一种三联卵黄抗体制剂及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医药生物技术领域，具体涉及一种三联卵黄抗体制剂及其制备方法和应用。


背景技术：

2.传染性法氏囊病(infectious bursal disease，ibd)是一种以侵害雏鸡淋巴组织，特别是中枢免疫器官——法氏囊为主要特征的免疫抑制性传染病。该病的病原为传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，ibdv)，有2个血清型，引起鸡发病的是血清i型。分离到的鸡源病毒主要分为经典株(classic ibdv，c ibdv)、变异株(variant ibdv，var ibdv)和超强毒株(very virulent ibdv，vv ibdv)。其中，超强毒株致病力最强，常引起鸡只的死亡，并且在我国影响范围广，经济危害大。随着相关疫苗的普及和饲养管理水平的提高，由vv ibdv引起的ibd得到有效控制。然而，2017年以来，该病出现了新的情况，患病鸡无明显临床症状，但鸡群生产性能降低，生长整齐度差，剖检只有法氏囊潮红、干酪样物质渗出等轻微出血病变及法氏囊萎缩。病原基因序列分析显示，近期的ibdv都属于变异株，而不是超强毒株。与早期的变异株相比，近期的毒株具有独特的分子特征，被称为ibdv新型变异株。这些ibdv新型变异株阳性的鸡群通常都免疫过针对vv ibdv的疫苗。进一步的研究发现，ibdv新型变异株能够在一定程度上逃匿疫苗的免疫保护，进而产生严重的免疫抑制，显著干扰其他疫苗的免疫效果。同时，禽流感病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉炎病毒、大肠杆菌等病原微生物的感染可以协同ibdv新型变异株的致病力增强，使鸡群伤亡显著增加。流调显示，临床上以禽流感h9亚型和传染性支气管炎的混合感染最为常见。目前，ibdv新型变异株的流行范围正在进一步扩大，已经成为干扰我国养禽业健康发展的新威胁。
3.禽流感h9亚型是目前我国鸡群中存在的禽流感(avian influenza，ai)主要亚型，其病原属于低致病性禽流感病毒(lpaiv)。该病发病后虽然致死率不高，一般不超过30％，但与其他病原混合感染能够后会提高其致病力，常导致呼吸道症状，蛋鸡的产蛋严重下降和死亡率显著提高，影响家禽的生产性能。2015年以来，h9亚型禽流感出现了新的特点，病原的致病力增强，表现在感染后死亡率增加，支气管栓塞明显，肾脏、肠道等肺外脏器出现病变；抗原性变异，表现在多次疫苗免疫、抗体水平很高的鸡群仍可感染，并出现一定症状和死亡；继发感染和混合感染严重，给该病的防控增加了难度。
4.鸡传染性支气管炎(avian infectious bronchitis，ib)是国际兽疫局(oie)及我国规定的家禽b/二类传染病之一。该病是由传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，ibv)引起的一种急性、高度传染性并具有重大经济意义的病毒病，以呼吸道症状、产蛋鸡产蛋下降30-50％、蛋品质下降、肾脏病变及胃肠道病变为主要特征。该病发生于所有养禽国家，根据病毒对组织的亲嗜性、损害的主要器官和引起的临床症状等确定的临床分型有：呼吸型、生殖道型、肾型、肠型、腺胃型和变异型等。血清型分析表明，ibv有30多个血清型，不同血清型之间没有或仅有很低的交叉保护效果，而且ibv基因组易变异，使得变异
株不断出现和流行，因而经常造成鸡群免疫失败。流调显示，当前我国流行的ib病原以qx亚型为主。
5.为解决这3种病毒性疾病的单独和混合感染问题，急需一种新的防控手段。目前，主要的防治方法包括疫苗、抗生素、中药及其制剂、抗体制剂。现有疫苗的疫苗株大多与流行毒株不对应，无法产生足够的保护；抗生素对病毒性疾病效果不佳，只能用于细菌性疾病的混合感染；中药及其制剂药效慢、作用弱、用量大、质量难以稳定；现有的抗体制剂大多只针对一种病原，主要是制备单一抗原的抗体技术路线简单，容易做到高效价水平；而临床多为混合感染，并且给药途径单一，大大增加了其使用的局限性。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种三联卵黄抗体制剂及其制备方法和应用。本发明的药物制剂利用分离到的鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒3种病毒的流行株制备成一种多联、给药途径多样的卵黄抗体制剂，用于预防和治疗鸡传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒的单独或混合感染。该制剂具有高效价水平，针对当前的流行毒株，可应对3种病毒的任一单独或混合感染，除注射给药外，还可通过口服及喷雾给药，方便临床应用。
7.为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
8.本发明的目的之一是提供一种三联卵黄抗体制剂，所述三联卵黄抗体制剂包括三联卵黄抗体和稳定剂，
9.所述稳定剂和三联卵黄抗体的质量体积比值为3-10％；
10.所述三联卵黄抗体由鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性法氏囊禽流感病毒三联抗原制备的卵黄抗体。
11.优选地，
12.所述三联卵黄抗体制剂中，鸡传染性法氏囊病抗体琼扩效价达到1:32以上，优选达到1:64以上，鸡传染性支气管炎抗体和鸡禽流感h9抗体的血凝抑制效价均达到8log2以上，优选达到9log2以上。
13.优选地，
14.所述稳定剂为海藻糖和泊洛沙姆188；
15.所述海藻糖与泊洛沙姆188的质量比为1：1-2。
16.在本发明中泊洛沙姆188无毒、无抗原性、无刺激性、无致敏性、不溶血，物理性质温和、化学性质稳定，可以形成胶束，增加难溶性药物的溶解度，增加药物的稳定性，控制药物的释放速度，并且还具有约束外排泵的外排作用，促进机体对药物的吸收。泊洛沙姆188能使肠道蠕动变慢，药物在胃肠道滞留的时间增长，吸收增加，从而提高口服制剂的生物利用度。泊洛沙姆188能稳定细胞膜，与黏膜相容性佳，增加黏膜通透性，可以促进黏膜表面药物的吸收，作为基质使用还可起到缓释与延效的作用。
17.在本发明中，海藻糖是一种安全、可靠的天然糖类。它由两个葡萄糖分子以1,1-糖苷键构成，是非还原性糖，有3种异构体，即海藻糖、异海藻糖和新海藻糖。海藻糖有多种作用和功效，并且应用广泛，在科学界素有“生命之糖”的美誉。在医药领域中，由于海藻糖对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，使得海藻糖可以作为蛋白质药物、酶、疫苗和其
他生物制品的优良活性保护剂，并成功替代血浆蛋白作为血液制品、淋巴细胞、细胞组织、抗体、抗原及病毒等生物活性物质的稳定剂。其作用机理是，海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征。
18.优选地，
19.鸡传染性法氏囊病抗体为对鸡传染性法氏囊病ibdv fj76株病毒免疫产生的抗体。
20.优选地，
21.鸡传染性支气管炎抗体为对qx型ibv sd株病毒免疫产生的抗体。
22.优选地，
23.鸡禽流感抗体为对鸡禽流感h9病毒免疫产生的抗体，优选为禽流感h9-aiv sz株病毒免疫产生的抗体。
24.本发明的目的之二是提供本发明的目的之一所述的三联卵黄抗体制剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
25.(1)抗原的制备
26.将鸡法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒分别利用spf(specific pathogen free，无特定病原体)鸡胚扩增培养，然后将培养得到的3种病毒分别浓缩，浓缩后等体积混合，经灭活，最终得到含有3种灭活病毒的三联病毒液，即抗原；
27.在本发明中的鸡法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒可以标准毒株，也可以自行采集现有已知病毒，并采集后鉴定其类型。
28.(2)抗体的制备
29.用所述的三联病毒液免疫产蛋鸡后，获得高免鸡蛋，将所述高免鸡蛋分离卵黄加水均质，形成均质溶液，经过酸化、萃取、超滤浓缩后得到三联卵黄抗体；
30.(3)卵黄抗体制剂的制备
31.在所述的三联卵黄抗体中，加入稳定剂，混合均匀，过滤除菌，得到三联卵黄抗体制剂。
32.优选地，
33.步骤(1)中,
34.三联病毒液中，每种病毒的毒价均在1
×
10
7.0
eid
50
/0.1ml以上；
35.灭活采用甲醛灭活。
36.优选地，步骤(2)中,
37.加入卵黄质量6.5～8.5倍的纯化水；
38.酸化采用盐酸调节均质液的ph至5.5
±
0.3；
39.萃取采用辛酸萃取。
40.本发明的目的之三是提供本发明的目的之一所述的三联卵黄抗体制剂在治疗或预防鸡传染性法氏囊病、传染性支气管炎或禽流感中至少一种疾病中的应用。
41.相对于现有技术，本发明所述的一种抗鸡传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒三联卵黄抗体制剂的制备方法具有以下优势：
42.(1)本发明所述的一种抗鸡传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病
毒三联卵黄抗体制剂及其制备方法，所获得的卵黄抗体制剂具有质量稳定、安全性好、针对性强、保护率高、适用范围广、无不良反应、不需休药期的特点，同时避免了动物高免血清在治疗过程中引起的副作用。制剂的制备方法具有制备简单快捷、生产成本低、生产过程安全方便、不污染环境的特点。
43.(2)本发明所述的一种抗鸡传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒三联卵黄抗体制剂及其制备方法，所获得的卵黄抗体制剂给药途径多样，既可传统的通过肌肉和皮下注射给药，也可通过口服给药，甚至雾化喷雾给药，更便于使用，和与其他药物的联合使用。
44.(3)本发明所述的一种抗鸡传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒三联卵黄抗体制剂及其制备方法，所获得的卵黄抗体制剂中添加了泊洛沙姆188(poloxer 188)，泊洛沙姆188是聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯(peo-ppo-peo)三嵌段共聚物，其中聚氧乙烯占80％。泊洛沙姆188易溶于水，是一种非离子型表面活性剂，能通过其亲脂性中心嵌段与细胞膜亲脂部分相结合，成为一种有效的膜跨越物质。
具体实施方式
45.实施例1
46.一种三联卵黄抗体制剂的制备方法，该方法包括如下步骤：
47.a、抗原的制备
48.将鸡传染性法氏囊病病毒为ibdv fj76株，所述的传染性支气管炎病病毒为qx型ibv sd株；所述的禽流感h9病毒为h9-aiv sz株。所述毒株均为采集的流行株分别用spf鸡胚进行扩增培养，然后将培养得到的3种病毒分别浓缩，浓缩后等体积混合，其中每种病毒的毒价均在1
×
10
7.0
eid
50
/0.1ml以上，(eid
50
(半数感染量))，甲醛灭活，最终得到含有3种灭活病毒的三联病毒液；
49.b、抗体的制备
50.用步骤a中制得的三联病毒液免疫产蛋鸡，免疫程序为：肌肉注射病毒液2ml/只，10天后肌肉注射病毒液3ml/只，14天后肌肉注射病毒液4ml/只。7天后开始对鸡蛋取样，检测鸡传染性法氏囊病、鸡传染性支气管炎、鸡禽流感h9的抗体效价。当鸡传染性法氏囊病抗体琼扩效价达到1:128以上，鸡传染性支气管炎抗体和鸡禽流感抗体的hi效价均达到10log2以上时，收集鸡蛋，分离卵黄；然后加入其质量7倍的纯化水，搅拌使卵黄充分分散于水中，形成均质溶液，用0.5mol/l的稀盐酸调节ph值到5.5，然后使用高速离心机离心获取上清液，上清液加入0.2％(v/v)的辛酸搅拌溶解均匀，低温静置2小时，再使用离心机7000rpm离心30分钟，弃沉淀；然后将清液经10kd的中空纤维超滤柱超滤浓缩，视抗体水平浓缩2-3倍；即为制备的卵黄抗体。
51.c、卵黄抗体制剂的制备
52.在步骤b所制得的三联卵黄抗体制剂中，按照稳定剂和三联卵黄抗体的质量体积比值为5％加入海藻糖和泊洛沙姆188的混合物，其中海藻糖与泊洛沙姆188的质量比为1：1.5；混合均匀，然后依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜进行除菌过滤，得到三联卵黄抗体制剂。
53.经上述方法制备的三联卵黄抗体制剂包括三联卵黄抗体和稳定剂，所述稳定剂和
三联卵黄抗体的质量体积比值为5％；所述三联卵黄抗体由鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性法氏囊禽流感病毒三联抗原制备的卵黄抗体；所述三联卵黄抗体制剂中，鸡传染性法氏囊病抗体琼扩效价达到1:32上，鸡传染性支气管炎抗体和鸡禽流感h9抗体的血凝抑制(hi)效价均达到8log2以上。所述的卵黄抗体制剂可用于皮下注射、肌肉注射、口服。
54.将实施例1中得到的抗鸡传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒三联卵黄抗体制剂进行如下试验：
55.试验1、对传染性法氏囊病病毒攻毒保护试验
56.取28日龄spf鸡60只，随机分成6组，每组10只，分别隔离饲养，具体操作如下：
57.第1组：空白对照组，每只鸡肌肉注射1ml灭菌生理盐水。
58.第2组：空白对照组，每只鸡肌肉注射1ml灭菌生理盐水。
59.第3组：预防组，注射给药，每只鸡肌肉注射1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
60.第4组：预防组，口服给药，每只鸡灌胃1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
61.第5组：早期治疗组，注射给药，每只鸡肌肉注射1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
62.第6组：早期治疗组，口服给药，每只鸡灌胃1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
63.第1、3、4组鸡给药；24小时后，各组鸡滴鼻、点眼(1:1)ibdv fj76株第5代强毒(含104eid
50
/0.1ml)，0.1ml/只；24小时后，第2、5、6组鸡给药，饲养观察14天。统计各组鸡发病数、死亡数及转归数，并计算预防组的保护率和治疗组的治愈率，如表1。
64.表1对传染性法氏囊病病毒的攻毒保护试验结果
[0065][0066]
注：
“‑”
表示不统计。
[0067]
结果表明：本发明的三联卵黄抗体制剂通过注射给药和口服给药均能对ibdv的预防和早期治疗发挥显著作用。在预防试验中，供试品对鸡只的保护率在90％以上，空白对照组的发病率为100％，死亡率为10％；在早期治疗试验中，应用供试品后，鸡只的治愈率为89％以上，空白对照组的发病率为100％，死亡率为10％。注射和口服给药均能有效预防及治疗ibdv的发病，相较而言，注射给药的效果更好。
[0068]
试验2、传染性支气管炎病毒攻毒保护试验
[0069]
取14日龄spf鸡60只，随机分成6组，每组10只，分别隔离饲养，具体操作如下：
[0070]
第1组：空白对照组，每只鸡肌肉注射1ml灭菌生理盐水。
[0071]
第2组：空白对照组，每只鸡肌肉注射1ml灭菌生理盐水。
[0072]
第3组：预防组，注射给药，每只鸡肌肉注射1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
[0073]
第4组：预防组，口服给药，每只鸡灌胃1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
[0074]
第5组：早期治疗组，注射给药，每只鸡肌肉注射1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
[0075]
第6组：早期治疗组，口服给药，每只鸡灌胃1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
[0076]
第1、3、4组鸡给药；24小时后，各组鸡滴鼻、点眼(1:1)ibv sd株第5代强毒(含100eld
50
/0.1ml)，0.1ml/只；24小时后，第2、5、6组鸡给药，饲养观察14天。统计各组鸡发病数、死亡数及转归数，并计算预防组的保护率和治疗组的治愈率，如表2。
[0077]
表2对传染性支气管炎病毒的攻毒保护试验结果
[0078][0079]
注：
“‑”
表示不统计。
[0080]
结果表明：本发明的三联卵黄抗体制剂通过注射给药和口服给药均能对ibv的预防和早期治疗发挥显著作用。在预防试验中，供试品对鸡只的保护率在80-90％，空白对照组的发病率为100％，死亡率为80％；在早期治疗试验中，应用供试品后，鸡只的治愈率为60-80％，空白对照组的发病率为100％，死亡率为90％。注射和口服给药均能有效预防及治疗ibv的发病，相较而言，注射给药的效果更好。
[0081]
试验3、禽流感h9病毒攻毒保护试验
[0082]
取14日龄spf鸡60只，随机分成6组，每组10只，分别隔离饲养，具体操作如下：
[0083]
第1组：空白对照组，每只鸡肌肉注射1ml灭菌生理盐水。
[0084]
第2组：空白对照组，每只鸡肌肉注射1ml灭菌生理盐水。
[0085]
第3组：预防组，注射给药，每只鸡肌肉注射1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
[0086]
第4组：预防组，口服给药，每只鸡灌胃1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
[0087]
第5组：早期治疗组，注射给药，每只鸡肌肉注射1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
[0088]
第6组：早期治疗组，口服给药，每只鸡灌胃1ml实施例1制备的卵黄抗体制剂。
[0089]
第1、3、4组鸡给药；24小时后，各组鸡肌肉注射h9 sz株第5代强毒(含104eid
50
/0.1ml)，0.5ml/只；再过24小时后，第2、5、6组鸡给药，饲养观察14天。统计各组鸡发病数、死亡数及转归数，并计算预防组的保护率和治疗组的治愈率，如表3。
[0090]
表3对禽流感h9病毒的攻毒保护试验结果
[0091][0092]
注：
“‑”
表示不统计。
[0093]
结果表明：本发明的三联卵黄抗体制剂通过注射给药和口服给药均能对h9的预防和早期治疗发挥显著作用。在预防试验中，供试品对鸡只的保护率在100％，空白对照组的发病率为100％，死亡率为0；在早期治疗试验中，应用供试品后，鸡只的治愈率为100％，空白对照组的发病率为100％，死亡率为0。注射和口服给药均能有效预防及治疗h9的发病。
[0094]
试验4、对传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒混合感染的攻毒保护试验
[0095]
取28日龄spf鸡60只，随机分成6组，每组10只，分别隔离饲养，具体操作如下：
[0096]
第1组：空白对照组，每只鸡滴、鼻点0.1ml灭菌生理盐水，同时眼肌肉注射0.5ml灭菌生理盐水。
[0097]
第2组：攻毒对照组。
[0098]
第3组：早期治疗组，用单一的传染性法氏囊病病毒抗体(琼扩效价1:32)进行治疗，每只鸡肌肉注射1ml。
[0099]
第4组：早期治疗组，用单一的传染性支气管炎病毒抗体(血凝抑制(hi)效价8log2)进行治疗，每只鸡肌肉注射1ml。
[0100]
第5组：早期治疗组，用单一的禽流感h9病毒抗体(血凝抑制(hi)效价8log2)进行治疗，每只鸡肌肉注射1ml。
[0101]
第6组：早期治疗组，用实施例1制备的卵黄抗体制剂进行治疗，每只鸡肌肉注射1ml。
[0102]
第2-6组鸡进行攻毒，各组鸡滴鼻、点眼(1:1)ibdv fj76株第5代强毒(含104eid
50
/0.1ml)和ibv sd株第5代强毒(含100eld
50
/0.1ml)，0.1ml/只，同时肌肉注射h9 sz株第5代强毒(含104eid
50
/0.1ml)，0.5ml/只。24小时后，第1、2组给予安慰剂(灭菌生理盐水)，每只鸡肌肉注射1ml；第3-6组鸡给药，每只鸡肌肉注射1ml相应的卵黄抗体制剂，饲养观察14天。统计各组鸡发病数、死亡数及转归数，并计算发病率和治愈率，如表4。
[0103]
表4对传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒混合感染的攻毒
保护试验结果
[0104][0105][0106]
注：
“‑”
表示不统计。
[0107]
结果表明：本发明的三联卵黄抗体制剂通过注射给药能对传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒混合感染的早期治疗发挥显著作用。在试验中，应用供试品后，鸡只的治愈率为100％；而应用单一的传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒抗体，鸡只的治愈率分别为20％、40％和10％，显著低于应用三联抗体的治愈率。攻毒对照组的发病率和死亡率均为100％，空白对照组的发病率为0。注射给药均能有效治疗传染性法氏囊病病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒混合感染的发病。
[0108]
试验5、不同稳定剂对抗体制剂稳定性的影响
[0109]
按实施例1的方法制备样品。步骤b所制得的三联卵黄抗体制剂为样品1(即未加稳定剂的样品)。在步骤b所制得的三联卵黄抗体制剂中，按照稳定剂和三联卵黄抗体的质量体积比值为2％加入海藻糖，然后依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜进行除菌过滤，得到的三联卵黄抗体制剂为样品2(即仅加海藻糖的样品)。实施例1中得到的抗鸡传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒三联卵黄抗体制剂为样品3(即加海藻糖和泊洛沙姆188的样品)。
[0110]
3个样品各取12份在40℃下储存6个月。第0、1、2、3、4、6、8、10、12、16、20、24周各取1份样品检测效价的变化，具体结果如表5所示。
[0111]
表5稳定性试验结果
[0112][0113][0114]
结果表明：本发明的三联卵黄抗体制剂中添加的稳定剂可显著延长制剂的稳定性。在试验中，样品1在2个月内可保持效价不变，3个月开始下降，5个月下降至1/2，6个月下降至1/4；而样品2和样品3在4个月内可保持效价不变，5个月开始下降，6个月下降至1/2，效价稳定性显著高于样品1。
[0115]
试验6、不同稳定剂对抗体制剂疗效的影响
[0116]
按实施例1的方法制备样品。步骤b所制得的三联卵黄抗体制剂为样品1。在步骤b所制得的三联卵黄抗体制剂中，按照稳定剂和三联卵黄抗体的质量体积比值为2％加入海藻糖，然后依次用0.45μm和0.22μm的微孔滤膜进行除菌过滤，得到的三联卵黄抗体制剂为样品2。实施例1中得到的抗鸡传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感h9病毒三联
卵黄抗体制剂为样品3。
[0117]
取14日龄spf鸡50只，随机分成5组，每组10只，分别隔离饲养，具体操作如下：
[0118]
第1组：空白对照组，每只鸡鸡灌胃1ml灭菌生理盐水。
[0119]
第2组：攻毒对照组，每只鸡滴、鼻点0.1ml灭菌生理盐水，同时眼肌肉注射0.5ml灭菌生理盐水。
[0120]
第3组：口服预防组，每只鸡灌胃1ml样品1。
[0121]
第4组：口服预防组，每只鸡灌胃1ml样品2。
[0122]
第5组：口服预防组，每只鸡灌胃1ml样品3。
[0123]
第1、2组给予安慰剂(灭菌生理盐水)，每只鸡灌胃1ml；第3-5组鸡给药，每只鸡灌胃1ml相应的卵黄抗体制剂。24小时后，第2-5组鸡进行攻毒，各组鸡滴鼻、点眼(1:1)ibdv fj76株第5代强毒(含104eid
50
/0.1ml)和ibv sd株第5代强毒(含100eld
50
/0.1ml)，0.1ml/只，同时肌肉注射h9 sz株第5代强毒(含104eid
50
/0.1ml)，0.5ml/只，饲养观察14天。统计各组鸡发病数、死亡数，并计算发病率和保护率，如表6。
[0124]
表6不同稳定剂对抗体制剂疗效的影响
[0125]
组别发病数死亡数发病率(％)保护率(％)第1组000-第2组1010100-第3组737030第4组636040第5组000100
[0126]
注：
“‑”
表示不统计。
[0127]
结果表明：添加不同的稳定剂后，本发明的三联卵黄抗体制剂的口服给药疗效有明显的不同。在试验中，样品1对鸡只的保护率只有30％，样品2对鸡只的保护率40％，样品3对鸡只的保护率可达到100％。攻毒对照组的发病率为100％，空白对照组发病率为0。样品3中添加的泊洛沙姆188能有效保护抗体蛋白，使其在消化道中不被分解，从而达到预防疾病的作用。
[0128]
与现有的单一抗体制剂相比，本发明的三联卵黄抗体制剂对混合感染治疗效果更好，而且本发明的三联卵黄抗体制剂可以口服，使用方便；而现有通常蛋白类药物不会通过口服给药，因为会在通过消化道时被破坏掉，能入血的很少，疗效就很低甚至没有。
[0129]
上述参照具体实施方式对本发明进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。