用于治疗伴随癌症治疗发生的化学疗法诱导的周围神经病变的PALM的制作方法

用于治疗伴随癌症治疗发生的化学疗法诱导的周围神经病变的palm
1.相关申请的交叉引用
2.本pct申请要求2019年8月13日提交的美国临时申请序号62/886,282的权益。所述美国临时申请的公开内容由此以引用的方式整体并入。
3.序列表
4.本技术以引用的方式整体并入标题为“236603_471132_sequencelisting_st25.txt”的序列表(29kb)，所述序列表在2020年8月11日创建并随此以电子方式提交。
技术领域
5.本发明涉及使用肽两亲性脂质胶束(palm)治疗癌症，其中此类使用预防、治疗、改善或削弱不良效应，包括由施用化学治疗剂引起的化学疗法诱导的周围神经病变(cipn)。更具体地，本发明涉及能够将诱导cipn的化学疗法药物并入至纳米粒子中的配制技术，所述纳米粒子可以容易地肠胃外施用以将所并入的化学疗法药物安全并且有效地递送至其治疗靶标并削弱不良效应，包括由施用化学治疗剂引起的化学疗法诱导的周围神经病变(cipn)。


背景技术：

6.为化学疗法诱导的周围神经病变(cipn)寻找治疗法是美国国家癌症研究所的首要目标，cipn是许多已确立的化学疗法的经常使人衰弱并且频繁危及治疗的副作用。目前，除了剂量减少、延迟或停止以外，尚无有效对策。减少的剂量暴露导致加速肿瘤生长、化学疗法抗性和治疗失败的风险。此外，cipn的不适通常在治疗结束后持续数月至甚至数年，这进一步降低了生活质量，并在需要时阻碍了必要的后续化学疗法的能力。
7.cipn治疗法的发现对于紫杉醇(ptx)尤为重要，ptx是最广泛使用并且最有效的化学疗法药物之一，但也是cipn或者更具体说来pipn的风险特别高的药物。在接受ptx输注的患者中，pipn的患病率超过60％。至少10％的pipn患者有严重pipn(3/4级)，其中指示治疗修改。
8.pipn的症状包括四肢刺痛、麻木、烧灼感和疼痛感，以及失去有效抓握、良好的灵活性和平衡性。患者体验介于令人烦恼至使人衰弱的范围内。随着ptx剂量的大小、频率和数目增加，症状、其严重程度和所涉及的外周肢体轴的量也增加。pipn的恢复很慢，在化学疗法完成之后通常会干扰日常生活活动达数月至数年。
9.目前，剂量减少是针对pipn的疼痛、衰弱、感觉和运动效应的唯一有效治疗法。延长输注时间和治疗时间间隔产生有限的改善。已经评估了潜在的神经保护和症状缓解药物，但没有取得显著成功。
10.两种目前批准的ptx制剂(和)使pipn产生相似的持久性范围和程度。所述问题并不是紫杉醇独有的。对于临床应用中的其他紫杉烷，即多西他赛和卡巴他赛并且在较低剂量下，pipn也是主要风险。
11.使ptx与神经隔绝并替代地使ptx靶向癌细胞的配制技术将极大地提高基于ptx的化学疗法的成功性。癌症患者将经历改善的治疗结果(即，更好的存活)，而不会经历由pipn带来的疗法不适或风险。


技术实现要素：

12.在第一方面，本公开提供一种用于治疗有需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含与肽两亲性脂质胶束(palm)缔合的化学治疗剂，其中与在没有用palm治疗的情况下用化学治疗剂治疗时相比，受试者在用palm给药时经历了减少的化学疗法诱导的周围神经病变。palm由两亲肽与磷脂和任选的其他疏水性分子在水性悬浮液中组合形成。
13.在第二方面，本公开提供用于治疗当前和/或先前用引起化学疗法诱导的周围神经病变(cipn)的化学治疗剂治疗的有需要的受试者的cipn的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的组合物，所述组合物包含与肽两亲性脂质胶束(palm)缀合的化学治疗剂因此形成palm纳米粒子，其中与在没有用palm纳米粒子治疗的情况下用化学治疗剂治疗时相比，受试者在用palm纳米粒子给药时经历了减少的化学疗法诱导的周围神经病变(例如，紫杉醇诱导的周围神经病变)。在相关实施方案中，化学疗法诱导的周围神经病变(cipn)由以下药物引起和/或与以下药物相关：紫杉烷；埃博霉素(例如，伊沙匹隆和沙戈匹隆)；长春花生物碱，例如长春花碱、长春新碱、长春瑞滨和依托泊苷(vp-16)；沙利度胺来那度胺和泊马度胺蛋白酶体抑制剂，诸如硼替佐米卡非佐米和艾沙佐米(ninlaro)；拓扑异构酶抑制剂，诸如伊立替康或拓扑替康；和铂类似物，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂。在相关实施方案中，化学疗法诱导的周围神经病变(cipn)是由紫杉烷化学疗法引起和/或与紫杉烷化学疗法相关，所述紫杉烷化学疗法例如用紫杉醇多西他赛卡巴他赛拉洛他赛(larotaxel)、米拉他赛(milataxel)、欧塔他赛(ortataxel)、bms-275183和替司他赛(tesetaxel)中的任何一者或多者治疗癌症。
14.在第三方面，本公开提供用于治疗当前和/或先前用紫杉醇治疗的癌症受试者的紫杉醇诱导的周围神经病变(pipn)的方法，所述方法包括施用治疗有效剂量的包含palm纳米粒子的组合物，其中所述palm纳米粒子包含与紫杉醇缀合的palm。在一些相关实施方案中，与在没有用包含紫杉醇的palm纳米粒子治疗的情况下单独用紫杉醇治疗时相比，癌症受试者在用含有紫杉醇的palm纳米粒子给药时经历降低的pipn。
附图说明
15.图1a和图1b是seq id no:3和25的肽的埃德蒙逊轮(edmundson wheel)描绘，分别显示其两亲构象。图1a和图1b还示出组成性氨基酸(由标准单字母缩写标识)围绕α-螺旋的长轴的轴向位置。字母“b”代表2-氨基-异丁酸。虚线指示形成肽的极性面的亲水性氨基酸(阴影)和形成非极性面的疏水性氨基酸之间的大致边界。图1c和图1d分别是seq id no:3和25的肽的螺旋网描绘。
16.图2.与人hdl(虚线)相比，含有米铂的palm(实线)的尺寸排阻色谱图。palm由seq id no:25的肽和popc、sm和米铂以2.5:3:7:0.75摩尔比构成。
17.图3.示出含有xc并且用seq id no:25的肽以1:4:0.4的肽:磷脂:xc摩尔比制备的palm的尺寸排阻色谱图。标出不同斯托克斯直径(stokes diameter)的蛋白质标准品的洗脱位置。
18.图4.含有xtt并且用seq id no:25的肽(虚线)或用r4f肽(实线)制备的palm的尺寸排阻色谱图的比较。两者的组成为肽:popc:sm:xtt的摩尔当量比为1:2.8:1.2:0.4。
19.图5.描绘用seq id no:25的肽制备并且含有芬维a胺的palm的尺寸排阻色谱图。palm组成为肽:popc:sm:芬维a胺的摩尔当量比为2.5:3:7:2。
20.图6.与顺铂的抑制作用相比，palm(mp)对pc3前列腺癌细胞生长的抑制作用
21.图7.sr-bi抗体对于palm(mp)对pc3前列腺癌细胞生长的抑制作用的影响。线条指示数据与逻辑方程的拟合。
22.图8.与紫杉醇(圆形，虚线)的抑制作用相比，palm/(xc)(正方形，点线)或palm(xtt)(菱形，实线)对skov3卵巢癌细胞生长的抑制作用线条指示数据与逻辑方程的拟合。
23.图9.将用所指示的不同肽制备并且含有dii的palm与稳定感染有米非司酮诱导性人sr-bi基因的bhk(sr-bi)细胞一起孵育。所述孵育用未诱导(对照)或诱导的细胞执行。对用dii标记的人hdl进行测试以用于比较。通过荧光来检测在4小时孵育过程中细胞吸收的dii的量。
24.图10.将经诱导(sr-bi )或者未经诱导(对照)的，具有米非司酮诱导性人sr-bi基因的bhk(sr-bi)细胞与所指示浓度的ptx或palm(xtt)一起孵育持续12小时将细胞在不存在测试剂的情况下再孵育持续另外36小时，接着通过mtt测定来检测生长％。
25.图11.sr-bi抗体阻断来自palm(xtt)的xtt摄取(箭头)。
26.图12.示出skov-3细胞在不添加的情况下(对照)、与脂多糖(10μg/ml lps)、紫杉醇(ptx)或palm(xtt)孵育24小时后分泌细胞因子il-6的条形图。
27.图13.示出注射有cremophor/乙醇媒介物(a)、紫杉醇(10mg/kg)(b)、palm(xtt)(8mg/kg紫杉醇当量)(c)或palm(xtt)(24mg/kg紫杉醇当量)(d)的无胸腺小鼠中的人卵巢肿瘤(skov-3)生长的线图。
28.图14.示出注射有cremophor/乙醇媒介物(a)、1mg/kg紫杉醇(b)、生理盐水(palm媒介物)(c)、1mg/kg当量剂量的palm(xtt)(d)、2.7mg/kg当量剂量的palm(xtt)(e)的大鼠中的机械异常性疼痛的线图。
29.图15.示出注射有cremophor/乙醇媒介物(a)、紫杉醇(10mg/kg)(b)或不含xtt的palm(c)的无胸腺小鼠中的人卵巢肿瘤(skov-3)生长的线图。
具体实施方式
30.定义
[0031]“纳米粒子”意指尺寸不大于200nm的粒子。
[0032]
除非上下文另外明确指出，否则如本文所用，单数形式“一个(a/an)”和“所述”包括复数个指代物。
[0033]
应注意，在本公开中，诸如“包含(comprises)”、“包含(comprised)”、“包含
(comprising)”、“含有(contains)”、“含有(containing)”等术语具有美国专利法中赋予的含义；它们是包括性的或开放式的，并且不排除额外的、未列举的要素或方法步骤。诸如“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”和“基本上由
……
组成(consists essentially of)”的术语具有美国专利法中赋予的含义；它们允许包括不会实质上影响要求保护的发明的基本和新颖特征的额外成分或步骤。术语“由
……
组成(consists of)”和“由
……
组成(consisting of)”具有美国专利法赋予它们的含义；即这些术语是封闭式的。
[0034]
先行词“约”指示所述值是近似值。例如，“约1mg至约50mg”的范围指示所述值是近似值。“约1mg至约50mg”的范围包括近似值和特定值，举例说来，所述范围包括约1mg、1mg、约50mg和50mg。
[0035]
当描述范围时，所述范围包括所述范围的端点以及两者之间的所有数字。例如，“在1mg与10mg之间”包括1mg、10mg以及在1mg与10mg之间的所有量。同样，“1mg至10mg”包括1mg、10mg以及在1mg与10mg之间的所有量。
[0036]
如本文所用，“烷基”是指含有7-21个碳原子的饱和脂肪族烃基。如本文所用，术语(c
1-cn)烷基是指含有1-n个碳原子的烷基。例如，(c
8-c
12
)烷基是指含有8、9、10、11或12个碳原子的烷基。烷基可以是分支的或未分支的。
[0037]
如本文所用，“烯基”是指含有7-21个碳原子和至少一个双键的脂肪族碳基团。如本文所用，术语(c
1-cn)烯基是指含有1-n个碳原子的烯基。烯基可以是分支的或未分支的。
[0038]
当用于描述脂质组分时，“基本上由......组成”意指所述脂质组分包括小于0.1mol％的除指定的那些之外的任何额外脂质。
[0039]“xc”是紫杉醇2'-胆固醇碳酸酯的缩写。
[0040]“xt3”或“xtt”是紫杉醇2'-δ-生育三烯基碳酸酯的缩写。
[0041]“mp”是米铂的缩写。
[0042]“ptx”是紫杉醇的缩写。
[0043]“popc”是1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱的缩写。
[0044]“sm”是鞘磷脂的缩写。
[0045]“tba”是叔丁醇的缩写。
[0046]“dmso”是二甲亚砜的缩写
[0047]“hdl”是高密度脂蛋白的缩写。
[0048]“sr-bi”是清道夫受体b类1型的缩写。
[0049]“bhk”是小仓鼠肾的缩写。
[0050]“dii”是1,1'-二(十八烷基)-3,3,3',3'-四甲基吲哚羰花青的缩写。
[0051]“il-6”是白细胞介素-6的缩写。
[0052]“cipn”是化学疗法诱导的周围神经病变的缩写。
[0053]“pipn”是紫杉醇诱导的周围神经病变的缩写。
[0054]“palm”是一个首字母缩略词，用于鉴定由两亲肽与磷脂和任选的其他疏水性分子在水性悬浮液中的组合形成的肽-两亲性脂质胶束。
[0055]“两亲性”描述分子或聚合物(例如，肽)对脂质相和水相都具有亲和力，这是归因于如下构象，其中所述分子或聚合物中的亲水性(寻水)取代基和疏水性(避水)取代基在结构上彼此隔离。
[0056]“亲脂性”描述优先分布于水性悬浮液中的富含脂质的粒子的脂质域的物质。富含脂质的粒子包括脂质胶束、脂质体、脂蛋白、细胞膜和脂质乳液。
[0057]“肽”是由α-氨基酸单体产生的聚合物，所述α-氨基酸单体通过在所述聚合物中的一个氨基酸的羧基与下一个氨基酸的α-胺基之间形成的酰胺键接合在一起。“肽”还包括接合在一起的氨基酸单体的聚合物。可以使用氨基酸的l-光学异构体和d-光学异构体。构成所述聚合物的氨基酸可以是自然界中发现的那些(即，天然氨基酸)或非天然氨基酸。术语“残基”或“氨基酸残基”包括对并入肽、多肽或蛋白质中的氨基酸的提及。
[0058]
根据惯例并且如本文所用的肽序列是从n端至c端(从左至右)书写。
[0059]“胶束”是在水相中通过非共价相互作用组织的多分子结构。胶束由两亲性和疏水性分子构成，所述分子以使得分子的疏水域与水隔绝并且亲水性成分位于胶束-水界面处的方式聚集。
[0060]“货物分子”是具有抗癌治疗或诊断特性的疏水性或两亲性化学治疗分子，其稳定地并入palm中并且不破坏palm的稳定性。
[0061]“sirna”是作为rna诱导的基因沉默复合物的一部分被创建以控制细胞基因表达的小的干扰核糖核酸。
[0062]“aib”是氨基酸α-氨基异丁酸的三字母代码。
[0063]“aba”是氨基酸α-氨基丁酸的三字母代码。
[0064]“amv”是非天然氨基酸α-甲基缬氨酸的三字母代码。
[0065]“orn”是氨基酸鸟氨酸的三字母代码。
[0066]“sec”是尺寸排阻色谱法。
[0067]“dls”是动态光散射。
[0068]“受试者”在本文中定义为包括动物，诸如哺乳动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在优选的实施方案中，所述受试者是人。受试者包括一个或多个癌症患者。
[0069]
如本文所用，“化学治疗剂”或“化学疗法剂”或“抗肿瘤剂”是指如下剂，其减少、预防和/或延迟转移或肿瘤的生长，或在药学有效量下直接地通过坏死或细胞凋亡杀死肿瘤细胞，以减少、预防和/或延迟患有肿瘤疾病的受试者的转移或肿瘤的生长。
[0070]“化学疗法”是指使用化学治疗剂、化学疗法剂或抗肿瘤剂的治疗。
[0071]
关于含有与化学治疗剂缀合的palm的组合物的“有效量”或“药学有效量”是指足以在受试者中诱导期望的生物学、药理学或治疗结果的所述组合物的量。
[0072]“化学疗法诱导的周围神经病变”是一种毒性神经病变，它是由化学治疗剂直接损伤周围神经系统引起的。cipn可以是急性或慢性的。cipn可以是感觉的、运动的、自主的或所述三类中的任何类的混合形式。
[0073]“神经毒性效应”和“神经毒性”是指改变神经系统的正常活动的毒性物质。
[0074]“神经病理性疼痛”是由周围或中枢神经系统的功能障碍引起的顽固性疼痛。
[0075]
不希望受任何理论束缚，据信紫杉醇(ptx)通过数种机制干扰神经功能。最突出的是由ptx活化与神经相邻的定居巨噬细胞(小胶质细胞)中的toll样受体4(tlr4)的能力引起的神经元周围炎症。ptx与tlr4的结合促使小胶质细胞产生和释放炎症细胞因子。所述细胞因子接着继续活化相邻神经中的疼痛通道。pipn还源于进入神经的ptx并且由于其微管
蛋白靶向能力，干扰轴突中微管蛋白依赖性神经递质的转运。此外，有证据表明ptx导致神经萎缩和丧失。
[0076]
紫杉醇也是认知障碍的根源，认知障碍是另一种困扰化学疗法患者的神经病症。紫杉醇诱导的认知障碍是由于紫杉醇浸润海马并且引起炎症并干扰那里的神经元功能的能力。这些是造成pipn的相同过程。
[0077]
ptx影响神经的多种机制表明，单一的缓解症状的药物抵消pipn不太可能成功。更好的方法将是开发一种使ptx与tlr4和神经完全隔绝，同时保持肿瘤的暴露的配制技术。
[0078]
限制ptx与tlr4相互作用的技术还有附加好处。ptx与tlr4的相互作用与胃肠道炎症和化学抗性有关。活化还与癌细胞转移和生长的诱导有关。此外，由tlr4活化触发的炎症级联导致肿瘤内的免疫抑制。小鼠模型中已显示，ptx诱导的炎症导致肿瘤生长的免疫抑制降低。以下观察结果支持tlr4对肿瘤进展的影响的这些实例：具有低tlr4的肿瘤与高得多的患者存活相关。
[0079]
本公开通过提供脂质和肽的新型palm纳米粒子制剂和形成它们的方法来解决这一需求，所述方法允许并入化学治疗分子(例如药物)，并且其中纳米粒子在输注或注射溶液中是稳定的。本发明的制剂提供一种或多种改进，包括但不限于针对肠胃外施用的抗癌药物、特别是引起cipn和尤其pipn或者与cipn和尤其pipn相关的化学治疗剂的改善的药代动力学参数、增加的半衰期、靶向递送、削弱的毒性或改善的治疗指数。
[0080]
本公开提供包含氨基酸序列seq id no:1、seq id no:24、seq id no:37或seq id no:59的两亲性α-螺旋肽。
[0081]
此外，本公开还提供肽两亲性脂质胶束(palm)，其包含含有本公开的氨基酸序列的肽、鞘磷脂和一种或多种额外磷脂。本公开的palm任选地包含一种或多种货物分子，诸如显像剂和药物。
[0082]
本公开还提供用于制备palm和用货物分子配制的palm组合物的方法。
[0083]
另外，本公开还提供适合与palm使用的化合物缀合物和制备化合物缀合物的方法。
[0084]
此外，本公开还提供通过施用palm-化学治疗剂缀合物来治疗或预防cipn(例如pipn)不良事件的方法。
[0085]
本发明提供一种治疗受试者的cipn的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的含有palm纳米粒子的组合物，所述palm纳米粒子含有如本文所例示的引起cipn的化学治疗剂。
[0086]
另一方面，本发明提供一种预防性治疗受试者的cipn的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的含有palm纳米粒子的组合物，所述palm纳米粒子含有如本文所例示的引起cipn的化学治疗剂。
[0087]
另一方面，本发明提供一种用于减轻引起cipn和/或与cipn有关的化学治疗剂的神经毒性效应的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的含有palm纳米粒子的组合物，所述palm纳米粒子含有如本文所例示的引起cipn的化学治疗剂。
[0088]
另一方面，本发明提供一种用于治疗受试者的化学疗法诱导的神经病理性疼痛的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的含有palm部分的组合物，所述palm部分与如本文所例示的引起cipn的化学治疗剂缀合。
x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17-x
18-x
19-x
20
，其中：x1为氨基酸d；x2和x
20
各自为氨基酸v或aib；x3、x6、x
10
和x
13
各自为独立地选自由l和f组成的组的氨基酸；x4、x
12
和x
19
各自为氨基酸q；x5为氨基a或aib；x
7、
x
16
和x
18
各自为氨基酸k；x8和x
15
各自为氨基酸e；x9和x
14
各自为独立地选自由a、l、f和aib组成的组的氨基酸；x
11
是选自由a、aib和n组成的组的氨基酸；并且x
17
是选自由w、f和l组成的组的氨基酸，(seq id no:1)其中所述肽为20个至24个氨基酸长。
[0108]
第一方面的另一实施方案提供一种肽，其由以下氨基酸序列组成：x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17-x
18-x
19-x
20
，其中：x1为氨基酸d；x2和x
20
各自为氨基酸v或aib；x3、x6、x
10
和x
13
各自为独立地选自由l和f组成的组的氨基酸；x4、x
12
和x
19
各自为氨基酸q；x5为氨基a或aib；x7、x
16
和x
18
各自为氨基酸k；x8和x
15
各自为氨基酸e；x9和x
14
各自为独立地选自由a、l、f和aib组成的组的氨基酸；x
11
是选自由a、aib和n组成的组的氨基酸；并且x
17
是选自由w、f和l组成的组的氨基酸。(seq id no:1)
[0109]
第一方面的另一实施方案提供一种肽，其包含以下氨基酸序列：x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17-x
18-x
19-x
20
，其中：x1、x8和x
15
是独立地选自由氨基酸d和e组成的组；x2和x
20
各自为独立地选自由v、y、aib和l组成的组的氨基酸；x6、x
10
和x
17
是选自由l、i、v、w、y和f组成的组的氨基酸；x4、x
11
、x
12
和x
19
各自为独立地选自由q和n组成的组的氨基酸；x5、x
16
和x
18
各自为独立地选自由k、r、h和orn组成的组的氨基酸；x3、x7、x9、x
13
和x
14
各自为独立地选自由a、l、f、v、amv和aib组成的组的氨基酸；x
11
是选自由a、g、s、aib、amv、v和n组成的组的氨基酸；并且x
17
是选自由w、f、y、i、v和l组成的组的氨基酸，(seq id no:24)其中所述肽为20个至24个氨基酸长。
[0110]
第一方面的另一实施方案提供一种肽，其基本上由以下氨基酸序列组成：x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17-x
18-x
19-x
20
，其中：x1是选自由d和e组成的组的氨基酸；x2和x
20
各自为独立地选自由v、i、aib和l组成的组的氨基酸；x3、x6、x
10
和x
13
各自为独立地选自由l、i、v、w、y和f组成的组的氨基酸；x4、x
12
和x
19
各自为独立地选自由q和n组成的组的氨基酸；x5、x
16
和x
18
各自为独立地选自由k、r、h和orn组成的组的氨基酸；x7选自由a、g、s、v、aib和amv组成的组；x8和x
15
独立地选自由氨基酸e和d组成的组；x9和x
14
是独立地选自由a、g、s l、f、v、amv和aib组成的组的氨基酸；x
11
是选自由a、g、s、aib、amv、v和n组成的组的氨基酸；并且x
17
是选自由w、f、y、i、v和l组成的组的氨基酸，(seq id no:24)并且所述肽为20个至24个氨基酸长。
[0111]
第一方面的另一实施方案提供一种肽，其由以下氨基酸序列组成：x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17-x
18-x
19-x
20
，其中：x1是选自由d和e组成的组的氨基酸；x2和x
20
各自为独立地选自由v、i、aib和l组成的组的氨基酸；x3、x6、x
10
和x
13
各自为独立地选自由l、i、v、w、y和f组成的组的氨基酸；x4、x
12
和x
19
各自为独立地选自由q和n组成的组的氨基酸；x5、x
16
和x
18
各自为独立地选自由k、r、h和orn组成的组的氨基酸；x7选自由a、g、s、v、aib和amv组成的组；x8和x
15
独立地选自由氨基酸e和d组成的组；x9和x
14
是独立地选自由a、g、s l、f、v、amv和aib组成的组的氨基酸；x
11
是选自由a、g、s、aib、amv、v和n组成的组的氨基酸；并且x
17
是选自由w、f、y、i、v和l组成的组的氨基酸。(seq id no:24)。
[0112]
预期根据第一方面的肽的任何公开的实施方案任选地在所述肽的n端氨基酸的α-胺处酰化，任选地在所述肽的末端羧基处酰胺化，或者任选地在所述肽的n端氨基酸的α-胺
处酰化并且在末端羧基处酰胺化。肽可以通过本领域中已知的方法酰化或酰胺化。
[0113]
本发明的特定肽提供于下表2中。
[0114]
表2
[0115][0116]
[0117]
本公开的第一方面的一个实施方案是一种肽，其包含氨基酸序列seq id no:1-23中的任一者，其中所述肽为20个至24个氨基酸长。另一实施方案是一种肽，其基本上由氨基酸序列seq id no:1-23中的任一者组成，其中所述肽为20个至24个氨基酸长。另一实施方案是一种肽，其由氨基酸序列seq id no:1-23中的任一者组成。在所公开的肽的上述实施方案中的任一者中，任选地所述肽的n端氨基酸的α-胺被酰化；末端羧基被酰胺化；或者所述肽的n端氨基酸的α-胺被酰化并且末端羧基被酰胺化。
[0118]
本公开的第一方面的一个实施方案是一种肽，其包含氨基酸序列seq id no:25-36中的任一者，其中所述肽为20个至24个氨基酸长。另一实施方案是一种肽，其基本上由氨基酸序列seq id no:25-36中的任一者组成，其中所述肽为20个至24个氨基酸长。另一实施方案是一种肽，其由氨基酸序列seq id no:25-36中的任一者组成。在所述肽的上述实施方案中的任一者中，任选地所述肽的n端氨基酸的α-胺被酰化；末端羧基被酰胺化；或者所述肽的n端氨基酸的α-胺被酰化并且末端羧基被酰胺化。
[0119]
本公开的实施方案还包括具有一般由seq id no:1和24限定的肽的反向序列的肽。
[0120]
本公开的第一方面的一个实施方案提供与seq id no:1反向的肽并且所述肽包含以下氨基酸序列：x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17-x
18-x
19-x
20
，其中x1和x
19
各自为氨基酸v或aib；x2、x9和x
17
各自为氨基酸q；x3、x5和x
14
各自为氨基酸k；x4是选自由w、f和l组成的组的氨基酸；x6和x
13
各自为氨基酸e；x7和x
12
各自为独立地选自由a、l、f和aib组成的组的氨基酸；x8、x
11
、x
15
和x
18
各自为独立地选自由l和f组成的组的氨基酸；x
10
是选自由a、aib和n组成的组的氨基酸；x
16
是选自由a和aib组成的组的氨基酸；并且x
20
为氨基酸d。(seq id no:37)，其中所述肽为20个至24个氨基酸长。
[0121]
本公开的第一方面的另一实施方案提供与seq id no:24反向的肽并且所述反向肽包含以下氨基酸序列：x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17-x
18-x
19-x
20
，其中x1和x
19
各自为独立地选自由v、aib、i和l组成的组的氨基酸；x2、x9和x
17
各自为独立地选自由q和n组成的组的氨基酸；x3、x5和x
16
各自为独立地选自由k、r、h和orn组成的组的氨基酸；x4是选自由w、f、y、i、v和l组成的组的氨基酸；x6、x
13
和x
20
各自为独立地选自由e和d组成的组的氨基酸；x7和x
12
各自为独立地选自由a、g、s、l、f、v、amv和aib组成的组的氨基酸；x8、x
11
、x
15
和x
18
独立地选自由氨基酸l、i、v、w和f组成的组；x
10
是选自由a、g、s、aib、amv、v和n组成的组的氨基酸；并且x
14
是选自由a、g、s、v、aib和amv组成的组的氨基酸。(seq id no:59)，其中所述肽为20个至24个氨基酸长。
[0122]
本公开的第一方面的另一实施方案提供与seq id no:24反向的肽并且所述反向肽由以下氨基酸序列组成：x
1-x
2-x
3-x
4-x
5-x
6-x
7-x
8-x
9-x
10-x
11-x
12-x
13-x
14-x
15-x
16-x
17-x
18-x
19-x
20
，其中x1和x
19
各自为氨基酸v或aib；x2、x9和x
17
各自为氨基酸q；x3、x5和x
14
各自为氨基酸k；x4是选自由w、f和l组成的组的氨基酸；x6和x
13
各自为氨基酸e；x7和x
12
各自为独立地选自由a、l、f和aib组成的组的氨基酸；x8、x
11
、x
15
和x
18
各自为独立地选自由l和f组成的组的氨基酸；x
10
是选自由a、aib和n组成的组的氨基酸；x
16
是选自由a和aib组成的组的氨基酸；并且x
20
为氨基酸d。(seq id no:37)。
[0123]
表3提供本发明的额外肽。这些肽中的氨基酸序列与氨基酸序列seq id no:2-23和25-36反向。
[0124]
表3
[0125][0126][0127]
本公开的第一方面的一个实施方案是一种肽，其包含氨基酸序列seq id no:38-58中的任一者，其中所述肽为20个至24个氨基酸长。另一实施方案是一种肽，其基本上由氨基酸序列seq id no:38-58中的任一者组成。另一实施方案是一种肽，其由氨基酸序列seq id no:38-58中的任一者组成。在所述肽的上述实施方案中的任一者中，任选地所述肽的n端氨基酸的α-胺被酰化；末端羧基被酰胺化；或者所述肽的n端氨基酸的α-胺被酰化并且末端羧基被酰胺化。
[0128]
本公开的第一方面的一个实施方案是一种肽，其包含氨基酸序列seq id no:60-72中的任一者，其中所述肽为20个至24个氨基酸长。另一实施方案是一种肽，其基本上由氨基酸序列seq id no:60-72中的任一者组成。另一实施方案是一种肽，其由氨基酸序列seq id no:60-72中的任一者组成。在所述肽的上述实施方案中的任一者中，任选地所述肽的n端氨基酸的α-胺被酰化；末端羧基被酰胺化；或者所述肽的n端氨基酸的α-胺被酰化并且末端羧基被酰胺化。
[0129]
当本公开的肽包含seq id no:1-72中任一者的氨基酸序列和独立地添加至所述氨基酸序列的n端或c端的1-4个额外的氨基时，选择额外的氨基酸使得所述氨基酸的添加不会消极地影响所述肽的两亲性。
[0130]
本公开的第二方面提供由两亲肽与磷脂的组合形成的肽-两亲性脂质胶束(palm)部分(在本文中也称为“palm”)。本公开的第二方面的palm包含与脂质组分复合的本公开的第一方面的一种或多种肽，其中所述脂质组分包含鞘磷脂和一种或多种额外磷脂。根据本公开的palm可以被动或主动地递送至靶细胞群体。在本公开的第二方面的一个实施方案中，palm包含一种或多种本公开的肽，其中脂质组分基本上由鞘磷脂和一种或多种额外磷脂组成。在一个实施方案中，palm包含本公开的肽和脂质组分，其中所述脂质组分包含鞘磷脂和一种或多种额外磷脂，其中所述额外磷脂选自由以下组成的组：磷脂酰胆碱、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(peg-pe)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、心磷脂和其任何组合。在另一实施方案中，palm包含本公开的肽并且脂质组分包含鞘磷脂和磷脂酰胆碱。在另一实施方案中，palm包含本公开的肽、鞘磷脂和1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(popc)。在另一实施方案中，palm包含本公开的肽并且脂质组分包含鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺。在另一实施方案中，palm包含本公开的肽，并且脂质组分包含鞘磷脂和聚(乙二醇)磷脂酰-乙醇胺。在另一实施方案中，palm包含本公开的肽并且脂质组分包含鞘磷脂和磷脂酰丝氨酸。在另一实施方案中，palm包含本公开的肽并且脂质组分包含鞘磷脂和心磷脂。
[0131]
在本公开的第二方面的另一实施方案中，palm包含本公开的肽并且脂质组分基本上由鞘磷脂和一种或多种额外磷脂组成，其中所述一种或多种额外磷脂选自由以下组成的组：磷脂酰胆碱、聚乙二醇-磷脂酰-乙醇胺(peg-pe)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、心磷脂和其任何组合。在另一实施方案中，palm包含本公开的肽并且脂质组分基本上由鞘磷脂和磷脂酰胆碱组成。在另一实施方案中，palm包含本公开的肽并且脂质组分基本上由鞘磷脂和1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(popc)组成。
[0132]
在本公开的第二方面的[bcmp]一些实施方案中，palm包含本公开的肽并且脂质组分基本上由鞘磷脂和一种或多种额外磷脂组成，其中所述一种或多种额外磷脂选自由磷脂酰胆碱、聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(peg-pe)、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、心磷脂和其任何组合组成的组，其中磷脂与鞘磷脂的摩尔比为约95:5至约10:90。在另一实施方案中，磷脂与鞘磷脂的摩尔比为约90:10至约20:80。在另一实施方案中，磷脂与鞘磷脂的摩尔比为约25:75至约35:65。在另一实施方案中，磷脂与鞘磷脂的摩尔比为约30:70。在另一实施方案中，磷脂与鞘磷脂的摩尔比为约80:20至约60:40。在另一实施方案中，磷脂与鞘磷脂的摩尔比为约75:25至约65:35。在另一实施方案中，磷脂与鞘磷脂的摩尔比为约70:30。[rh2]
[0133]
磷脂的脂肪酸成分包括根据下式的脂肪酸：r-cooh，其中r是(c
7-c
21
)烷基或(c
7-c
21
)烯基，其中所述烯基可以具有一个至六个双键。合适的脂肪酸的实例包括但不限于植烷酸、亚麻酸、亚油酸、二十二碳四烯酸、油酸、辛酸、月桂酸、花生酸、肉豆蔻酸和棕榈酸。酯化至特定磷脂的甘油骨架的脂肪酸对可以是相同的，或者各自可以是不同类型的脂肪酸。
[0134]
脂质组分与肽的摩尔比为约10:1至约2:1。在一个实施方案中，所述比例为约9:1至约2:1。在一个实施方案中，脂质组分与肽的摩尔比为约8:1至约2:1。在另一实施方案中，脂质组分与肽的摩尔比为约7:1至约3:1。在另一实施方案中，脂质组分与肽的摩尔比为约6:1至约4:1。
[0135]
磷脂酰胆碱与两亲肽的复合物是已知的。产生这些复合物的一种方法是从普通溶剂相中进行初始共冻干，接着使干燥的冻干物再水合以在水性悬浮液中形成复合物。
[0136]
通过dls测量粒径并将其表述为流体动力学平均直径(“平均直径”)。根据本公开的第二方面的palm是具有200nm或更小、50nm或更小、40nm或更小或者30nm或更小的平均直径的纳米尺寸粒子。在一个实施方案中，平均粒子直径为约5nm至约200nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约5nm至约50nm。在一个实施方案中，平均粒子直径为约5nm至约30nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约7.5nm至约30nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约10nm至约30nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约5nm至约25nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约7.5nm至约25nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约10nm至约25nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约5nm至约20nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约7.5nm至约20nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约10nm至约20nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约5nm至约15nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约7.5nm至约15nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约10nm至约15nm。在另一实施方案中，平均粒子直径为约7.5nm至约10nm。
[0137]
本公开的第三方面提供包含本公开的第二方面的palm实施方案中的任一者和货物分子的palm-货物分子组合物。货物分子包括但不限于具有药物或治疗特性的分子。货物分子的非限制性实例包括抗癌化合物，诸如全反式视黄酸、全反式视黄酸的醇酯，包括视黄酸的甲基-、乙基-和长链脂肪烷基链醇酯以及视黄酸的胆固醇酯；视黄酸酰胺，诸如芬维a胺；视黄醇和视黄醇的羧酸酯，包括视黄酸的甲基-、乙基-和长链脂肪烷基链醇酯；亲脂性抗真菌剂，诸如两性霉素b或制霉菌素；类固醇，诸如黄体酮、睾酮、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松和雌二醇；止痛剂，诸如丙泊酚和氟哌啶醇；抗精神病药，诸如氟奋乃静癸酸酯和阿立哌唑；维生素d类似物胆钙化醇和麦角钙化醇；以及维生素e的异构体，无论是全体还是个别地。
[0138]
货物分子还包括能够进行诊断或成像程序的分子，诸如荧光成像剂、放射性标记的成像剂和用于mri、pet、ct、spect/ct和x射线研究的剂。mri成像剂包括但不限于造影剂，诸如具有与钆离子或类似镧系元素离子或铟-111或镓-67或镥-177或钐-153螯合的二亚乙基三胺五乙酸部分的磷脂酰乙醇胺。
[0139]
货物分子也可以是已经通过已知方法与胆固醇或其他多环脂肪醇连接的各种类型和长度的rna或dna。
[0140]
在第三方面的一个实施方案中，货物分子是具有以下化学名称的米铂：顺-[((1r,2r)-1,2-环己二胺-n,n')双(肉豆蔻酸)]铂(ii)。
[0141][0142]
本公开的第三方面的其他实施方案是一种palm-货物分子复合物，其中所述货物分子是式i的化合物缀合物
[0143]
a-r-l-x
ꢀꢀ
(式i)
[0144]
其中a是具有羟基或胺基的剂；r是所述剂的羟基或胺基；l是接头，并且x是锚部分。
[0145]
本公开的第三方面的另一实施方案是一种palm-货物分子复合物，其中所述货物分子是式i的化合物缀合物：
[0146]
a-r-l-x
ꢀꢀ
(式i)
[0147]
其中a是具有羟基或胺基的剂；r是所述剂的羟基或胺基；l是碳酸、琥珀酸或二甘醇酸；并且x是胆固醇、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、粪甾醇、植物甾醇、(β-谷甾醇、谷甾烷醇、豆甾醇、豆甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇)、麦角甾醇、视黄醇、胆钙化醇、麦角钙化醇、生育酚或生育三烯酚。
[0148]
本公开的第三方面的另一实施方案是一种palm-货物分子复合物，其中所述货物分子是式i的化合物缀合物：
[0149]
其中a是具有羟基或胺基的剂；r是所述剂的羟基或胺基；l是选自由碳酸、琥珀酸或二甘醇酸组成的组；并且x选自由以下组成的组：胆固醇、α-生育三烯酚、β-生育三烯酚、γ-生育三烯酚、δ-生育三烯酚、胆固醇、粪甾醇、植物甾醇、(β-谷甾醇、谷甾烷醇、豆甾醇、豆甾烷醇、菜油甾醇、菜子甾醇)、麦角甾醇、视黄醇、胆钙化醇、麦角钙化醇、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚和δ-生育酚，
[0150]
本公开的第三方面的另一实施方案是一种palm-货物分子复合物，其中所述货物分子是式i的化合物缀合物：
[0151]
其中a是具有羟基或胺基的剂；r是所述剂的羟基或胺基；l是接头；并且x是选自由胆固醇、胆钙化醇和δ-生育三烯酚组成的组的锚部分。
[0152]
在式(1)的化合物缀合物的一个实施方案中，r是所述剂的羟基，并且所述锚部分通过碳酸酯键与剂共价键合。在式(1)的化合物缀合物的另一实施方案中，r是所述剂的胺基，并且所述锚部分通过氨基甲酸酯键与剂共价键合。
[0153]
在式(1)的化合物缀合物的另一实施方案中，所述锚部分是胆固醇。在式(1)的化合物缀合物的另一实施方案中，所述锚部分是胆固醇，条件是如果所述锚部分是胆固醇，那么所述化合物不是紫杉醇。
[0154]
在式(1)的化合物缀合物的另一实施方案中，所述锚部分是α-生育三烯酚。在式(1)的化合物缀合物的另一实施方案中，所述锚部分是β
–
生育三烯酚。在式(1)的化合物缀合物的另一实施方案中，所述锚部分是γ
–
生育三烯酚。在式(1)的化合物缀合物的另一实施方案中，所述锚部分是δ-生育三烯酚。在式(1)的化合物缀合物的另一实施方案中，所述锚部分是麦角钙化醇。
[0155]
在式(1)的化合物缀合物的一些实施方案中，所述剂是药物。
[0156]
在式(1)的化合物缀合物的一些实施方案中，所述剂是引起cipn和/或与cipn相关的化学治疗剂。在式(1)的化合物缀合物的一个实施方案中，所述剂是引起cipn的化学治疗剂并且所述化学治疗剂通过碳酸酯键与锚共价键合。
[0157]
在式(1)的化合物缀合物的一个实施方案中，所述剂是引起cipn的化学治疗剂并且所述引起cipn的化学治疗剂通过氨基甲酸酯键与锚共价键合。
[0158]
具有可用于形成碳酸酯键的羟基的引起cipn的化学治疗剂的非限制性实例包括长春新碱、去乙酰长春花碱、去乙酰长春瑞滨、微管溶素a、埃博霉素b、伊沙匹隆、艾日布林、恩坦辛、多西他赛、卡巴他赛或紫杉醇。
[0159]
●
具有可用于形成氨基甲酸酯键的胺的引起cipn的化学治疗剂的非限制性实例包括吉西他滨和阿糖胞苷。
[0160]
在本公开的第三方面的palm-化学治疗剂缀合的纳米粒子组合物的一些实施方案中，所述引起cipn的化学治疗剂是紫杉醇2'-胆固醇碳酸酯。在另一实施方案中，所述化学治疗剂是紫杉醇2'-δ-生育三烯基碳酸酯。
[0161]
在其他实施方案中，所述引起cipn的化学治疗剂是多西他赛2'-胆固醇碳酸酯。在其他实施方案中，所述引起cipn的化学治疗剂是吉西他滨的胆固醇碳酸酯。在其他实施方案中，所述引起cipn的化学治疗剂是微管溶素a的胆固醇碳酸酯。
[0162]
在本公开的第三方面的palm-化学治疗剂缀合的纳米粒子组合物的其他实施方案中，所述引起cipn的化学治疗剂是吉西他滨的胆固醇氨基甲酸酯(胆固醇(n4)-吉西他滨氨基甲酸酯)。
[0163]
在其他实施方案中，所述引起cipn的化学治疗剂是长春新碱的胆固醇碳酸酯，其结构是：
[0164][0165]
在另一实施方案中，所述引起cipn的化学治疗剂是紫杉醇的δ-生育三烯基氨基甲酸酯，其结构是：
[0166][0167]
在另一实施方案中，所述引起cipn的化学治疗剂是吉西他滨δ-生育三烯基氨基甲酸酯，其结构是：
[0168][0169]
表4提供可用于本发明的引起cipn的化学治疗剂[3](a)的非限制性实例的结构，其中羟基或胺基(r)由箭头指示。
[0170]
表4
[0171][0172]
表5提供式a-r-l-x的palm-化学治疗剂组合物的非限制性实例。
[0173]
表5
[0174]
[0175][0176]
本公开的第四方面提供惊人有效的共冻干技术，以从由叔丁醇和水构成的均质溶剂相产生palm或palm-化学治疗剂纳米粒子组合物。这种方法的优点是：1)所有palm成分，包括肽、磷脂和任选的亲脂性货物(例如引起cipn的化学治疗剂)，例如紫杉醇2'-胆固醇碳酸酯，均在单一溶剂相中共溶，2)溶剂组分完全混溶并且充分适合通过标准冻干程序去除，3)所述程序避免了潜在有毒的物质，因为叔丁醇是一种低毒性的3类溶剂，和4)所得干燥的冻干物使得有机会在存储期间获得比水性制剂可能更高的稳定性。
[0177]
用于制备palm的溶剂混合物优选为叔丁醇(tba)和水的混合物。在一个实施方案
中，tba与水的百分比比例是在约70％:30％至约90％:10％之间。在另一实施方案中，所述比率是在约75％:25％与约85％:15％之间。在另一实施方案中，所述比率是80％:20％。
[0178]
第四方面的一个实施方案提供一种用于制备palm的方法，所述方法包括以下步骤：
[0179]
i)使两亲肽在第一溶剂混合物中溶解以提供肽溶液；
[0180]
ii)使鞘磷脂在第二溶剂混合物中溶解以提供鞘磷脂溶液
[0181]
iii)使额外磷脂在第三溶剂混合物中溶解以提供磷脂溶液；
[0182]
iv)组合所述肽溶液、所述鞘磷脂溶液和所述磷脂溶液以形成肽/鞘磷脂/磷脂溶液；和
[0183]
v)冻干所述肽/鞘磷脂/磷脂溶液，
[0184]
其中步骤i)、ii)和iii)以任何顺序执行；并且其中第一、第二和第三溶剂混合物包含叔丁醇和水。
[0185]
本公开的第四方面的另一实施方案提供一种用于制备palm的方法，所述方法包括以下步骤：
[0186]
i)组合两亲肽、鞘磷脂和额外磷脂，以形成肽/鞘磷脂/磷脂混合物；
[0187]
ii)使所述肽/鞘磷脂/磷脂混合物在溶剂混合物中溶解以形成肽鞘磷脂/磷脂溶液；和
[0188]
iii)冻干所述肽/磷脂溶液，
[0189]
其中溶剂混合物包含叔丁醇和水。
[0190]
本公开的第四方面另外提供一种用于制备包含引起cipn的化学治疗剂的palm以形成palm-化学治疗剂纳米粒子的方法。为了制备palm-化学治疗剂纳米粒子，在溶剂混合物中各自独立地制备肽、鞘磷脂、一种或多种额外磷脂和引起cipn的化学治疗剂并且视所需制剂而定，使其以特定的摩尔比组合。或者，可以直接组合肽、鞘磷脂、一种或多种额外磷脂和引起cipn的化学治疗剂，而无需预先溶解，并且接着用所需的溶剂混合物使其成为溶液，随后冻干。
[0191]
本公开的第四方面的一个实施方案提供一种用于制备palm-化学治疗剂纳米粒子的方法，所述方法包括以下步骤：
[0192]
i)使两亲肽在第一溶剂混合物中溶解以提供肽溶液；
[0193]
ii)使鞘磷脂在第二溶剂混合物中溶解以提供鞘磷脂溶液
[0194]
iii)使额外磷脂在第三溶剂混合物中溶解以提供磷脂溶液；
[0195]
iv)使引起cipn的化学治疗剂在第四溶剂混合物中溶解以提供货物分子溶液；
[0196]
v)组合所述肽溶液、所述鞘磷脂溶液、所述磷脂溶液和所述引起cipn的化学治疗剂溶液以形成肽/鞘磷脂/磷脂/化学治疗剂溶液；和
[0197]
vi)冻干所述肽/鞘磷脂/磷脂/化学治疗剂溶液，
[0198]
其中步骤i)、ii)、iii)和iv)以任何顺序执行；并且其中第一、第二、第三和第四溶剂混合物包含叔丁醇和水。
[0199]
制备palm-化学治疗剂纳米粒子的另一实施方案包括以下步骤：
[0200]
i)组合两亲肽、鞘磷脂、额外磷脂和货物分子，以形成肽/鞘磷脂/磷脂/货物分子混合物；
[0201]
ii)使所述肽/鞘磷脂/磷脂/货物分子混合物在溶剂混合物中溶解以形成肽/磷脂溶液；和
[0202]
iii)冻干所述肽/鞘磷脂/磷脂/化学治疗剂溶液，
[0203]
其中溶剂混合物包含叔丁醇和水。
[0204]
所得的冻干饼可以长期存储并且将保持稳定。通过添加任何合适的水溶液(例如水或生理盐水)，随后使内容物轻轻地涡旋来使冻干的产物再水合。可以通过在50℃下孵育palm溶液持续5至30分钟来增强palm冻干物的复原。接着对所述溶液进行过滤灭菌(0.2μm)并存储于4-8℃下。或者，对包含肽、磷脂和货物分子的溶剂混合物进行过滤灭菌，随后冻干。
[0205]
本公开的第五方面提供用于治疗cipn(例如，紫杉醇诱导的周围神经病变(pipn))的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的组合物，所述组合物包含根据本公开的任一实施方案的含有palm-化学治疗剂的纳米粒子组合物。
[0206]
清道夫受体b-1(sr-b1)是一种膜受体，它与载脂蛋白a-i(hdl的主要蛋白质组分)结合，以促进胆固醇的细胞转运。胆固醇是用于使细胞(如在恶性肿瘤中发现的那些)增殖的必需营养素。sr-b1在许多肿瘤细胞中高度表达，包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、肾上腺癌、皮肤癌、鼻咽癌和卵巢癌。一些两亲肽也被sr-bi识别并结合。palm由磷脂和两亲肽的组合形成，经设计与sr-bi结合，从而选择性地将化学治疗剂递送至sr-bi阳性细胞。
[0207]
对于药物用途，冻干的palm可以在单剂量或多剂量容器中提供，所述冻干的palm可以在使用时(例如，医院或医生的办公室)使用标准稀释剂(诸如无菌注射用水、无菌生理盐水或无菌5％葡萄糖溶液)方便地复原。接着用灭菌混合物在无菌条件下填充合适的容器，冻干并适当密封以维持冻干材料的无菌性。合适的容器包括但不限于包含橡胶密封件的小瓶或等效物，其允许例如经由注射器引入用于复原的稀释剂。此类palm制剂适用于肠胃外施用，包括静脉内、皮下、肌肉内、腹膜内注射。
[0208]
本发明还部分地涉及包含palm和引起cipn的化学治疗剂的所有组合物，以及其使用方法。palm分子和其引起cipn的化学治疗剂可以与或不与赋形剂一起施用。赋形剂包括但不限于包封剂和添加剂，诸如吸收促进剂、抗氧化剂、粘合剂、缓冲剂、包衣剂、着色剂、稀释剂、崩解剂、乳化剂、增量剂、填充剂、调味剂、保湿剂、润滑剂、香料、防腐剂、推进剂、释放剂、灭菌剂、甜味剂、增溶剂、润湿剂、其混合物等。
[0209]
欲以单剂量或分次剂量施用于人或其他哺乳动物宿主的本发明的palm的总日剂量可以是例如每天0.1至300mg/kg体重并且更通常每天0.1至200mg/kg体重的量，或每天0.1至100mg/kg体重的剂量。
[0210]
在本发明的一个实施方案中，palm-化学治疗剂纳米粒子的剂量(总计)在0.1至300mg/kg[bcmp4]的范围、5至200mg/kg的范围、10至100mg/kg的范围或10mg/kg至50mg/kg的范围内。在本发明的另一实施方案中，palm分子和化学治疗剂的剂量(总计)为约5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、80mg/kg、90mg/kg或100mg/kg、200mg/kg、300mg/kg。所述剂量可以一天施用一次。所述剂量可以一周施用三次。或者，所述剂量可以一周施用两次。或者，所述剂量可以一周施用一次。在另一实施方案中，所述剂量可以一个月施用一次。
[0211]
在相关的实施方案中，palm和化学治疗剂的组合中的化学治疗剂的量，所述剂量可以介于患者的每千克体重约0.01mg至约35mg、每千克体重约0.01mg至约30mg、每千克体重约0.01mg至约25mg、每千克体重约0.01至约20mg或每千克体重约0.01至约10mg范围内。在进一步相关的实施方案中，具有palm分子的组合物中的化学治疗剂的量是规定的美国食品与药物管理局(fda usa)或欧洲药品管理局(ema)批准的用于治疗患者可能患有或所治疗的癌症的化学治疗剂的剂量。
[0212]
在一个实施方案中，cipn是感觉的。在一个实施方案中，所述神经病变表现为远端轴突病变。在另一实施方案中，所述神经病变表现为感觉迟钝、感觉异常、灼热、麻木和/或疼痛。
[0213]
在一个实施方案中，所述cipn是运动的。在另一实施方案中，所述神经病变表现为肌萎缩。在另一实施方案中，所述神经病变表现为远端深腱反射丧失。
[0214]
在一个实施方案中，cipn是自主的。
[0215]
在一个实施方案中，受试者发展化学疗法诱导的周围神经病变的风险升高。发展cipn的风险升高的受试者具有预先存在的疾患，包括糖尿病、营养缺乏、酗酒和先前暴露于神经毒性化学疗法。在另一实施方案中，受试者具有神经病变的既往史。先前的神经病变可能是由糖尿病、营养缺乏、酗酒、遗传性疾病和/或神经毒性化学疗法引起的。
[0216]
在一个实施方案中，除了伴随含palm的组合物的化学治疗剂以外，本发明还包括施用一种或多种化学治疗剂的步骤。
[0217]
在各种实施方案中，含palm的组合物和/或货物分子中的一种或多种化学治疗剂可以包括例如抗代谢物(即，叶酸拮抗剂、嘌呤拮抗剂和嘧啶拮抗剂)、博来霉素、dna烷基化剂(即，亚硝基脲、交联剂和烷基化剂)、激素、芳香化酶抑制剂、单克隆抗体、抗生素、铂络合物、蛋白酶体抑制剂、紫杉烷类似物、长春花生物碱、拓扑异构酶抑制剂(即，蒽环类、喜树碱、鬼臼毒素)、酪氨酸激酶抑制剂或其组合。
[0218]
在另一实施方案中，含palm的组合物和/或货物分子中的一种或多种化学治疗剂可以包括例如铂络合物、长春花类似物、紫杉烷类似物、烷基化剂、抗代谢物、蛋白酶体抑制剂或其组合。
[0219]
铂络合物可以包括例如顺铂、奥沙利铂、依铂、洛铂、奈达铂、卡铂、沙铂、甲啶铂、米铂等。
[0220]
长春花生物碱可以包括例如长春新碱、长春花碱、长春瑞滨、长春地辛等。
[0221]
紫杉烷可以包括例如紫杉醇、多西他赛、卡巴他赛和其各种制剂和类似物。
[0222]
烷基化剂可以包括例如达卡巴嗪、丙卡巴肼、替莫唑胺、噻替哌、氮芥、苯丁酸氮芥、l-苯丙氨酸氮芥、美法仑、异环磷酰胺、环磷酰胺、马磷酰胺(mefosphamide)、培磷酰胺、氯乙环磷酰胺、白消安、卡莫司汀、洛莫司汀、噻替哌、司莫司汀等。
[0223]
抗代谢物包括培美曲塞二钠、5阿扎胞苷、卡培他滨、卡莫弗、克拉屈滨、氯法拉滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷十八烷基磷酸钠、胞嘧啶阿拉伯糖苷、地西他滨、去铁胺、去氧氟尿苷、依氟鸟氨酸、依诺他滨、乙炔胞苷、氟达拉滨、单独或与甲酰四氢叶酸组合的5氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、美法仑、巯基嘌呤、6巯基嘌呤核苷、甲氨蝶呤、霉酚酸、奈拉滨、诺拉曲塞、十八烷基磷酸钠、培立曲醇、喷司他丁、雷替曲塞、利巴韦林、曲阿平、曲美沙特、s-1、噻唑呋林、替加氟、ts-1、阿糖腺苷、uft等。
[0224]
蛋白酶体抑制剂可以包括例如硼替佐米。
[0225]
拓扑异构酶抑制剂包括阿柔比星、9-氨基喜树碱、阿莫那芬、安吖啶、贝卡林、贝洛替康、盐酸伊立替康、喜树碱、地塞佐辛、二氟莫替康、依多卡林、表柔比星、依托泊苷、艾沙替康、10-羟基喜树碱、吉美替康、鲁托替康、米托蒽醌、奥拉热星、吡柔比星、匹杉琼、卢比替康、索布佐生、sn-38、他氟泊苷、拓扑替康等。
[0226]
在另一实施方案中，化学治疗剂是硼替佐米、卡铂、顺铂、米索硝唑、奥沙利铂、丙卡巴肼、沙利度胺、多西他赛、六甲基三聚氰胺、紫杉醇、长春新碱、长春花碱或长春瑞滨。
[0227]
在一个实施方案中，化学治疗剂是多西他赛、紫杉醇、卡铂、多柔比星、顺铂、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸。
[0228]
在多个实施方案中，经历cipn或可能经历cipn的患者正在用或先前已经用化学治疗剂(例如，多西他赛、紫杉醇、卡铂、顺铂、吉西他滨、奥沙利铂、卡培他滨、5-氟尿嘧啶和甲酰四氢叶酸中的一者或多者)治疗，所述化学治疗剂在如此治疗的患者中引起cipn，或与患者中的cipn相关或可能在患者中引起cipn。在这些患者中，治疗或预防cipn(例如，pipn)的方法包括提供与新制剂相关的对患者进行治疗的化学治疗剂，所述制剂包含含有palm的组合物，以治疗患者的cipn或预防所治疗的癌症患者发生cipn。
[0229]
在另一实施方案中，施用一种或多种化学治疗剂来治疗癌症。
[0230]
在本发明的一个实施方案中，正在治疗的癌症是听神经瘤、急性白血病、急性淋巴细胞性白血病、急性髓细胞性白血病(单核细胞性、成髓细胞性、腺癌、血管肉瘤、星形细胞瘤、骨髓单核细胞性和早幼粒细胞性)、急性t细胞白血病、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、脑癌、乳腺癌、支气管癌、宫颈癌、软骨肉瘤、脊索瘤、绒毛膜癌、慢性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性髓系白血病、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、囊腺癌、弥漫性大b-细胞淋巴瘤、增生异常改变(发育不良和化生)、胚胎性癌、子宫内膜癌、内皮肉瘤、室管膜瘤、上皮癌、红白血病、食管癌、雌激素受体阳性乳腺癌、原发性血小板増多症、尤文氏肉瘤(ewing's tumor)、纤维肉瘤、滤泡性淋巴瘤、生殖细胞睾丸癌、神经胶质瘤、重链病、成血管细胞瘤、肝癌、肝细胞癌、激素不敏感性前列腺癌、平滑肌肉瘤、脂肪肉瘤、肺癌、淋巴管内皮肉瘤、淋巴管肉瘤、成淋巴细胞性白血病、淋巴瘤(霍奇金氏和非霍奇金氏)、膀胱、乳房、结肠、肺、卵巢、胰腺、前列腺、皮肤和子宫的恶性肿瘤和过度增生性病症、t-细胞或b-细胞起源的淋巴系统恶性肿瘤、白血病、淋巴瘤、髓样癌、成髓细胞瘤、黑素瘤、脑膜瘤、间皮瘤、多发性骨髓瘤、髓性白血病、骨髓瘤、粘液肉瘤、神经母细胞瘤、非小细胞肺癌、少突神经胶质细胞瘤、口腔癌、成骨性肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、乳头状腺癌、乳头状癌、松果体瘤、真性红细胞增多症、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、皮脂腺癌、精原细胞瘤、皮肤癌、小细胞肺癌、实体瘤(癌和肉瘤)、小细胞肺癌、胃癌、鳞状细胞癌、滑膜瘤、汗腺癌、甲状腺癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、睾丸肿瘤、子宫癌和维尔姆斯瘤。
[0231]
在本发明的另一实施方案中，正在治疗的癌症选自由以下组成的组：卵巢癌、宫颈癌、结肠直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、胃腺癌、头颈癌、睾丸癌、白血病、神经母细胞瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤和非小细胞肺癌。
[0232]
包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂的施用可以在所述一种或多种化学治疗剂的施用之前、之前即刻、期间、之后即刻或之后。包含palm和化学治疗剂的组合物可以
在cipn确立之前预防性施用，或可施用以治疗确立的cipn。所述确立的cipn可以是急性或慢性的。
[0233]
在本文所涵盖的预防和治疗cipn的方法的多个实施方案中，在cipn之前、期间或之后施用于癌症患者的组合物可以含有介于约5mg至约5,000mg范围内的量的化学治疗剂，所述量可以包含所述化学治疗剂的有效剂量，或次有效剂量，或日剂量，或分次日剂量。
[0234]
在一些实施方案中，可以在1、2、3、4、5、6、7或8个周期中以20mg/m2至140mg/m2的范围施用顺铂。例如，可以每天施用20mg/m2的顺铂，每个周期持续五天。可以每四周(第1天)每个周期一次施用75至100mg/m2的顺铂。可以每三至四周(第1天)每个周期一次施用50至70mg/m2的顺铂。
[0235]
可以每三至四周(第1天)每个周期一次施用约300mg/m2或更少或者约360mg/m2或更少的卡铂。可以在1、2、3、4、5、6、7或8个周期中施用卡铂。
[0236]
可以每2周每个周期一次施用约85mg/m2或更少的奥沙利铂。可以在1、2、3、4、5、6、7或8个周期中施用奥沙利铂。
[0237]
可以在1、2、3、4、5、6、7或8个周期中施用约60mg/m2至约100mg/m2的多西他赛。例如，可以每三周(第1天)每个周期一次施用75mg/m2的多西他赛。
[0238]
可以在1、2、3、4、5、6、7或8个周期中以约100mg/m2至约175mg/m2的范围施用紫杉醇。可以每3周(第1天)每个周期一次施用约100mg/m2的紫杉醇。可以每3周(第1天)每个周期一次施用约135mg/m2的紫杉醇。可以每3周(第1天)每个周期一次施用约175mg/m2的紫杉醇。
[0239]
可以每一至四周(第1天)每个周期一次以约0.4mg/m2至1.4mg/m2的范围施用长春新碱。可以在1、2、3、4、5、6、7或8个周期中施用长春新碱。
[0240]
可以每一至四周(第1天)每个周期一次以约3.7mg/m2至约18.5mg/m2的范围施用长春花碱。例如，可以施用3.7mg/m2、5.5mg/m2、7.4mg/m2、9.25mg/m2或11.1mg/m2的长春花碱。可以在1、2、3、4、5、6、7或8个周期中施用长春花碱。
[0241]
可以每一至六周(第1天)每个周期一次以约25m g/m.sup.2至约120mg/m2的范围施用长春瑞滨。例如，可以施用30mg/m2的长春瑞滨。可以在1、2、3、4、5、6、7或8个周期中施用长春瑞滨。
[0242]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一天施用一次，例如在周期的第1天施用，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0243]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一天施用两次，例如在周期的第1天施用，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0244]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一周施用两次，例如在周期的第1天施用，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0245]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一周施用一次，例如在周期的第1天施用，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0246]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一周施用一次，例如在周期的第1天施用，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0247]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一天施用一次，其中在周期的第1天施用一种或多种化学治疗剂，其中周期为5天、1周、2周、3
周、4周、5周或6周。
[0248]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一天施用两次，其中在周期的第1天施用一种或多种化学治疗剂，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0249]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一周施用两次，其中在周期的第1天施用一种或多种化学治疗剂，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0250]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一周施用一次，其中在周期的第1天施用一种或多种化学治疗剂，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0251]
在一个实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在治疗周期期间一周施用一次，其中在周期的第1天施用一种或多种化学治疗剂，其中周期为5天、1周、2周、3周、4周、5周或6周。
[0252]
在另一实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在化学疗法之前至少一天施用。在另一实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在化学疗法之前施用持续两天。在另一实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在化学疗法之前施用持续一周。在另一实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在每一次化学疗法治疗之前即刻施用。在另一实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂与每一次化学疗法治疗同时施用。在另一实施方案中，包含palm和化学治疗剂的组合物和其制剂在化学疗法之后施用。
[0253]
在上述实施方案的一个小组中，化学疗法和化学疗法治疗可以包括单次施用或多次施用本公开的组合物，例如在不存在任何额外化学治疗剂的情况下包含palm和化学治疗剂的组合物。在如上文所例示的其他相关实施方案中，化学疗法和化学疗法治疗包括施用与存在于包含palm和化学治疗剂的组合物和制剂中的化学治疗剂不同的化学治疗剂，并且提及化学疗法和化学疗法治疗意指施用与存在于含有palm和化学治疗剂的组合物中的化学治疗剂不同的化学治疗剂。
[0254]
本发明还允许施用更高剂量的化学疗法。另外，本发明允许施用额外的化学疗法周期。本发明还允许减少化学疗法周期之间的时间。
[0255]
cipn发病率的严重程度以等级反映，即0、1、2、3或4。量表从0级(正常和无症状)逐步升级至4级(伤残和/或危及生命)。(postma t.j.,annals of oncology 1998 9:739-744)。3级需要矫正措施，包括剂量减少和/或延迟。
[0256]
临床实践中有多种常见毒性标准(ctc)量表用于评估cipn的严重程度：世界卫生组织(who)量表、美国东部肿瘤协作组(ecog)量表、美国国家癌症研究所
‑‑
常见毒性标准(nci-ctc)和阿贾尼量表(ajani scale)。(cavaletti g.等人,european journal of cancer 201046:479-494)。所述量表代表客观评估和患者对cipn效应的感知的组合。
[0257]
本发明的一个实施方案提供用含有palm和化学治疗剂的本发明组合物治疗(包括预防性治疗)化学疗法诱导的周围神经病变的方法，其中3级或4级cipn的发病率降低。在另一实施方案中，1级或2级cipn的发病率降低。在另一实施方案中，3级或4级cipn的发病率降低至1级或2级cipn。在另一实施方案中，2级cipn的发病率降低至1级。
[0258]
本发明还提供一种用于减轻化学治疗剂的神经毒性效应的方法，其中3级或4级cipn的发病率降低。在另一实施方案中，1级或2级cipn的发病率降低。在另一实施方案中，3级或4级cipn的发病率降低至1级或2级cipn。在另一实施方案中，2级cipn的发病率降低至1级。
[0259]
或者，可以通过生活质量评价来评估cipn。一种此类评估是欧洲癌症研究和治疗组织(eortc)qlq-cipn20问卷。(cavaletti g.等人,european journal of cancer 2010 46:479-494)。
[0260]
在本发明的一个实施方案中，当癌症患者被施用含有palm和化学治疗剂的本发明组合物的一次或多次施用时，根据eortc qlq-cipn 20问卷cipn有所改善，其中所述引起cipn或与cipn相关的剂是存在于本发明组合物中的相同化学治疗剂。
[0261]
本发明的一个实施方案提供用含有palm和化学治疗剂的本发明组合物治疗或预防化学疗法诱导的神经病理性疼痛的方法。神经病理性疼痛是由周围或中枢神经系统的功能障碍引起的顽固性疼痛。
[0262]
可以通过生活质量评估来评价疼痛。一种此类评估是欧洲癌症研究和治疗组织(eortc)eortc qlq-c30/l13问卷。
[0263]
在本发明的一个实施方案中，基于eortc qlq-c30/l13问卷的评估，疼痛有所减轻。
[0264]
在本发明的一个实施方案中，疼痛是周围神经病理性疼痛或中枢神经病理性疼痛。
[0265]
在本发明的另一实施方案中，疼痛是慢性或急性的。
[0266]
在本发明的另一实施方案中，减少对疼痛的支持性护理的使用。支持性护理包括例如nsaids或阿片类药物。
[0267]
本文所引用的所有参考文献(包括出版物、专利申请和专利)据此以引用的方式并入，其程度就如同个别地且特定地指示各参考文献以引用的方式并入且在本文中阐述其全文一般。
[0268]
除非本文中另外地指示或明显地与上下文矛盾，否则在描述本发明的上下文中(尤其是在以下权利要求书的上下文中)，术语“一个(a/an)”和“所述”以及类似指称对象的使用应解释为涵盖单数和复数两者。除非另外注明，否则术语“包含”、“具有”、“包括”和“含有”应解释为开放式术语(即，意指“包括但不限于”)。除非本文另外指明，否则本文中值范围的列举仅仅意图用作个别地提及属于所述范围的各单独值的速记方法，并且犹如本文个别描述地那样将各单独值并入本说明书中。除非本文中另外指出或与上下文明显矛盾，否则本文中所描述的所有方法都可以按任何合适的顺序执行。本文所提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅意图更好地说明本发明，并且除非另外要求，否则不会对本发明的范围施加限制。本说明书中的语言不应解释为将任何非要求的要素指示为实践本发明所必需。
[0269]
本文描述本发明的优选实施方案，包括发明人已知的用于实施本发明的最佳模式。在阅读上述说明后，那些优选实施方案的变体对于本领域的普通技术人员可以变得显而易见。本发明人希望熟练技术人员在适当时采用此类变体，并且本发明人意图不同于如本文特定地描述来实践本发明。因此，在适用法律允许的情况下，本发明包括在所附的权利
要求书中所引用的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变体中的上述要素的任何组合。
[0270]
实施例
[0271]
实施例1.肽合成和纯化
[0272]
由genscript usa,inc.(piscataway,nj)的标准fmoc固相合成技术产生肽。通过标准程序对某些肽在末端氨基酸处通过n端的乙酰化和c端的酰胺化进行修饰。通过用于肽纯化的标准高效液相色谱方法将肽以色谱法纯化至大于95％纯度。通过hplc和质谱分析确认纯度。
[0273]
实施例2.紫杉醇2'-胆固醇碳酸酯(xc)合成
[0274]
将五十毫克紫杉醇溶解于2ml氯仿中并且接着在2ml氯仿加上4ml n,n-二异丙基乙胺和2ml乙腈中与1.5摩尔过量的胆固醇氯甲酸酯组合。在环境温度下搅拌所述混合物过夜并且接着在旋转蒸发器上干燥。接着使所得到的灰白色沉淀物溶解于乙酸乙酯/己烷(3:1)中并用水萃取，干燥，接着再溶解于氯仿中。使用乙酸乙酯/己烷(3:1)作为流动相(紫杉醇的rf为0.4，tax-chol的rf为0.92)，通过薄层色谱法确认产物的形成。接着在硅胶柱上使用乙酸乙酯/己烷(3:1)作为流动相对产物进行进一步纯化，生成标题化合物(1)。通过质谱法和nmr分析确认结构。
[0275][0276]
实施例3.紫杉醇2
’‑
δ-生育三烯基碳酸酯(xtt或也称为xt3或化合物1)合成
[0277]
步骤1.δ-生育三烯酚的对硝基苯基酯碳酸的合成
[0278][0279]
在室温下，向δ-生育三烯酚(25mg，0.0629mmol)于无水二氯甲烷(1.5ml)中的溶液中添加氯甲酸4-硝基苯酯(51mg，0.25mmol)和三乙胺(35μl，0.25mmol)。在室温下搅拌反应混合物持续24h并且接着浓缩，接着使用制备型tlc，使用乙酸乙酯/庚烷(10:90)作为洗脱剂来获得所需产物(2)。获得呈黄色粉末状的所需产物(18mg)。1h nmr(cdcl3):δ8.30(d,2h),7.45(d,2h),6.80(dd,2h),5.05-5.20(m,3h),2.72-2.78(t,2h),2.18(s,4h),1.95
–
2.15(m,4h),1.72
–
1.85(m,4h),1.68(s,3h),1.55-1.62(br s,12h),1.30(br s,5h)。
[0280]
步骤2.紫杉醇的δ-生育三烯酚碳酸酯(3)的合成[bcmp5]
[0281][0282]
在室温下组合化合物(2)(18mg，步骤1产物)于二氯甲烷(2ml)中的溶液、紫杉醇(28mg)和dmap(10mg)。在室温下搅拌所述混合物持续24h。浓缩所述混合物并且通过使用乙酸乙酯/庚烷(50:50)作为洗脱剂使用制备型tlc进行纯化。获得呈无色固体状的所需产物(3)(17mg)。tlc分析(rf 0.25,ea/己烷:1:1)。1h nmr(cdcl3):δ8.20(d,2h),7.75(d,2h),7.60-7.62(m,1h),7.30-7.52(m,9h),6.90
–
6.95(d,1h),6.60
–
6.75(dd,2h),6.20
–
6.30(m,2h),6.00
–
6.05(m,1h),5.70-5.75(d,1h),5.50(s,1h),5.10
–
5.20(br s,2h),4.95
–
5.00(d,1h),4.30
–
4.35(br s,1h),4.20-4.30(dd,2h),3.75-3.80(d,1h),2.70
–
2.75(m,2h),2.30-2.60(m,7h),2.23-2.27(m,11h),1.50-2.20(m,26h),1.25(m,9h),1.15(s,3h)
[0283]
实施例4.肽两亲性脂质胶束(palm)制备
[0284]
在由80％叔丁醇(tba)和20％水构成的溶剂混合物中制备肽和磷脂的单独储备溶液，以获得10mm肽、20mm 1,2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱(dopc)或20mm 1-棕榈酰基-2-油酰基-磷脂酰胆碱(popc)和20mm卵sm的单独溶液。组合储备溶液的等分试样以获得含有10摩尔当量的肽、42摩尔当量的磷脂酰胆碱和18摩尔当量的sm的最终溶液。在1.5ml玻璃小瓶中组合所述溶液，冷冻(-70℃)，并在-5至-10℃下冻干过夜。通过添加杜氏(dulbecco’s)磷酸盐缓冲生理盐水，随后轻轻涡旋内容物来使所得冻干饼再水合。通过在50℃下孵育palm溶液持续10分钟来完成palm的形成。一些肽复合物在加热时仍然浑浊，并且还经历了一个冷冻至-80℃、随后解冻至室温的周期以试图获得澄清溶液。palm制剂的品质在其外观上显而易见。基于廷德尔效应，视觉上清晰的制剂指示任何已经形成的纳米粒子的直径小于约40nm。结果在表5中示出。
[0285]
表5
[0286][0287]
a 1-棕榈酰基-2-油酰基磷脂酰胆碱(popc)、1,2-二油酰基磷脂酰胆碱(dopc)、卵鞘磷脂(sm)、磷脂酰胆碱(pc)、磷脂(pl)、紫杉醇2
’‑
棕榈酸酯(c
16
ptx)
[0288]b肽与磷脂的摩尔比为1/4。
[0289]
实施例5.示例性palm制备
[0290]
通过标准fmoc固相肽合成来定制合成具有如seq id no:35所示的氨基酸序列以及乙酸盐抗衡离子的肽。如下制备palm组分的储备溶液。在叔丁醇(tba)/水/乙酸(80:20:7)中制备10mm肽溶液。在tba/水(80/20)中制备20毫摩尔popc和sm溶液。10mm xtt溶液在tba/水(95:5)中。
[0291]
通过混合10mm xtt(1mol当量)加上20mm popc(5.6mol当量)加上20mm sm(2.4mol当量)加上10mm seq id no:35(2mol当量)开始palm制备。通过在干冰/2-丙醇浴中涡旋来冷冻混合体积，并通过放置于-76℃冰箱中持续1小时进一步冷冻。在-15℃下冻干所述混合物持续24h，随后在15℃下再冻干20小时。将一定体积的无菌杜氏磷酸盐缓冲生理盐水添加至冻干物中以获得6.3mm xtt(5.4mg/ml ptx等效物)。使样品短暂涡旋以溶解滤饼并且接着放置于55℃水浴中持续30分钟，最后短暂(约10-20秒)保持于水浴声波仪的声波节点中。使样品通过25mm
×
0.2μm pes过滤器过滤杀菌，并组合。将无菌制剂分布至无热原的玻璃小瓶中，所述玻璃小瓶用带有卷边铝盖的丁基橡胶塞密封并存储于4℃下。
[0292]
实施例6.skov-3体外生长抑制
[0293]
将skov-3细胞在100μl含有10％胎牛血清的杜氏最低基础培养基中以5,000个细胞/孔接种于96孔组织培养板中，并在含有5％co2的37℃孵育箱中在潮湿气氛中孵育。24h后，用含有测试物品的完全培养基替换所述培养基。通过添加紫杉醇于dmso中的1mm储备溶液来制备完全培养基中最高浓度的紫杉醇(10μm)。将3mm xtt于palm中的储备palm制剂稀释至培养基中至50μm浓度。在完全培养基中对这些测试溶液进行连续稀释以获得较低浓度的测试溶液。使细胞与测试物品溶液一起孵育持续72h。接着将20μl在磷酸盐缓冲生理盐水中的5mg/ml噻唑蓝溴化四唑添加至所有孔中，接着4h孵育。用杜氏磷酸盐缓冲生理盐水(含钙/镁)洗涤所有孔并用100μl dmso再填充。在37℃下孵育板持续30分钟，接着用设置为590nm的酶标仪测定每个孔中的光密度。通过数据与逻辑方程的非线性回归拟合来确定导致50％生长抑制的浓度(ic50)。对照孔的平均光密度代表100％生长。
[0294]
实施例7.细胞因子产生
[0295]
将skov-3细胞在100μl含有10％胎牛血清的杜氏最低基础培养基中以10,000个细
胞/孔接种于96孔组织培养板中。24h后取出所述培养基。用杜氏磷酸盐缓冲生理盐水(含钙/镁)洗涤细胞层。用含有测试物品的无血清培养基再填充孔。测试组是：1)无添加，2)10μg/ml脂多糖，3)10μm紫杉醇(从dmso中的储备溶液中添加至培养基中)，和4)用seq id no:25肽制备的palm的10μm紫杉醇等效物(xtt)。孵育细胞持续24h。随后收集培养基并离心(1500rpm微量离心机)。回收上清液并冷冻用于细胞因子测试。用来自raybiotech life(peachtree corners,ga)的人il-6测定试剂盒测定培养基中的白细胞介素6(il-6)含量。
[0296]
实施例8.小鼠中的skov-3异种移植物
[0297]
机构动物护理和使用委员会(institutional animal care and use committee)批准所述方案。将三十只雌性nu(ncr)-foxn1nu裸小鼠(harlan laboratories)圈养于在22-25℃、40-60％湿度以及12小时光照和12小时黑暗下的辐照无菌ivc笼子中(每个笼子多达5只小鼠)。笼子装有辐照过的玉米芯垫料和无菌水。饮食是辐照杀菌的干燥、颗粒状食物。使小鼠适应7天。
[0298]
在37℃下，在空气中的5％co2气氛下，使skov-3(atcc)人卵巢肿瘤细胞在体外呈单层培养物形式维持于补充有10％胎牛血清的mccoy's-5a培养基中。将所述细胞常规地通过胰蛋白酶-edta处理(0.25％胰蛋白酶-edta)每周传代培养两次。收获在指数生长期的细胞，并在异种移植之前通过guava pca流式细胞术分析细胞计数和细胞活力(99％)。
[0299]
对三十只9-11周龄的小鼠在侧腹区域经皮下接种在0.1ml与matrigel(1:1)混合的1xpbs中的skov-3肿瘤细胞(1.0
×
106个)以供肿瘤发展。7天后发展出可测量的肿瘤(50-100mm3)。选择二十五只具有大约50-100mm3肿瘤(用电子卡尺测量)的动物用于研究，并使用如下随机化区组设计将其随机放置于第1-5组中。首先，基于实验动物的肿瘤体积将其分成5个均质区组。其次，在每个区组内，将实验动物随机化至不同的组。
[0300]
每天检查小鼠的发病率、死亡率以及肿瘤生长和治疗对正常行为的任何不良效应，诸如移动性、食物和水消耗的视觉估计、体重增加/减少、眼睛/毛发无光泽和任何其他异常效应。
[0301]
使用genie touch注射泵(kent scientific)执行测试溶液的尾静脉注射。使用terumo surshield安全翼式输液器(s25bls,25gx3/4)进入尾静脉。每个个别的测试物品使用一个新的注射器。所有工作均在生物安全柜中执行。
[0302]
在第7、11、15、19、23和27天执行给药。第0天是异种移植当天。所有小鼠均以8ml/kg给药。给药溶液组是生理盐水中的17％cremophor el/乙醇(1:1)(紫杉醇媒介物)(第1组)、cremaphor el/乙醇/生理盐水中的1.25mg/ml紫杉醇(第2组)、1mg/ml palm的紫杉醇等效物(xtt)(第3组)、2.5mg/ml palm的紫杉醇等效物(xtt)(第4组)和不含xtt的palm(是第4组的palm成分的量的1.25倍)(第5组)。palm是用seq id no:35肽制备的。
[0303]
在第7、12、17、22、27、32、37和42天使用电子卡尺测量二维肿瘤体积，并将使用下式以mm3表述所述体积：v＝0.5a
×
b2，其中a和b分别为肿瘤的长直径和短直径。
[0304]
实施例9.大鼠化学治疗剂诱发的周围神经病变(cipn)
[0305]
用生理盐水将医药级紫杉醇(ptx,teva pharmaceuticals)从cremaphore el和乙醇的1:1混合物中的6mg/ml储备溶液稀释至1mg/ml。注射1mg/kg的ptx，q2d
×
6。使用与ptx相同的给药方案，以1mg/kg ptx等效剂量和2.7mg/kg ptx等效剂量施用用seq id no:35肽制备并含有xtt的palm。在第2、4、6、8、10和12天，i.p.执行所有药物和媒介物注射。
[0306]
对照组和实验组中的雄性sprague-dawley大鼠接受相等体积的溶液。共计5组，每组的样品量为10只动物。a组接受与施用的给药溶液ptx等效的cremophor el/乙醇/生理盐水溶液，b组接受1mg/kg紫杉醇，c组接受磷酸盐缓冲生理盐水(palm媒介物)，d组接受palm中的1mg/kg ptx等效物xtt，e组接受palm中的2.7mg/kg ptx等效物xtt。
[0307]
在温度控制室中，以12:12(7am至7pm)光/暗周期成对圈养动物，其中每对动物属于同一组，以控制由于紫杉醇(和可能的测试化合物)在尿液和粪便中的排泄而引起的化合物暴露，随意取用水和食物。所有程序均经机构动物护理和使用委员会批准，并遵守国际疼痛研究协会研究和伦理问题委员会陈述的指南(zimmerman,1983)。
[0308]
为了测试周围神经病变的发作，检查动物在基线时的机械缩爪阈值(mpwt)的改变，接着在14天方案的持续时间中每隔一天进行检查(第1天(基线)、第3天、第5天、第7天、第9天、第11天、第13天)。对于这一测试，将动物放置于plexiglas室(20cm
×
10.5cm
×
40.5cm)内并使其习惯15min。将所述室置于网筛顶部，以便可对两只后爪的跖面施用机械刺激。使用上/下运动用八根校准的von frey单丝(3.85、5.68、9.74、18.39、39.42、77.30、135.30和251.34mn)获得每只后爪的机械阈值测量值。每次试验开始时将9.74mn的von frey力递送至右后爪持续约1秒，接着是左后爪。如果没有缩回反应，那么递送下一个较高的力。如果有反应，那么递送下一个较低的力。继续这一程序，直至在最高力(251.34mn)下没有反应或直至在初始反应之后施用四个刺激。使用下式计算每只爪的缩回阈值：[xth]log＝[vfr]log ky，其中[vfr]是最后一次使用的von frey力，k＝0.2593，它是von frey单丝之间的平均间隔(以log为单位)，并且y是取决于缩回反应模式的值。如果动物对最高von frey毛发没有反应，那么y＝1.00，并且那只爪的机械缩爪反应经计算为456.63mn。每段时间对三个试验执行mpwt测试，并且在三个试验中对缩回值求平均值以确定每只动物的平均机械缩爪阈值。
[0309]
实施例10.含有荧光染料dii的palm的制备
[0310]
使10mm肽的40μl等分试样与56μl 20mm popc、24μl 20mm sm(卵)和16μl 2.5mm dii在小玻璃瓶中组合。在80％tba/20％水中制备肽和脂质溶液。在92％tba/8％水中制备dii储备液。使组合的溶液冻干并通过添加0.2ml杜氏磷酸盐缓冲生理盐水使所得滤饼再水合。使所述溶液短暂涡旋，进行水浴声波处理(持续约15秒)并且放置于50℃加热块中持续20分钟。
[0311]
实施例11.含有米铂的palm的制备
[0312]
使80％tba/20％水中的10mm具有氨基酸序列seq id no:25的肽的50μl等分试样(对应于2.5摩尔当量的肽)与3摩尔当量的popc和7摩尔当量的卵sm(分别来自由相同溶剂混合物构成的40mm和20mm储备溶液)组合。向其中添加来自用100％tba制备的1mm储备溶液的0.75摩尔当量的米铂(medkoo biosciences,raleigh,nc)。使所述溶液冻干并通过添加0.4ml含5％葡萄糖的水使所得滤饼再水合。使所述溶液短暂涡旋，进行水浴声波处理(持续约15秒)并且放置于50℃加热块中持续20分钟。使所得澄清溶液通过0.2μm孔径的聚醚砜杀菌过滤膜并存储于4℃下。通过dls进行的粒径分析(实施例16)指示8nm的流体动力学平均直径。sec确认尺寸可与hdl相当的单一粒子群体。sec色谱图在图2(米铂(实线)、人hdl(虚线))中示出。
[0313]
实施例12.含有紫杉醇胆固醇碳酸酯(xc)的palm的制备
[0314]
使80％tba/20％水中的10mm肽seq id no:25的50μl等分试样(对应于2.5摩尔当量的肽)与7摩尔当量的popc和3摩尔当量的卵sm(来自由相同溶剂混合物构成的20mm储备溶液)组合。向其中添加来自92％tba/8％水中的10mm储备溶液的1摩尔当量的xc。使所述溶液冻干并用杜氏磷酸盐缓冲生理盐水使所得滤饼再水合至1mm的最终xc浓度。由dls测定的这一制剂的流体动力学平均直径为9nm(实施例16)。通过sec的进行尺寸分析指示单一粒子群体的直径主要为10nm(图3)。
[0315]
实施例13.含有紫杉醇δ-生育三烯基碳酸酯(xtt)的palm的制备
[0316]
使80％tba/20％水中的10mm肽seq id no:25的50μl等分试样(对应于2.5摩尔当量的肽)与7摩尔当量的popc和3摩尔当量的卵sm(来自由相同溶剂混合物构成的20mm储备溶液)组合。向其中添加来自92％tba/8％水中的10mm储备溶液的1摩尔当量的xtt。用0.4ml杜氏磷酸盐缓冲生理盐水使冻干饼再水合。
[0317]
实施例14.r4f不适用于含有紫杉醇δ-生育三烯基碳酸酯(xtt)的palm的制备
[0318]
如同实施例13用具有氨基酸序列seq id no:25的肽并且用肽r4f(表1)进行palm制备。与用肽seq id no:25制成的palm在室温和4℃下保持澄清溶液不同，含有肽r4f的palm在室温下是澄清溶液，但在4℃下变成浑浊凝胶。所述凝胶在升温至室温之后恢复为澄清液体。分析palm制剂的尺寸(实施例16)。动态光散射指示具有肽seq id no:25的palm具有8nm的平均流体动力学直径(体积强度)。对具有r4f的palm进行的相同分析显示，94％的粒子群体的平均流体动力学直径为11nm，剩余为32nm。sec确认具有肽seq id no:25的palm的均匀尺寸分布(图4)。相反，具有肽r4f的palm显示出在大于和小于seq id no:25palm尺寸的尺寸下洗脱的一系列峰。dls无法检测较小的粒子并不奇怪，因为对7nm以下的粒子的灵敏度非常低。这些结果指示r4f不是用于palm制备的合适肽。
[0319]
实施例15.将芬维a胺装载于用肽seq id no:25制备的palm中
[0320]
使80％tba/20％水中的10mm肽seq id no:25的35μl等分试样(对应于2.5摩尔当量的肽)与3摩尔当量的popc和7摩尔当量的卵sm(分别来自由相同溶剂混合物构成的40mm和20mm储备溶液)组合。还添加在相同溶剂混合物中的2摩尔当量的20mm芬维a胺。使所述溶液冻干并用0.325ml磷酸盐缓冲生理盐水使所得滤饼再水合。在50℃下，所述溶液在20min内变得澄清。通过sec分析(实施例16)指示所有组分在8nm-10nm直径范围内作为单峰洗脱出来(图5)。
[0321]
实施例16.palm尺寸的测定
[0322]
通过dls和sec测定palm制剂的尺寸和尺寸均匀性。通过dls用nicomp 370粒径分析仪测定基于流体动力学平均直径的尺寸。使用乳胶标准来校准所述分析仪。除非另有明确指示，否则本文中和权利要求书中所提及的粒径通过如上所述的dls来计算。
[0323]
还通过sec用连接至beckman/coulter 126型泵和128型二极管阵列检测器的ge superose 6increase柱(10
×
300mm)测定palm粒子的相对流体动力学尺寸。流动相(150mm nacl、6mm napo4(ph 7.4))流速为0.5ml/min。在215和280nm波长下监测洗脱液。通过蛋白质分子量标准的注射来确认系统性能(图3)。
[0324]
实施例17.bhk(sr-bi)细胞中palm的sr-bi选择性
[0325]
通过geneswitch
tm
系统(invitrogen)用稳定转染有诱导型人sr-bi基因的bhk(sr-bi)细胞进行sr-bi相互作用研究(vickers等人(2011)nat.cell biol.13:423-433)。将所
述细胞接种(96孔板)(8000个细胞/孔)于含有200ug/ml的博来霉素和潮霉素中的每一者的生长培养基(含有10％胎牛血清的杜氏改良伊格尔培养基)中。在24小时孵育之后，去除所述生长培养基并用杜氏改良伊格尔培养基中的0.2％牛血清白蛋白替换。针对sr-bi表达而诱导的细胞的培养基还含有10nm米非司酮(从dmso储备溶液中添加)。将单独dmso添加至未诱导细胞的培养基中。24小时之后去除诱导培养基，并用含有dii标记的palm(32μg肽/ml)或dii标记的hdl(19μg蛋白质/ml)(kalen biomedical,montgomery village,md)的培养基替换。通过在杜氏改良伊格尔培养基中的0.2％牛血清白蛋白中稀释dii标记的palm(实施例10)或dii标记的hdl的等分试样来制备测试培养基。使所述溶液在使用之前通过0.2μm孔径的聚醚砜杀菌过滤膜。将所述细胞孵育持续4小时。接着，用杜氏磷酸盐缓冲生理盐水(含钙和镁)中的0.1％白蛋白洗涤细胞3次。最后一次的洗涤液用200ul/孔的叔丁醇/水(95％/5％)替换。使覆盖的板在室温(20-21℃)下静置30min，偶尔振荡。在molecular dynamics gemini荧光酶标仪上用550nm截止滤光片在520nm激发和580nm发射下检测每个孔中的荧光(图9)。
[0326]
表6
[0327]
bhk(sr-bi)细胞从hdl和用多种肽制备的palm中的dii摄取取决于sr-bi表达
[0328][0329]a相对于蛋白质(hdl)或肽(palm)浓度，由细胞吸收的dii的量。示出平均值(n＝4)和平均值的标准误差。
[0330]
b hdl dii含量为21pmol/ug蛋白质。palm dii含量为40pmol/ug肽。hdl浓度为19μg/ml。palm肽浓度为32μg/ml。
[0331]
实施例18.紫杉醇的定量
[0332]
通过使1体积的水性样品与4体积的乙酸乙酯/丙酮/甲醇(70/30/5v/v)混合，从水性样品中提取紫杉醇、xtt和xc。收集在振荡和离心之后获得的上层有机层，通过溶剂蒸发和真空进行干燥，并且再溶解于hplc流动相(甲醇/水(65/35v/v))中。于hplc上将复原样品的20μl等分试样以1.2ml/分钟的流速注射通过macherey-nagel柱(4
×
250mm，具有nucleosil 10-5c18)，并且用uv检测器在230nm波长下进行检测。
[0333]
实施例19.含有米铂的palm抑制pc-3细胞生长以及顺铂
[0334]
将pc-3细胞(美国典型培养物保藏中心，crl-1435)以每孔(100μl)5
×
103个细胞
的密度接种于96孔板中并且在由补充有10％胎牛血清的f-12k培养基构成的生长培养基中生长直至大约70％汇合(24小时)。接着，将生长培养基由100μl新鲜生长培养基(对照)或由补充有多种浓度的顺铂(例如，在培养基中0μm和0.1至100μm最终浓度)或者补充有等量的如实施例11中所制备的在palm中的米铂的生长培养基替换，所述顺铂由在5％葡萄糖中制备的100倍浓缩储备溶液添加。一式三份测试每种条件。将板孵育持续48小时。通过在杜氏磷酸盐缓冲生理盐水(含钙和镁)中添加20μl 5mg/ml mtt并且孵育持续3小时，用噻唑蓝溴化四唑(mtt)测定来测定细胞活力。接着，小心地取出培养基并用200μl二甲亚砜(dmso)替换。在轨道振荡器上轻轻地搅拌所述板持续15分钟。在570nm下读取每个孔的吸光度。通过数据与逻辑方程的非线性回归拟合来确定导致50％生长抑制的浓度(ic
50
)。对照孔的平均吸光度代表100％生长(图6)。
[0335]
实施例20.sr-bi抗体减弱含有米铂的palm对pc-3细胞生长的抑制作用
[0336]
使pc-3细胞如同实施例19中生长。在含有1/400稀释度的储备抗体溶液的生长培养基中预孵育欲在sr-bi抗体(novus biologics,nb400-113)存在下测试的细胞持续1h。接着，去除所有培养基并用含有所指示的量的如同实施例13中制备的铂化合物的生长培养基替换。用于抗体处理的细胞的具有palm(mp)的生长培养基含有在1/400稀释度的储备抗体溶液中的抗体。孵育所述细胞持续5h。接着，去除所有培养基；用培养基洗涤细胞一次并且接着在生长培养基中再孵育43小时。如同实施例19中，通过mtt测定来确定细胞存活(图7)。
[0337]
实施例21.palm中的xtt在阻断skov-3细胞生长xc方面比palm中的xc更具活性
[0338]
将skov-3卵巢癌细胞(美国典型培养物保藏中心，htb-77)以每孔(100μl)5x103个细胞的密度接种于96孔板中并且在由补充有10％胎牛血清的mccoy氏培养基构成的生长培养基中生长直至大约70％汇合(24小时)。接着，生长培养基由100μl新鲜生长培养基(对照)或由补充有多种浓度的紫杉醇、palm(xc)或palm(xtt)的生长培养基替换。通过将紫杉醇在dmso中的5mm储备溶液稀释至生长培养基中，接着进行过滤杀菌(0.2μm过滤器)来制备20μm紫杉醇的测试溶液。在生长培养基中将所述20μm溶液的一个等分试样稀释5倍，获得4μm紫杉醇。用4μm继续5倍稀释过程以获得800nm紫杉醇溶液。继续这一过程，直至已经获得在生长培养基中的0.051nm浓度的紫杉醇。将由此获得的9种溶液中的每一种的四个100μl等分试样应用于含有细胞的独立孔中。使用相似但经过修改的过程来制备palm(xc)和palm(xtt)测试溶液。所测试的最高浓度为50μm，它是通过将palm(xc)和palm(xtt)的1mm制剂稀释于生长培养基中，接着进行过滤杀菌来制备。在每个重复8次的最新稀释的5倍稀释过程中获得的最低浓度为0.13nm。使细胞与测试溶液一起孵育持续72小时。在这一阶段结束时，如同实施例19中，通过mtt测定来确定细胞活力。(图8)。
[0339]
实施例22.palm(xtt)对bhk(sr-bi)细胞生长的抑制作用是sr-bi依赖性的
[0340]
用生长培养基(含有10％胎牛血清和200ug/ml的博来霉素和潮霉素中的每一者的杜氏改良伊格尔培养基)将bhk(sr-bi)细胞接种(3000个细胞/孔)于96孔板中并且孵育24小时。将生长培养基用含有0.2％牛血清白蛋白的杜氏改良伊格尔培养基替换，所述培养基含有从dmso储备溶液中添加的10nm米非司酮(诱导)或者等量的单独dmso(对照)。孵育细胞持续24小时。接着，将培养基用含有0.2％牛血清白蛋白的杜氏改良伊格尔培养基中在所指示的浓度下的ptx或palm(xtt)替换，并且孵育细胞持续12小时。接着由正常生长培养基替换那些培养基并且将细胞再孵育持续36h。通过mtt测定来确定相对于没有测试剂的细胞的
细胞生长百分比(图10)。
[0341]
实施例23.δ-生育三烯基(n4)-吉西他滨氨基甲酸酯
[0342]
根据guo和gallo的程序(j.org.chem.1999,64,8319)，通过用二碳酸二叔丁酯转化为叔丁氧羰基(boc)酯来保护吉西他滨中的羟基，得到(1)
[0343][0344]
将化合物4溶解于无水二氯甲烷中至0.2m化合物(4)的最终浓度。对于溶液中的每摩尔化合物(4)，在室温下组合二氯甲烷中在0.5m浓度下的1.2摩尔当量的化合物(2)和3摩尔当量的dmap。在室温下搅拌所述混合物持续24h。如所提及，用三氟乙酸使所得产物脱保护。通过快速柱色谱法使用二氯甲烷和甲醇洗脱液获得纯化合物，其中由100％二氯甲烷开始并且逐渐增加浓度至10％甲醇，以生成标题化合物(5)。
[0345][0346]
实施例24.与实施例24类似地执行具有α、β或γ-生育三烯酚异构体的(n4)-吉西他滨氨基甲酸酯的合成。
[0347]
实施例25.胆固醇(n4)-吉西他滨氨基甲酸酯
[0348]
以如实施例25中所述的相同方式执行胆固醇(n4)-吉西他滨氨基甲酸酯(6)的合成，例外在于使化合物(4)与胆固醇氯甲酸酯(市售)反应并且如同实施例19中脱保护以生成标题化合物(6)。
[0349][0350]
实施例26.紫杉醇经由琥珀酸和二甘醇酸与脂肪醇连接
[0351]
通过在室温下使脂肪醇与4-(二甲基氨基)吡啶和琥珀酸酐或二乙醇酸酐在无水吡啶中反应并且持续搅拌24h来实现经由琥珀酸酯或二乙醇酸二酯键与脂肪醇连接的紫杉醇的合成。用二氯甲烷中的0.1n hcl淬灭所述反应。通过制备型tlc或快速柱色谱法用含有乙酸乙酯的石油醚获得产物。使醇-琥珀酸或-二甘醇酸缀合物在无水二氯甲烷中与4-(二甲基氨基)吡啶和n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺组合。将紫杉醇添加至反应混合物中。24h后，用水淬灭所述反应并且用二氯甲烷萃取。通过制备型tlc使用乙酸乙酯/庚烷(50:50)作为洗脱剂来获得产物。
[0352]
实施例27.sr-bi抗体对skov-3细胞中的palm(xtt)细胞毒性的影响
[0353]
如同实施例16中，接种skov-3并且孵育持续24小时。接着，将生长培养基用含有0.5％白蛋白和所指示的浓度的测试剂的无血清培养基替换，所述培养基具有或不具有抗
srbi(1/250稀释度)(nb400-113,novus biologicals)。孵育所述细胞12h。接着，将细胞用含有0.5％白蛋白的无血清培养基洗涤并在生长培养基中再生长60小时。通过mtt测定来检测细胞生长(图11)。
[0354]
尽管描述了本公开的多个实施方案，但显然可以改变基础实施例以提供使用或涵盖本发明的方法和过程的其他实施方案。所述实施方案和实施例是出于说明性目的并且不应被解释为限制本公开，而是所附权利要求书限定了本发明的范围。