检测EBV和HCMV病毒的引物探针组合物及其应用的制作方法

检测ebv和hcmv病毒的引物探针组合物及其应用
技术领域
1.本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种同时检测ebv病毒和人巨细胞病毒hcmv的引物探针组合物及其应用。


背景技术：

2.eb病毒和人巨细胞病毒同属人类疱疹病毒，其中eb病毒(epstein-barr virus，ebv)为人类疱疹病毒属的γ亚科，又名人疱疹病毒4型；人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，hcmv)为人类疱疹病毒属的β亚科疱疹病毒，又名人疱疹病毒5型。ebv与hcmv均为双链dna病毒。目前已经发现的疱疹病毒有100种以上，其中与人类感染有关的疱疹病毒至少有8种，包括：hsv-1、hsv-2、水痘一带状疱疹病毒(vzv)、ebv、巨细胞病毒(hcmv)和hhv-6、hhv-7、hhv-8。
3.8种人类疱疹病毒除具有典型的疱疹病毒形态特征外，最重要的生物学特性是原发感染后病毒在体内持续存在，因此疱疹病毒感染者体内病毒易被周期性激活，病毒激活后仍具有传染性。因此，疱疹病毒感染者随时都可分泌一种或多种疱疹病毒，使得普通人群保持较高的感染率。其中以ebv和hcmv病毒危害最大，已知ebv与非洲burkitt’s淋巴瘤、鼻咽癌和移植后淋巴增生性疾病有关。而hcmv会导致孕妇感染后的胎儿先天畸形甚至死胎。
4.ebv和hcmv感染较为普遍，大多数人在少儿期感染过eb和hcmv，多呈无临床症状的急性感染或潜伏感染，同时因感染而获得免疫。在特殊情况下，比如自身免疫缺陷、获得性免疫权限、服用免疫抑制药物等，eb和hcmv病毒会容易活化感染。大多数hcmv感染临床表现与ebv感染相同，这2种病毒是持续发热性疾病的重要病原。在临床检测中，有时仅根据临床表现无法分辨ebv和hcmv感染，需要同时检测ebv和hcmv，此外，也会对艾滋病患者和器官移植患者进行ebv和hcmv的筛查。
5.ebv和hcmv感染的诊断包括血清学检查、病毒标志物检查、病毒分离。目前，血清学标志物检测通常作为急性或慢性ebv、hcmv感染的辅助诊断方法，抗vca-igm、hcmv-igm/igg检测是急性原发感染的重要指标。但血清学标志物实际上是检测人体对感染的免疫反应状态，无法检测病毒本身，也就无法准确灵敏的反映感染的情况。此外，随着技术的发展，定量检测病毒也逐渐成为可能。例如专利cn201410026784.5公开了一种同时检测常见人疱疹病毒hsv-1、hsv-2、ebv和hcmv的实时荧光定量pcr试剂盒，由定量pcr反应液、定量反应液、hsv-1标准品、hsv-2标准品、ebv标准品、hcmv标准品、阴性对照品、hsv-1阳性对照品、hsv-2阳性对照品、ebv阳性对照品、hcmv阳性对照品、说明书和盒体组成，可对样品中的四种人疱疹病毒同时进行分型检测，满足早期、快速、准确诊断的需要，为流行病学调查和及时制定针对性治疗方案提供有力依据。专利cn201710118846.9则公开了一种人疱疹病毒各亚型快速检测试剂，包括特异性扩增hsv-1rl2，hsv-2ul28，vzv orf26，ebv ebna1，hcmv ie，hhv-6a或hhv-6b u22，hhv-6a或hhv-6b ie，hhv-7u95和kshv orf72的正反向引物和相应内参标品，可针对不同来源的感染早期临床样本进行快速、有效的各亚型鉴别与诊断，具有很高的临床诊断使用价值。
6.目前尚未确立血清学标志物与ebv病毒、hcmv病毒拷贝之间的关系，因此，亟需提供一种直接判断ebv、hcmv病毒病毒复制活跃程度，检测准确度、灵敏度高的引物探针组合物及其试剂盒。


技术实现要素：

7.为了解决现有技术中的上述问题，本技术提供了一种同时检测ebv病毒和人巨细胞病毒hcmv的引物探针组合物及其应用。本发明所述的引物组合物互不发生干扰，具有较好的检测灵敏度和准确度，且操作简便，能够广泛应用于ebv病毒和人巨细胞病毒hcmv的临床诊断。
8.为了实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
9.一方面，本发明提供了一种检测ebv和hcmv病毒的引物探针组合物，所述的引物探针组合物包括hcmv检测引物探针组合物、ebv检测引物探针组合物和内标检测引物探针组合物。
10.具体地，所述的hcmv病毒基因组约250kb，可编码多种蛋白质，但ul123编码的ie1和ul122编码的ie2是表达量最多且最重要的。ie1被认为是hcmv及宿主细胞基因表达的反式激活因子，也是病毒感染后最先合成的蛋白，对于低moi感染时病毒基因的表达及复制不可或缺。ie2是hcmv溶解周期的主要活化因子，对病毒复制具有不可替代的作用。作为hcmv表达最丰富的蛋白，ie蛋白不仅在对抗宿主细胞的固有及特异性免疫方面有重要作用，还可通过多种机制影响病毒的潜伏及活化状态。因此针对其ie1基因，通过ncbi(美国国家生物信息中心)genebank数据库比对该基因的保守序列，设计引物探针序列，其靶序列为seq id no.1所示的序列。
11.具体地，所述的eb病毒基因组全长约172kb。其中bam h1w片段长3072bp，高度保守，在基因组中重复12次，此重复序列的两侧分别为短的(us)和长的(ul)独特序列区。因此针对其bam h1w基因，通过ncbi(美国国家生物信息中心)genebank数据库比对大量该基因的保守序列，设计了引物探针序列，其靶序列为seq id no.5所示的序列。
12.具体地，内标则采用人rnasep基因片段，其靶序列为seq id no.9所示的序列。
13.进一步具体地，所述的引物组合物包括：
14.(1)hcmv检测引物探针组合物：
15.正向引物hcmvf：5
’‑
tcagcatgtgctccttgattct-3’(seq id no.2)
16.反向引物hcmvr：5
’‑
gtgttgttatcctcctctacagtcaaac-3’(seq id no.3)
17.探针hcmvp：5
’‑
tgccgcaccatgtccactcgaa-3’(seq id no.4)；
18.(2)ebv检测引物探针组合物：
19.正向引物ebf：5
’‑
aagtggtcctgcagctatttctg-3’(seq id no.6)
20.反向引物ebr：5
’‑
agaagaccccctcttacatttgtg-3’(seq id no.7)
21.探针ebp：5
’‑
cgcatcagagcgccaggagtcc-3’(seq id no.8)；
22.(3)内标检测引物探针组合物：
23.正向引物icf：5
’‑
agatttggacctgcgagcg-3’(seq id no.10)
24.反向引物icr：5
’‑
gagcggctgtctccacaagt-3’(seq id no.11)
25.探针icp：5
’‑
ttctgacctgaaggctctgcgcg-3’(seq id no.12)。
26.进一步具体地，所述的探针(seq id no.4、seq id no.6、seq id no.10)的5’端荧光标记选自fam基团、vic/hex/joe基团、rox基团、cy5基团、cy3基团、tamra基团其中不同的三种；相对应的淬灭基团选自bhq-1、bhq-2或bhq-3中的一种或多种。
27.优选的，hcmv荧光探针hcmvp(seq id no.4)使用fam-bhq-1标记；ebv荧光探针ebp(seq id no.8)使用vic-bhq-1标记；内标荧光探针icp(seq id no.12)使用cy5-bhq-2标记。
28.可选的，使用rox探针作为参比荧光，用于校准不同反应孔间的荧光信号差异。
29.另一方面，本发明提供了上述引物探针组合物在制备检测ebv和hcmv病毒产品中的应用。
30.具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。
31.又一方面，本发明提供了一种检测ebv和hcmv病毒的产品，所述的产品包括上述引物探针组合物。
32.具体地，所述的产品包括但不限于独立试剂、芯片或试剂盒。
33.具体地，所述的产品还包括pcr反应液。
34.进一步具体地，所述的pcr反应液包括50mm三羟甲基氨基甲烷(ph6.8)、75mm醋酸钾、3.0mm醋酸镁、0.05mm edta二钠、5u热启动taq dna聚合酶、0.2u不耐热ung酶、0.2mm dntps、0.1％bsa、0.02％proclin300、各0.2μm的引物(hcmvf、hcmvr、ebf、ebr、icf、icr)、各0.1μm荧光探针(hcmvp、ebp、icp)。可选的，加入0.05μm rox探针作为参比荧光。
35.具体地，所述的产品还包括质控品：阴性对照，ebv阳性对照，hcmv阳性对照，内标。
36.进一步具体地，所述的阴性对照为ebv和hcmv dna为阴性的血清。
37.进一步具体地，所述的hcmv阳性对照为含hcmv靶序列(seq id no.1)的dna假病毒；
38.进一步具体地，所述的ebv阳性对照为含ebv靶序列(seq id no.5)的dna假病毒；
39.进一步具体地，所述的内标为含有人rnasep基因片段(seq id no.9)的克隆质粒。
40.具体地，所述的产品还包含用于裂解细胞、释放病毒核酸的快速核酸释放剂。
41.进一步具体地，所述的快速核酸释放剂含有100-200mm的koh或naoh、1-5％的ca-630或np-40或twen-20，5-10％的lls或sds以及100-200μm的surfactin。
42.又一方面，本发明提供了上述引物探针组合物或产品在检测ebv和hcmv病毒中的应用。
43.又一方面，本发明提供了一种检测ebv和hcmv病毒的方法，所述的方法为非疾病诊断和治疗方法，所述的方法包括利用上述引物探针组合物或产品对待测样本中ebv和hcmv病毒进行检测。
44.具体地，所述的方法包括以下步骤：
45.(1)提取样本的dna；
46.(2)利用上述引物探针组合物扩增步骤(1)提取并纯化的样本dna；
47.(3)对扩增结果进行分析。
48.与现有技术相比，本发明提供的试剂盒具有如下有益效果：
49.(1)采用本发明提供的引物探针组合物同时检测ebv病毒和人巨细胞病毒hcmv，具有较好的灵敏度和准确度，扩增效率高，且操作简便，快速省时，能够广泛应用于ebv病毒和
人巨细胞病毒hcmv的临床诊断。
50.(2)本发明所述的引物探针组合物(hcmv检测引物探针组合物、ebv检测引物探针组合物和内标检测引物探针组合物)互不发生干扰，不影响检测的准确性和灵敏度。
附图说明
51.图1为检测hcmv样本的fam通道扩增曲线图。
52.图2为检测ebv样本的vic通道扩增曲线图。
53.图3为检测内标ic的cy5通道扩增曲线图。
54.图4为所有通道扩增曲线图。。
具体实施方式
55.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
56.实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
57.实施例1.一种检测ebv和hcmv病毒的引物探针组合物
58.所述的引物探针组合物包括hcmv检测引物探针组合物、ebv检测引物探针组合物和内标检测引物探针组合物。本发明所述的引物探针委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
59.具体地，所述的hcmv病毒基因组约250kb，可编码多种蛋白质，但ul123编码的ie1和ul122编码的ie2是表达量最多且最重要的。ie1被认为是hcmv及宿主细胞基因表达的反式激活因子，也是病毒感染后最先合成的蛋白，对于低moi感染时病毒基因的表达及复制不可或缺。ie2是hcmv溶解周期的主要活化因子，对病毒复制具有不可替代的作用。作为hcmv表达最丰富的蛋白，ie蛋白不仅在对抗宿主细胞的固有及特异性免疫方面有重要作用，还可通过多种机制影响病毒的潜伏及活化状态。因此针对其ie1基因，通过ncbi(美国国家生物信息中心)genebank数据库比对该基因的保守序列，设计引物探针序列，其靶序列为seq id no.1所示的序列。
60.具体地，所述的eb病毒基因组全长约172kb。其中bam h1w片段长3072bp，高度保守，在基因组中重复12次，此重复序列的两侧分别为短的(us)和长的(ul)独特序列区。因此针对其bam h1w基因，通过ncbi(美国国家生物信息中心)genebank数据库比对大量该基因的保守序列，设计了引物探针序列，其靶序列为seq id no.5所示的序列。
61.具体地，内标则采用人rnasep基因片段，其靶序列为seq id no.9所示的序列。
62.进一步具体地，所述的引物组合物包括：
63.(1)hcmv检测引物探针组合物：
64.正向引物hcmvf：5
’‑
tcagcatgtgctccttgattct-3’(seq id no.2)
65.反向引物hcmvr：5
’‑
gtgttgttatcctcctctacagtcaaac-3’(seq id no.3)
66.探针hcmvp：5
’‑
tgccgcaccatgtccactcgaa-3’(seq id no.4)；
67.(2)ebv检测引物探针组合物：
68.正向引物ebf：5
’‑
aagtggtcctgcagctatttctg-3’(seq id no.6)
69.反向引物ebr：5
’‑
agaagaccccctcttacatttgtg-3’(seq id no.7)
70.探针ebp：5
’‑
cgcatcagagcgccaggagtcc-3’(seq id no.8)；
71.(3)内标检测引物探针组合物：
72.正向引物icf：5
’‑
agatttggacctgcgagcg-3’(seq id no.10)
73.反向引物icr：5
’‑
gagcggctgtctccacaagt-3’(seq id no.11)
74.探针icp：5
’‑
ttctgacctgaaggctctgcgcg-3’(seq id no.12)。
75.进一步具体地，hcmv荧光探针hcmvp(seq id no.4)使用fam-bhq-1标记；ebv荧光探针ebp(seq id no.8)使用vic-bhq-1标记；内标荧光探针icp(seq id no.12)使用cy5-bhq-2标记。
76.可选的，使用rox探针作为参比荧光，用于校准不同反应孔间的荧光信号差异。
77.实施例2.一种检测ebv和hcmv病毒的试剂盒
78.本发明所述的ebv和hcmv病毒的试剂盒(24测试/盒)的组成如下表1所示。
79.表1
80.组分装量pcr反应液960μl阴性对照50μlebv阳性对照50μlhcmv阳性对照50μl内标50μl快速核酸释放剂120μl
81.具体地，所述的pcr反应液包括50mm三羟甲基氨基甲烷(ph6.8)、75mm醋酸钾、3.0mm醋酸镁、0.05mm edta二钠、5u热启动taq dna聚合酶、0.2u不耐热ung酶、0.2mm dntps、0.1％bsa、0.02％proclin300、各0.2μm的引物(hcmvf、hcmvr、ebf、ebr、icf、icr)、各0.1μm荧光探针(hcmvp、ebp、icp)，加入0.05μm rox探针作为参比荧光。
82.具体地，所述的阴性对照为ebv和hcmv dna为阴性的血清。
83.具体地，所述的hcmv阳性对照为含hcmv靶序列(seq id no.1)的dna假病毒。
84.具体地，所述的ebv阳性对照为含ebv靶序列(seq id no.5)的dna假病毒。
85.具体地，所述的内标为含有人rnasep基因片段(seq id no.9)的克隆质粒。
86.所需的假病毒和内标克隆质粒委托厦门致善生物或生工生物工程(上海)股份有限公司合成，然后采用1
×
104copies/ml浓度的假病毒配制为为阳性对照和内标。
87.具体地，所述的快速核酸释放剂含有100-200mm的koh或naoh、1-5％的ca-630或np-40或twen-20，5-10％的lls或sds以及100-200μm的surfactin。
88.实施例3.试剂盒的使用方法
89.(1)样本处理：取pcr管/板，加入5μl/管的快速核酸释放剂至pcr管底，然后取待测的血清样本5μl加入至分装有快速核酸释放剂的pcr管中，吸打混匀，室温静置10min。
90.(2)反应体系配制：往处理好的样本中加入40μl的pcr反应液，即完成配制50μl的
扩增反应体系。
91.(3)pcr扩增：按照如下表2所示的反应程序进行上机扩增。
92.表2
[0093][0094]
检测荧光通道：hcmv dna(fam)、ebv dna(vic)、ic(cy5)，可选择rox作为参比荧光。
[0095]
(4)结果判读(按下表3进行)：
[0096]
表3
[0097][0098]
实验例1
[0099]
采用实施例2的试剂盒检测从外周血分离出的血清样本共88份，其中hcmv阳性24例，ebv阳性16例，阴性48例。对比参比试剂盒的检测结果，本试剂盒检出hcmv阳性24例，阳性符合率24/24(100％)，检出ebv阳性16例，阳性符合率16/16(100％)，检出阴性48例，阴性符合率48/48(100％)。
[0100]
同时，取hcmv阳性样本和ebv阳性样本的混合样本10份，本试剂盒检测hcmv、ebv阳性符合率均为100％。
[0101]
通过上述的实验结果可以发现，本发明的试剂盒操作简单，样本处理方便，检测准确性好，并且能够单管同时检测2种病毒，节省了成本和时间。
[0102]
以上仅为本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。