氟硅唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其检测方法

1.本发明涉及农药安全检测领域，特别是涉及氟硅唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其检测方法。


背景技术：

2.氟硅唑（flusilazole）化学名称为双（4-氟苯基）甲基（1h-1，2，4-三唑-1-基甲基）硅烷，是含硅的新型三唑类杀菌剂，主要作为固醇脱甲基化抑制剂，可以破坏细胞膜的形成，使病菌死亡。氟硅唑对于子囊菌纲、担子菌纲和半知菌类真菌引起的病害有很好的防治效果，如灰霉病、黑星病、匍柄霉叶斑病等。
3.我国制定的水果中氟硅唑农药的最大残留限量标准为0.2mg/kg，但目前氟硅唑的检测方法尚无标准。关于氟硅唑的检测方法主要有液相色谱法、液相色谱-串联质谱法，但检测过程较复杂，需要对固相萃取柱进行净化，成本较高，不能达到快速检测的目的，不能实现现场快速检测，不能满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供了氟硅唑半抗原、抗原、抗体、检测装置及其检测方法。
5.根据本发明的一个方面，提供了一种免疫用氟硅唑半抗原，其结构如下所示：（ⅰ）。
6.根据本发明的另一个方面，提供了一种包被用氟硅唑半抗原，其结构如下所示：
（ⅱ）。
7.根据本发明的再一个方面，提供了氟硅唑抗原，包含免疫用氟硅唑半抗原以及与免疫用氟硅唑半抗原偶联的载体蛋白。
8.在一些实施方式中，载体蛋白为牛血清蛋白、牛乳铁蛋白、鸡卵清蛋白或血蓝蛋白中的一种。
9.根据本发明的第三个方面，提供了氟硅唑抗体，是以免疫用氟硅唑半抗原或氟硅唑抗原经动物免疫，取血，分离收集高免血清，提取纯化，得到的抗体。
10.在一些实施方式中，氟硅唑抗体为氟硅唑多克隆抗体。
11.根据本发明的第四个方面，提供了免疫用氟硅唑半抗原或包被用氟硅唑半抗原、氟硅唑抗原、氟硅唑抗体在氟硅唑残留的免疫学检测中的应用。
12.根据本发明的第五个方面，提供了氟硅唑胶体金层析检测装置，包括试纸条和反应杯，其特征在于，试纸条包括反应膜，反应膜设有检测线和质控线，检测线包被有包被抗原，包被抗原包含包被用氟硅唑半抗原以及与包被用氟硅唑半抗原偶联的载体蛋白，反应杯中含有胶体金标记的氟硅唑抗体。根据本发明的第六个方面，提供了一种检测样品中氟硅唑残留的方法，该方法为使用氟硅唑胶体金层析检测装置对样品中的氟硅唑进行检测。
13.在一些实施方式中，样品为水果、蔬菜或粮食谷物中的一种。
14.本发明的有益效果：本发明的氟硅唑胶体金层析检测装置对水果、蔬菜及粮食谷物中的氟硅唑残留进行快速检测，应用时不需要对固相萃取柱进行净化，达到快速检测的目的，本发明应用免疫学检测方法，对氟硅唑残留进行专属检测，具有特异性好、灵敏度高、操作简便、可实现现场快速检测等优点，能更好的满足监管部门、检测机构现场监督执法的需要，为相关执法部门快速检测果蔬、粮食谷物中氟硅唑残留是否超标提供技术支持。
附图说明
15.图1为本发明的氟硅唑免疫半抗原的质谱图。
16.图2为本发明的氟硅唑包被半抗原的质谱图。
17.图3为本发明的氟硅唑免疫半抗原的合成流程图。
18.图4为本发明的氟硅唑包被半抗原的合成流程图。
19.图5为本发明的氟硅唑胶体金层析检测装置的结构示意图。
具体实施方式
20.下面结合实施例，对本发明作进一步详细的说明。
21.实施例1本实施例中对氟苯基溴化镁选择国药集团化学试剂有限公司供应的1.0m solution in thf规格的4-氟苯基溴化镁，氰化亚铜选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯氰化亚铜，氯甲基甲基二氯硅烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的95%（氯甲基）甲基二氯硅烷，盐酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的36%-38%盐酸，乙酸乙酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯乙酸乙酯，无水硫酸钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的99%无水硫酸钠，1，2，4-三氮唑-3-羧酸甲酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的97% 1，2，4-三氮唑-3-羧酸甲酯，n，n-二甲基甲酰胺选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯n，n-二甲基甲酰胺，氢化钠选择国药集团化学试剂有限公司供应的60%氢化钠，升华硫选择国药集团化学试剂有限公司供应的化学纯升华硫，碳酸钾选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯碳酸钾，4-溴丁酸叔丁酯选择国药集团化学试剂有限公司供应的97% 4-溴丁酸叔丁酯，二氯甲烷选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯二氯甲烷，三氟乙酸选择国药集团化学试剂有限公司供应的分析纯三氟乙酸，以下实施例2-11均采用本实施例1中的试剂。
22.实施例2 免疫用氟硅唑半抗原的合成免疫用氟硅唑半抗原的制备方法，包括以下步骤：s1. 取100ml单口瓶，量取17ml对氟苯基溴化镁，加入9mg氰化亚铜，冰水浴下搅拌5min，滴加入3.9ml 氯甲基甲基二氯硅烷，然后转移至30℃油浴下继续反应1h，随后冰水浴10min，滴加入5ml 1m盐酸，搅拌0.5h，保持冰水浴，加入适量蒸馏水与乙酸乙酯，充分搅拌，分液，用无水硫酸钠干燥后，浓缩，拌样过过填料为200目硅胶粉的柱子，得第一中间体；s2. 另取100ml单口瓶，装入全部第一中间体共2.4g，称取1.19g 1，2，4-三氮唑-3-羧酸甲酯，加入20ml dmf，于室温下搅拌均匀后加入0.68g 60%的氢化钠，转移至油浴下搅拌，105℃反应3h，冷却反应液后浓缩，加水稀释，用6m盐酸将ph调至7-8，乙酸乙酯萃取两次，浓缩，拌样过填料为200目硅胶粉的柱子纯化，得免疫用氟硅唑半抗原，经质谱鉴定ei-ms（negative）m/z：358.1[m-h]
‑ꢀ
。
[0023]
实施例3 包被用氟硅唑半抗原合成包被用氟硅唑半抗原的制备方法，包括如下步骤：a1. 取100ml单口瓶，称取1g氟硅唑原药，0.82g升华硫，加入20ml dmf,油浴156℃反应过夜，浓缩反应液，加水稀释，乙酸乙酯萃取，无水硫酸钠干燥，浓缩，得第二中间体；a2. 另取100ml单口瓶，装入全部第二中间体，称取1.5eq碳酸钾，1.2eq 4-溴丁酸叔丁酯，加入15ml dmf，80℃油浴反应3h，冷却反应液后浓缩，加水稀释，乙酸乙酯萃取，直接拌样过填料为200目硅胶粉的柱子纯化，得第三中间体，该步骤中，1eq以氟硅唑原药计算；a3. 另取100ml单口瓶，装入全部第三中间体，加入5ml 二氯甲烷，2.5ml 三氟乙酸，室温下搅拌反应2h，浓缩反应液，加水稀释，乙酸乙酯萃取，过填料为200目硅胶粉的柱子纯化，得包被用氟硅唑半抗原，经质谱鉴定ei-ms（negative）m/z：432.1[m-h]
‑ꢀ
。
[0024]
实施例4 免疫用氟硅唑抗原合成
免疫用氟硅唑抗原的制备方法，包括以下：取实施例1制备的免疫用氟硅唑半抗原0.1mmol溶于2ml dmf中，搅拌加入0.2mmol dcc和0.1mmol nhs，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后取上清液，作为a液；称取牛乳铁蛋白 140mg 溶于10ml 浓度0.1mol/l的pbs（ph8.0）中，加入1ml dmf，搅拌溶解，制备得到b液；磁力搅拌下，将a液逐渐滴入b液中，4℃下反应 12h，离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到免疫用氟硅唑抗原，将免疫用氟硅唑抗原以10mg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用。
[0025]
实施例5 硝酸纤维素膜检测线（t线）用氟硅唑抗原合成检测线用氟硅唑抗原的制备方法，包括以下：取实施例3制备的包被用氟硅唑半抗原0.1mmol溶于2ml dmf中，搅拌加入0.2mmol dcc和0.1mmol nhs，4℃下磁力搅拌反应过夜，离心后取上清液，作为c液；称取120mg ova溶于10ml 浓度0.1mol/l的pbs（ph8.0）中，加入1ml dmf，搅拌溶解，制备得到d液；磁力搅拌下，将c液逐渐滴入d液中，4℃下反应 12h，离心后，取上清液，4℃下用生理盐水透析3天，每天更换3次透析液，得到检测线用氟硅唑抗原，将检测线用氟硅唑抗原以10mg/ml的浓度分装于0.5ml离心管中，冻存于-20℃冰箱中备用。检测线用氟硅唑抗原为包被抗原，即包含包被用氟硅唑半抗原以及与其偶联的载体蛋白。
[0026]
实施例6 氟硅唑多克隆抗体的制备及纯化使用实施例4制备得到的免疫用氟硅唑抗原，分别免疫3只2.5kg以上的新西兰白兔，免疫剂量为50～100μg/次，背部皮下分多点注射；首次免疫，将免疫用氟硅唑抗原与等量弗氏完全佐剂乳化；加强免疫，用免疫用氟硅唑抗原与等量弗氏不完全佐剂乳化，连续免疫4～5次，每次间隔4～8周，最后一次免疫后10～15天，以elisa法测其定效价达到105以上时，采血并分离收集高免血清，以饱和硫酸铵盐析法提取igg 抗体，然后使用protein a柱层析纯化，得到氟硅唑多克隆抗体，于-20℃冻存备用。
[0027]
实施例7 氟硅唑胶体金层析检测装置的制备7.1 胶体金的制备取1ml 1%氯金酸溶液，加99ml超纯水配制成浓度为0.01%的氯金酸溶液，加热沸腾后，取1.6ml 1%柠檬酸三钠一次性加入煮沸的0.01%氯金酸溶液中，继续加热至溶液由淡黄色转为蓝黑色最终变为亮红色，颜色稳定后继续加热5min，室温冷却，补充失水至原体积，得到胶体金溶液；7.2胶体金标记多克隆抗体的制备调节胶体金溶液ph值至8.0，用恒速搅拌器均匀搅拌，同时逐滴加入实施例6中制备得到的氟硅唑多克隆抗体，1h后加入与抗体量相当的peg，充分反应30min后，加入与抗体量相当的bsa，加完后继续搅拌30min，在9000rpm/min的转速下离心30min，获得均一性金标抗体沉淀，加入pnpb重悬，得到胶体金标记多克隆抗体，备用；7.3胶体金层析检测装置的制备在底板上，沿同一方向依次将样品垫，喷涂有氟硅唑-ova（检测线）和羊抗兔igg（质控线）的硝酸纤维素膜和吸水纸依次搭接粘连；反应杯内加入胶体金标记多克隆抗体，冻干。
[0028]
实施例8 一种检测样品中氟硅唑残留的方法
8.1 样品的预处理：取5g搅碎的待测黄瓜加至含有5ml ph7.4的磷酸盐缓冲液（缓冲液中含有10%的乙醇）的提取瓶中，拧紧瓶盖大力摇匀30秒，混匀后即为待测液；8.2 检测：使用实施例7制备的氟硅唑胶体金层析检测装置，进行检测，拧开提取瓶上盖，吸取200μl上层清液于反应杯中，并上下抽吸5次混匀，在20-40℃开始第一步反应，并计时3min；将测试条插入到反应杯中，在20-40℃下开始第二步反应，并计时3min；取出测试条，轻轻刮去测试条下端的样品垫，并进行结果判读；8.3 结果判读：根据下表1，对测试条的结果进行判读；表1 测试条结果判读表与验证方法结果对比将采用本实施例的检测方法的结果，与采用液相色谱-质谱/质谱法测定的结果进行比较，结果为：本发明的检测方法与液相色谱-质谱/质谱法的结果一致，说明本发明对样品中氟硅唑残留的检测方法具有较高的准确度。
[0029]
实施例9 氟硅唑胶体金层析检测装置的特异性实验向阴性苹果样品中，分别以25μg/kg的添加量加入氟硅唑、以5mg/kg的添加量加入硅氟唑、以5mg/kg的添加量加入抑霉唑、以5mg/kg的添加量加入丙环唑、以5mg/kg的添加量加入苯醚甲环唑、以5mg/kg的添加量加入三氮唑，得到多个含有不同农药成分的待测苹果样品，采用实施例7制备的氟硅唑胶体金层析检测装置与实施例8中的检测方法，对待测苹果样品进行检测。
[0030]
检测结果发现，只有加入氟硅唑的待测苹果样品检出阳性，而加入硅氟唑、抑霉唑、丙环唑、苯醚甲环唑、三氮唑的待测苹果样品无法检出，说明本发明的检测装置对氟硅唑的特异性较好。
[0031]
实施例10 氟硅唑胶体金层析检测装置的灵敏度向阴性小麦样品中，分别以10μg/kg、20μg/kg、25μg/kg、30μg/kg的添加量加入氟
硅唑，得到多个添加不同氟硅唑含量的待测小麦样品，采用实施例7制备的氟硅唑胶体金层析检测装置和本实施8中的检测方法，对待测小麦样品进行检测。
[0032]
检测结果发现，氟硅唑添加量为25μg/kg、30μg/kg的待测小麦样品检出为阳性 ，而添加量为10μg/kg、20μg/kg的待测小麦样品检出为阴性。通过上述添加实验，本发明中氟硅唑胶体金层析检测装置对氟硅唑的检出限位25μg/kg。待测样品中氟硅唑含量低于25μg/kg时，检测结果为阴性。说明本发明的氟硅唑胶体层析金检测装置对氟硅唑灵敏度高。
[0033]
实施例11 氟硅唑胶体金层析检测装置的保质期实验选取三批常规生产的产品分别做保质期实验，放置于室内室温环境下保持，每隔1个月取12个装置，用质控样本检测，分别做阴性空白对照和25μg/kg、50μg/kg、100μg/kg、200μg/kg加标实验，重复三次，观察数据变化，考察保质期时间。阴性显色从13个月开始下降，在1年时间内产品品质无明显变化，因此确定氟硅唑胶体金层析检测装置的保质期为1年。
[0034]
以上所述的仅是本发明的一些实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。