一种利用解脂耶氏酵母制备赤阿糖液的方法

1.本发明属于发酵工程领域，具体涉及一种利用解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)制备d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液的方法。


背景技术：

2.阿洛酮糖，也称为d-阿洛酮糖(d-allulose)是一种六碳酮糖，分子量为180.16，熔点为96℃，易溶于水，甜度约为蔗糖的70％，在结构上与d-果糖c-3位存在差异。不同于传统甜味剂，当d-allulose被摄入人体后，70％会通过尿液或粪便直接排出，产生的能量仅为等量蔗糖的0.3％，无消化负担，对人体不构成健康威胁。此外，d-allulose还具有降血糖血脂、预防肥胖、清除自由基等多种生物学功效。美国食品及药品管理局(fda)已于2011年将d-allulose批准为一般认为安全(gras)级别食品，但由于d-allulose在自然界中含量极少，提取困难，而化学转化法成本较高，应用于食品等领域具有潜在的风险。
3.目前合成d-阿洛酮糖主要通过酶催化的方法。主要有两种方法，第一种方法使用原料为果糖，采用d-阿洛酮糖3-差向异构酶在一定条件下进行催化，如中国专利文献cn110462036a(申请号：201780077035.7)一种新型d-阿洛酮糖3-差向异构酶以及使用该酶制备d-阿洛酮糖的方法，公开了利用e.coli bl21(de3)/pet24a表达的d-阿洛酮糖3-差向异构酶在75℃条件下，以浓度为500g/l d-果糖为原料进行催化，反应后产生了164g/l d-阿洛酮糖，转化率为32.8％。第二种方法使用原料为葡萄糖，合成过程为先使用葡萄糖异构酶催化d-葡萄糖为d-果糖，其后采用d-阿洛酮糖3-差向异构酶将得到的d-葡萄糖/d-果糖混合糖液进行进一步催化，得到d-葡萄糖/d-果糖/d-阿洛酮糖三种糖的混合糖液。如中国专利文献cn1085888149a(申请号：201711037688.0)一种阿果糖液及其制备方法，公开了以葡萄糖异构酶催化得到的f55果葡糖液为原料，利用谷氨酸棒杆菌atcc13032/pk18-ldha-rpcdpe合成的d-阿洛酮糖3-差向异构酶进行进一步催化，得到了比例为450：390：160的d-葡萄糖/d-果糖/d-阿洛酮糖混合糖液。但由于目前合成d-阿洛酮糖采用的异构酶转化率难以超过50％(葡萄糖异构酶转化率为46％左右，d-阿洛酮糖3-差向异构酶转化率为30％左右)，因此利用上述酶法制备d-阿洛酮糖糖液中会混有大量的d-果糖或d-葡萄糖、d-果糖。
4.由于d-葡萄糖、d-果糖和d-阿洛酮糖互为同分异构体，分子式均为c6h
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o6，分子量均为180.16，理化性质极为接近，因此采用传统的结晶等纯化手段对转化产物(d-果糖/d-阿洛酮糖和d-葡萄糖/d-果糖/d-阿洛酮糖混合糖液)中的两种或三种糖进行纯化非常困难，另有报道采用模拟移动床结合氢型、钙型树脂进行色谱分离的方法，但几种成分完全分开的难度依然较高，分离成本也高。近年来，ankita juneja等人采用酿酒酵母kam-2gd对混合糖液中与d-阿洛酮糖性质接近的d-葡萄糖和d-果糖等进行转化，生成易于分离的乙醇(论文：ankita juneja,et al.bioresource technology.2019,275:27-34)，为含有d-阿洛酮糖混合糖液的分离提供了新的思路，但该途径生成乙醇产品附加值较低，同时易燃易爆，分离过程对设备工艺要求较高。
5.赤藓糖醇是一种填充型甜味剂，是四碳糖醇，分子式为c4h
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o4，分子量为122.12，
理化性质与d-阿洛酮糖有较大差异，但甜度与d-阿洛酮糖相当，为蔗糖的60％-70％，同时也无法被人体代谢吸收，因此赤藓糖醇又称零卡糖。赤藓糖醇可由葡萄糖发酵制得，为白色结晶粉末，具有爽口的甜味，不易吸湿，高温时稳定，在广泛ph范围内稳定，在口中溶解时有温和的凉爽感。目前赤藓糖醇主要通过解脂耶氏酵母发酵葡萄糖制得，解脂耶氏酵母安全性已在欧盟、美国等多个国家获得认证，因此生产的赤藓糖醇广泛应用于食品添加剂等行业，而开发以赤藓糖醇为主要原料的混合糖液具有良好的应用前景。


技术实现要素：

6.针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用解脂耶氏酵母(yarrowia lipolytica)制备赤阿糖液的方法。
7.本发明发现解脂耶氏酵母能够完全消耗d-阿洛酮糖糖液中的d-葡萄糖、d-果糖生成赤藓糖醇，但是对d-阿洛酮糖的含量没有明显变化；本发明制备的阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液，由于d-阿洛酮糖与赤藓糖醇的理化性质差异性较大，更易于分离纯化，获得纯度较高的d-阿洛酮糖，并且赤藓糖醇也有一定的应用价值，所以本发明制备的混合糖液具有良好的应用前景。
8.d-阿洛酮糖和赤藓糖醇的混合糖液简称为赤阿糖液。
9.本发明的技术方案如下
10.一种赤阿糖液，包括d-阿洛酮糖和赤藓糖醇。
11.根据本发明优选的，所述糖液中，d-阿洛酮糖与赤藓糖醇按质量比计为1：(0.01-1.2)。
12.所述赤阿糖液的制备方法，包括如下步骤：
13.以含有葡萄糖和/或果糖的d-阿洛酮糖混合糖液作为碳源，利用解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica进行发酵，将葡萄糖和/或果糖代谢消耗，制得d-阿洛酮糖和赤藓糖醇的混合糖液，即赤阿糖液。
14.根据本发明优选的，所述方法中，利用解脂耶氏酵母进行发酵的其他营养物质包括酵母膏、尿素和硫酸镁。
15.根据本发明优选的，所述方法中，解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica为解脂耶氏酵母菌株cicc 33063。
16.根据本发明优选的，所述方法中，所述含有葡萄糖和/或果糖的d-阿洛酮糖混合糖液的制备方法，包括如下步骤：
17.(1)利用常规技术构建d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因表达重组菌体，所述d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；
18.(2)利用步骤(1)制备的重组菌体以d-果糖为底物进行发酵，发酵后去除菌体，制得d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液；
19.或者，以d-葡萄糖为底物，利用葡萄糖异构酶酶解制得d-葡萄糖 d-果糖混合糖液；然后利用步骤(1)制备的重组菌体以d-葡萄糖 d-果糖混合糖液为底物进行发酵，发酵后去除菌体，制得d-葡萄糖 d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液。
20.进一步优选的，步骤(1)中所述重组菌体的宿主菌为枯草芽孢杆菌wb800n。
21.进一步优选的，步骤(2)中d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液中的d-果糖与d-阿洛酮糖
按质量比计为1：(0.1-0.48)；
22.进一步优选的，步骤(2)中d-葡萄糖 d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液中的d-葡萄糖 d-果糖与d-阿洛酮糖按质量比计为1：(0.04-0.16)。
23.进一步优选的，以d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液和/或d-葡萄糖 d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液作为碳源，利用解脂耶氏酵母yarrowia lipolytica进行发酵，将d-果糖或d-葡萄糖 d-果糖代谢消耗，制得d-阿洛酮糖和赤藓糖醇的混合糖液，即赤阿糖液。
24.上述赤阿糖液应用于制备d-阿洛酮糖和/或赤藓糖醇。
25.本发明的有益技术效果
26.1、本发明提供了一种制备d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液的方法，由于d-阿洛酮糖和赤藓糖醇甜度接近，均为蔗糖的70％左右，同时都难以被人体代谢；d-阿洛酮糖和赤藓糖醇相较于同分异构体的d-果糖、d-葡糖糖更利于分离纯化，赤藓糖醇相较于现有技术中的乙醇应用价值较高，通过调整初始发酵糖的浓度，可以调整发酵产物中赤藓糖醇和d-阿洛酮糖的比例，更利于后期开发利用。
27.2、本发明提供的d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液为食品安全菌株解脂耶氏酵母发酵含有果糖和d-阿洛酮糖的混合糖液制得，食品安全程度高。
28.3、本发明提供的d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液无需分别将赤藓糖醇和d-阿洛酮糖分离提取后复配制得，而是通过偶联d-阿洛酮糖酶法转化工艺，利用解脂耶氏酵母直接发酵制得d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液，生产过程简便，成本低廉。
附图说明
29.图1为添加了混合糖液的培养基液相色谱图；
30.图2为发酵产物d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液相色谱结果图。
具体实施方式
31.下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但保护范围不限于此。
32.材料来源
33.解脂耶氏酵母菌株(yarrowia lipolytica cicc 33063)来自中国工业微生物菌种保藏中心；
34.葡萄糖异构酶(it)购自诺维信(中国)生物技术有限公司；
35.d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因核苷酸序列如seq id no.1所示，通过bamhi和aatii连接至大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pht01(质粒pht01购自杭州宝赛生物科技有限公司)中，获得重组质粒pht01-dae。
36.本领域技术人可以根据现有技术选择功能相同的微生物或酶使用；pht01-dae保存至山东省微生物工程重点实验室中，本领域技术人可以根据现有技术自行合成及连接，也可自本重点实验室购买。
37.实施例中未注明具体条件的内容，按照常规条件进行；所用试剂或仪器未注明生成厂商的，均为普通市售产品。
38.实施例1
39.d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因重组表达菌体的制备
40.将质粒pht01-dae在1500v、5ms的电击条件下电击转化到重组枯草芽孢杆菌wb800n细胞中，经氯霉素抗性筛选后得到转化阳性的wb800n/pht01-dae菌株。将wb800n/pht01-dae菌株接种至含有氯霉素(50μg/ml)的50ml液体lbg培养基(葡萄糖50g，蛋白胨10g，酵母膏5g，氯化钠10g，溶解于纯水1000ml制得)中30℃过夜培养，后按体积百分数为2％量转接至新的50ml液体lbg培养基37℃培养，培养至od
600
≈1时加入至终浓度为1μm/ml的iptg，放入26℃、200rpm摇床中诱导24h，4000rpm离心收集获得d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因重组表达的菌体。
41.实施例2
42.以d-果糖为底物制备d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液
43.配置500g/l d-果糖(反应体系5l)，加入实施例1制备的d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因重组表达的菌体至od600＝30，作为静息细胞，在调节ph 8.0，60℃条件下反应8小时，制得d-果糖/d-阿洛酮糖混合糖液，采用高效液相色谱法(安捷伦hi-plex h型色谱柱，流动相为水，流速0.6ml/min，柱温80℃)进行d-果糖和d-阿洛酮糖含量测定，结果显示转化后d-果糖含量为364g/l，d-阿洛酮糖131g/l。
44.实施例3
45.以d-葡萄糖为底物制备d-葡萄糖 d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液
46.配置500g/l d-葡萄糖(反应体系5l)，按照0.1g/l添加量加入葡萄糖异构酶it，调节ph 8.0，60℃反应2小时，制得d-葡萄糖/d-果糖混合糖液，其后加入实施例1制备的d-阿洛酮糖3-差向异构酶基因重组表达的菌体至od600＝30，作为静息细胞60℃继续反应8小时，采用高效液相色谱法(安捷伦hi-plex h型色谱柱，流动相为水，流速0.6ml/min，柱温80℃)进行糖含量测定，结果显示转化后d-葡萄糖含量为235g/l，d-果糖含量为196g/l，d-阿洛酮糖65g/l。
47.实施例4
48.解脂耶氏酵母33063对d-葡萄糖和d-果糖的利用分析
49.分别使用葡萄糖培养基(按质量浓度计葡萄糖30％，酵母膏0.5％，尿素1％，mgso4 0.05％，余量水)、果糖培养基(按质量浓度计果糖30％，酵母膏0.5％，尿素1％，mgso4 0.05％，余量水)和混合糖培养基(按质量浓度计葡萄糖15％，果糖15％，酵母膏0.5％，尿素1％，mgso4 0.05％，余量水)对解脂耶氏酵母33063进行发酵培养，发酵温度为30℃，搅拌转速为200rpm，发酵时间为96h。采用高效液相色谱法对发酵得到的糖液进行分析，结果显示葡萄糖培养基、果糖培养基和混合糖培养基的赤藓糖醇产量分别为136g/l、131g/l和135g/l，同时三种培养基中底物糖均已消耗完毕，这表明解脂耶氏酵母33063不仅可以利用葡萄糖和果糖产生赤藓糖醇，不同原料产生的赤藓糖醇浓度较为接近，同时解脂耶氏酵母33063在发酵96h后能完全消耗葡萄糖和果糖。
50.实施例5
51.d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液的解脂耶氏酵母发酵分析
52.以实施例2制备的d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液为原料，加水稀释至d-果糖和d-阿洛酮糖总糖含量为300g/l，按质量浓度计酵母膏0.5％，尿素1％，mgso4 0.05％比例补充添加至糖液中，调整ph至7.0。以此培养基对解脂耶氏酵母33063进行发酵培养，发酵温度为30℃，搅拌转速为200rpm，发酵时间为96h。采用高效液相色谱法对发酵得到的糖液进行分析，
结果显示发酵产物d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液，即赤阿糖液中赤藓糖醇含量为97g/l，d-阿洛酮糖含量为75g/l。
53.以实施例2制备的d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液为原料，加水稀释至d-果糖和d-阿洛酮糖总糖含量为100g/l，按质量浓度计酵母膏0.5％，尿素1％，mgso4 0.05％比例补充添加至糖液中，调整ph至7.0。以此培养基对解脂耶氏酵母33063进行发酵培养，发酵温度为30℃，发酵时间为96h，搅拌转速为200rpm。采用高效液相色谱法对发酵得到的糖液进行分析，结果显示发酵产物d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液，即赤阿糖液中赤藓糖醇含量为20g/l，d-阿洛酮糖含量为24g/l。
54.上述结果显示，通过调整初始发酵糖的浓度，可以调整发酵产物中赤藓糖醇和d-阿洛酮糖的比例。
55.以实施例2制备的d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液为原料，加水稀释至d-果糖和d-阿洛酮糖总糖含量为200g/l，按质量浓度计葡萄糖2％，酵母膏0.5％，尿素1％，mgso4 0.05％比例补充添加至糖液中，调整ph至7.0，培养基高效液相色谱法分析结果见图1。以此培养基对解脂耶氏酵母33063进行发酵培养，发酵温度为30℃，搅拌转速为200rpm，发酵时间为96h。
56.采用高效液相色谱法对发酵得到的糖液进行分析，结果显示发酵产物d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液，即赤阿糖液中赤藓糖醇产量为48g/l，d-阿洛酮糖含量为45g/l，高效液相色谱法分析结果见图2。
57.上述结果显示四种物质的出峰顺序为d-葡萄糖＜d-果糖＜d-阿洛酮糖＜赤藓糖醇，其中d-葡萄糖、d-果糖和d-阿洛酮糖出峰时间较为接近，难以分离，而赤藓糖醇距d-阿洛酮糖的出峰时间差最大，因此在此色谱条件下更易于分离。
58.实施例6
59.d-葡萄糖 d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液的解脂耶氏酵母发酵分析
60.以实施例3制备的d-葡萄糖 d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液为原料，加水稀释至d-葡萄糖、d-果糖和d-阿洛酮糖总糖含量为300g/l，按质量浓度计酵母膏0.5％，尿素1％，mgso4 0.05％比例补充添加至糖液中，调整ph至7.0。
61.以此培养基对解脂耶氏酵母33063进行发酵培养，发酵温度为30℃，搅拌转速为200rpm，发酵时间为96h。采用高效液相色谱法对发酵得到的糖液进行分析，结果显示发酵产物d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液，即赤阿糖液中赤藓糖醇产量为108g/l，d-阿洛酮糖含量为38g/l，同时发酵液中d-葡萄糖和d-果糖已被耗尽。
62.以实施例3制备的d-葡萄糖 d-果糖 d-阿洛酮糖混合糖液为原料，加水稀释至d-葡萄糖、d-果糖和d-阿洛酮糖总糖含量为50g/l，并额外添加按质量浓度计葡萄糖25％，酵母膏0.5％，尿素1％，mgso4 0.05％比例补充添加至糖液中，调整ph至7.0。以此培养基对解脂耶氏酵母33063进行发酵培养，发酵温度为30℃，搅拌转速为200rpm，发酵时间为96h。采用高效液相色谱法对发酵得到的糖液进行分析，结果显示发酵产物d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液，即赤阿糖液中赤藓糖醇产量为125g/l，d-阿洛酮糖含量为6.2g/l，该结果显示可以通过在原料糖液中额外补加葡萄糖的方式提高赤藓糖醇在d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液中的比例。
63.综上，本发明制备的赤阿糖液为食品安全菌株解脂耶氏酵母发酵含有果糖和d-阿
洛酮糖的混合糖液制得，食品安全程度高；直接发酵酶法制得d-阿洛酮糖和赤藓糖醇混合糖液，生产过程简便，成本低廉；d-阿洛酮糖和赤藓糖醇相较于同分异构体的d-果糖、d-葡糖糖更利于分离纯化，赤藓糖醇相较于现有技术中的乙醇应用价值较高；通过调整初始发酵糖的浓度，可以调整发酵产物中赤藓糖醇和d-阿洛酮糖的比例，更利于后期开发利用。