，其中，6％、8％的琼脂糖溶液设置温度为116℃，10％、12％、14％、16％琼脂糖溶液设置温度为121℃。加热20min，待高压灭菌器降温到75～85℃时取出试剂瓶，可见琼脂糖已溶解形成均匀的琼脂糖溶胶(图1b)。
24.s3、琼脂糖电泳凝胶灌制：将玻璃板灌胶器放入电加热箱中，于75～85℃预热，然后在电加热箱(控制温度在75～85℃)中，将琼脂糖溶胶注入到玻璃板灌胶器中，插入梳子，取出玻璃板灌胶器，放置于室温下冷却凝固(大约30分钟)，得到浓度分别为6％、8％、10％、12％、14％、16％的高浓度琼脂糖电泳凝胶(不同厂家生产的玻璃板灌胶器的内孔规格会有所不同，因此，凝胶规格也会有所不同)。
25.二、不同浓度琼脂糖电泳凝胶对低分子量核酸的分离效果
26.1、分别取长约14cm，浓度分别为6％、8％、10％的琼脂糖电泳凝胶，样品(marker、59bp至204bp的dna片段)上样，140v(按10v/cm的凝胶长度计算)进行电泳(凝胶浓度越大，需要的电泳时间越长)后，eb染色0.5小时，用广州光仪生物科技有限公司的oi-100拍摄凝胶图像(图2a)。
27.2、取长约14cm，浓度分别为10％、12％、14％的琼脂糖电泳凝胶，样品(19b至93b的单链dna，由上海生工生物公司合成)上样，140v(按10v/cm的凝胶长度计算)进行电泳(凝胶浓度越大，需要的电泳时间越长)后，eb染色0.5小时，用广州光仪生物科技有限公司的oi-100拍摄凝胶图像(图3)。
28.三、不同浓度聚丙烯酰胺凝胶对低分子量核酸的分离效果
29.1、按常规方法制备长约14cm，浓度分别为10％、12％、14％的聚丙烯酰胺电泳凝胶，样品(marker、59bp至204bp的dna片段)上样，140v(按10v/cm的凝胶长度计算)进行电泳后，eb染色0.5小时，用广州光仪生物科技有限公司的oi-100拍摄凝胶图像(图2b)。
30.凝胶电泳分离效果表明，在分离80-300碱基对(bp)的商品化dna分子量标准时，琼脂糖电泳凝胶和聚丙烯酰胺电泳凝胶对这些小分子量dna片段都有着良好的分离(图2)；商品化的分子量标准在200-300bp之间理论上存在280、260、240、220bp 4个条带，琼脂糖电泳凝胶分离获得了这4个条带(图2a)，聚丙烯酰胺电泳凝胶只分离获得了2个条带(图2b)；琼脂糖凝胶背景更干净(图2)；不同分子量大小的条带在琼脂糖电泳凝胶上比在聚丙烯酰胺电泳凝胶上分离距离更大(图2)。
31.6％的琼脂糖电泳凝胶可以分辨200bp以下相差3bp的dna分子量差异，8％的琼脂糖电泳凝胶更好的分辨100bp左右小片段dna的分子量差异(图2a)，10％及以上的高浓度琼脂糖电泳凝胶更适合分辨更小分子量的核酸差异，经测试10％、12％、14％的琼脂糖电泳凝胶对19-93个碱基(b)的单链dna有着显著的分离效果(图3)。
32.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。