快速检测GI群诺如病毒的ERA方法、组合物和试剂盒与流程

快速检测gi群诺如病毒的era方法、组合物和试剂盒
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明涉及用于gi群诺如病毒的基础型和荧光型era快速检测技术，用于所述方法的寡核苷酸引物探针组合物，以及包含所述组合物的试剂盒。
2.

背景技术：

3.诺如病毒，又称诺瓦克病毒（norwalk viruses, nov），是人类杯状病毒科（human calicivirus, hucv）中诺如病毒（norovirus, nov）属的一种无包膜单股正链的 rna 病毒。nov多以食物和水为载体，可以造成多种哺乳性动物以呕吐、腹泻为主的病毒性肠胃炎，是目前常见的食源性病毒之一。由 nov 引发的感染性腹泻在世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要为成人和学龄儿童，其中每年10月至次年3月是高发期。美国每年在所有的非细菌性腹泻爆发中，60%-90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒感染发病率约15%左右。
4.诺如病毒基因组全长7.65 kb，主要有三个开放读码框（open reading frame, orf），即orf1、orf2、orf3，分别编码与病毒复制相关的非结构蛋白、vp1结构蛋白和vp2结构蛋白。根据完整的vp1基因氨基酸多样性和orf1上编码rna依赖性rna聚合酶（rdrp）区域的核苷酸多样性，可以将诺如病毒分为5个不同的基因群（gⅰ～g
ⅴ
）。其中只有gⅰ、gⅱ和gⅳ可以感染人。其中gi型基因群又包括9个基因亚型，分别命名为gⅰ.1-gⅰ.9，代表株为norwalk virus，包括southampton virus.desert shield virus等。我国目前最常见的诺如病毒感染主要为gⅰ群和gⅱ群，每年 nov 的爆发都会对国家造成很大的医疗及经济负担，但是由于 nov 的自身特性，无法在体外进行增值培养，导致目前为止没有特效的疫苗和药物，所以如何高效快速的检测 nov成为了现代研究者迫切需要解决的问题。
5.生物体的遗传物质主要由核酸决定，随着分子生物学技术的快速发展，通过鉴别核酸来溯源生物成分的各种分子生物学技术具有特异性强，灵敏度高，不易受环境条件干扰，结果稳定等优点，在食源性致病微生物检测中的应用越来越广泛。并且对于形态结构非常简单的微生物的进化，则只有用分子生物学的方法才能得到可靠结果。然而目前广泛流行的pcr核酸扩增技术已经无法满足快速检测的需要，因为这些pcr技术通常检测时间在2 h以上，并且需要配备专业的pcr核酸扩增仪，这些都限制了pcr核酸扩增技术的推广应用，因此，需要一种能够快速高效步骤简单的核酸检测方式，而酶促重组等温扩增技术（enzymatic recombinase amplification，era）符合这种要求。该技术原理是：在常温的环境下，重组酶与引物紧密结合，形成重组酶和引物的聚合体。当重组酶和引物聚合体在模板dna上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链dna结合蛋白的帮助下，打开模板dna的双链结构。然后，在dna聚合酶的作用下，引物沿5
’→3’
方向延伸，形成新的dna互补链，并完成扩增产物的指数级增长。因此在37～40℃的反应条件下即可对微量的dna、rna特异片段进行高效快速扩增，几分钟之内可以扩增数十亿倍。其低温适应性和灵敏度等方面取得了重
大突破并达到国际先进水平。并且该技术是我国研发的具有全球自主知识产权等温核酸扩增技术，可以摆脱国外专利壁垒。该技术方便、准确、迅速，已成为近年来研究的热点。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于快速高效、简单直观、准确灵敏的检测食品、粪便等样本中gi诺如病毒成分，本方法对于gi诺如病毒现场快速筛查和风险检测具有重要意义，能有效防止诺如病毒感染的发病率。
7.本发明的发明人根据国际标准iso ts 15216-2-2013、国标gb 4789.42-2016中gi群诺如病毒的参考基因——诺瓦克病毒（norwalk
ꢁ
virus）（genbank: m87661.2）为设计引物和探针的靶序列，同时检索了ncbi数据库中常见的肠道病毒全基因组序列，如轮状病毒、甲肝病毒、腺病毒等。利用clustal x软件对常见进行序列比对，根据era引物设计原理，在种间差异区域设计和筛选了能够高效检测gi群诺如病毒的特异性era引物和探针。同时建立了基础型和荧光型era两种gi群诺如病毒现场快速检测技术。
8.在本发明的一个方面，提供了基础型era检测gⅰ群诺如病毒的寡核苷酸引物上游g
ⅰꢀ
f：5
’‑ꢀ
atgtatgtcccaggatggcaggccatgt
ꢀ‑3’
（seq id no.1），和下游g
ⅰꢀ
r：5
’‑ꢀ
tccggtaccaactgaccagcgccactag
ꢀ‑3’
（seq id no.2）。该引物可特异性识别gⅰ群诺如病毒序列，扩增片段长度168 bp，扩增条件为：37℃ 扩增10 min。
9.在本发明的另一个方面，提供了荧光型era检测gⅰ群诺如病毒的探针gⅰp：5
’‑ꢀ
gacctcggattgtggacaggagatcgcgatcttctgcccgaattcgt-3’（seq id no.3），在探针的3’端碱基用c3-spacer封闭，在第30位的t碱基上修饰fam荧光报告基团，第31位的c碱基用四氢呋喃（thf）代替，第32位的t碱基上修饰淬灭基团bhq1。该探针与seq id no.1和seq id no.2组合进行荧光型era扩增，从而特异性识别gⅰ群诺如病毒。在qpcr仪中设置反应程序为：37 ℃ 1 s；37 ℃ 5 s，40个循环；在第二反应阶段收集fam荧光信号。
10.在本发明的再一个方面，提供了包含上述寡核苷酸序列的组合物。所述组合物包含选自以下（1）至（2）中的任意一组或多组引物和探针序列：（1）gⅰ群诺如病毒基础型era检测寡核苷酸引物对seq id no.1~seq id no.2；（2）gⅰ群诺如病毒荧光型era检测寡核苷酸引物对seq id no.1~seq id no.2以及探针seq id no.3序列；在一个实施方式中，gⅰ群诺如病毒基础型era扩增条件是37 ℃ 10 min，反应结束后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）试剂，振荡混匀后充分离心，上层溶液用2％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。
11.在一个实施方式中，gⅰ群诺如病毒荧光型era扩增条件是37 ℃ 1 s；37 ℃ 5 s，40个循环；在第二反应阶段收集fam荧光信号。通过荧光曲线分析检测结果，若获得良好扩增曲线，表示检测结果为阳性，无扩增则表示检测结果为阴性。
12.在本发明的一个方面，分别提供了用于gⅰ群诺如病毒荧光型era检测试剂盒，以及荧光型era检测试剂盒，所述试剂盒中包含所述寡核苷酸序列或所述组合物。
13.本发明提供的试剂盒包括本发明分别用于基础型era检测gⅰ群诺如病毒成分的特异性引物对，荧光型era检测gⅰ群诺如病毒成分的特异性引物探针组合物，以及使用说明书。
14.在一个实施方案中，本发明的gi 群诺如病毒以诺瓦克病毒（norwalk
ꢁ
virus）（genbank: m87661.2）的cdna序列为基础序列，特异性引物分别在orf1和orf2开放读码框的核酸序列设计。在一个实施方案中，所述试剂盒中包含gi 群诺如病毒特异性扩增靶序列为: atgtatgtcccaggatggcaggccatgttccgctggatgcgcttccatgacctcggattgtggacaggagatcgcgatcttctgcccgaattcgtaaatgatgatggcgtctaaggacgctacatcaagcgtggatggcgctagtggcgctggtcagttggtaccgga (seq no.4)，在一个优选的实施方案中，所述试剂盒的使用说明书中包括对用于基础型检测gi 群诺如病毒的特异性引物和扩增条件的描述。在一个具体的实施方案中，本发明的用于检测gi 群诺如病毒成分的试剂盒还包括对照品。优选地，对照品包括阳性对照品和阴性对照品。在一个实施方案中，阴性对照为无菌双蒸水。
15.在一个实施方案中，所述基础型和荧光型era检测方法对gi群诺如病毒检测的灵敏度均为0.01 ng/μl。
16.再一方面，本发明提供了所述组合物或所述试剂盒在检测食品、粪便等样本中gi群诺如病毒中的应用。
17.扩增引物和探针的设计是开发灵敏、快速的era检测方法的关键，因为不同序列的引物在era反应中有不同的表现，将影响扩增效率和扩增速度，所以引物的设计和筛选是非常必要的。
18.由于era扩增技术具有独特的37-42℃反应条件，因此era检测对引物的设计有着严格的要求，然而era的引物和探针设计不像传统pcr那样成熟，目前还没有设计软件可以使用。普通pcr的引物是不适用的，因为era引物比一般pcr引物长，通常需要达到28-35 nt为宜。引物过短会降低重组率，影响扩增速度和检测灵敏度。引物过长，在扩增过程中可能会产生引物二聚体或者发卡结构等其他的二级结构，从而影响核酸扩增的产量。并且在设计era引物时，变性温度不再是影响扩增引物的关键因素。尽管知道了这些筛选的引物，但最终引物的选择还需要自己筛选和优化。
19.基于era技术特点，为保证检测的特异性、灵敏度以及速度，首先就要对目标序列进行充分的比较和选择。为此发明人通过分析选择了序列中碱基分布相对均衡；gc含量在30%-60%之间，并且无连续g和c；无超过12 bp以上正向/反向重复以及回文等复杂二级结构；避开基因组内的重复序列的区域进行era引物和探针的设计。
20.一方面，发明人为建立高效的gi群诺如病毒基础型era检测方法，设计了5组候选引物，分别命名为：gif1/gir1
‑ꢀ
gif5/gir5，序列信息和目的片段长度详见表1。对扩增效果进行了分析，初步确定gif2/gir2和gif4/gir4这2组引物的扩增效果好（图1）。进一步的，为获得最佳灵敏度、速率、稳定性的引物，我们又进行二轮的筛选：将第一轮筛选的引物进一步对检测的灵敏度进行分析，通过比较检出限（图2）和特异性（图3），综合扩增效率和阴性对照等因素。最终确定了寡核苷酸引物对gif2/gir2对gⅰ群诺如病毒的检测效果最好，即seq id no.1~seq id no.2。
21.再一方面，为建立gⅰ群诺如病毒的荧光型era快速检测方法，发明人进一步设计了检测的探针，修饰基团和序列信息详见表1。探针设计要求在引物中间位置设计，与模板完全互补，长度46-52 nt；其中thf位点的5’端至少30 nt，3’端至少15 nt。荧光团与淬灭团只能标记在胸腺嘧啶（t）上，荧光团与淬灭团间距在1-5 nt，因为更大的间隔会导致基底值偏高，信噪比偏低从而降低淬灭效率。两者中间一个核苷酸用四氢呋喃（thf）取代，且dt-荧光
团或dt-淬灭团与thf碱基间隔数为0、1或2。探针的3’端需要加上阻断基团进行修饰封闭，如c3-间隔、磷酸盐、胺、生物素或四乙二醇等。在核酸外切酶ii的作用下，分离两个基团，扩增产物增长的同时，荧光信号也同步积累，即可同步检测荧光曲线。
22.发明人设计了3组探针：gip2-1、gip2-2、gip2-3，并与上述优选的基础型era引物对gif2/gir2进行了组合，对荧光型的扩增效果进行了比较分析。通过比较扩增效率（图4）、特异性（图5）、检出限（/6），以及阴性对照等因素，最终确定了本发明提供的荧光型era检测gⅰ群诺如病毒的寡核苷酸引物探针组合gif2/gir2/gip2-2，即seq id no.1~seq id no.3。
23.表1 设计的gⅰ型诺如病毒era检测引物及探针序列信息为进一步分析筛选的最优引物探针组合在gⅰ群诺如病毒中的覆盖性，在ncbi数据库检索了gⅰ群诺如病毒9种基因亚型的参考序列，通过与靶序列（seq no.4）进行序列比对（图7），结果显示除gⅰ.2、gⅰ.7、gⅰ.8亚型外，其余6种gⅰ群诺如病毒与seq no.4靶序列具有高度的序列保守性，序列匹配率均在84%以上（表2）。说明所选取引物探针对6种gⅰ群诺如病毒检测的覆盖性良好。
24.表2 9种gⅰ群诺如病毒参考序列信息及与靶序列的匹配率分析结果本发明的方法巧妙地运用了era技术对dna高效扩增、核酸杂交的特异性，以及基础型与荧光型era检测技术的快速、敏感和肉眼可视性，建立了操作简单、省时省力、结果可靠、准确灵敏的2种现场可视快速检测方法。使用本发明的基础型和荧光型era检测技术，可简单、快速、特异且灵敏的用于食品、粪便等中gⅰ群诺如病毒的定性检测，本专利方法的建
立可为诺如病毒的现场快速风险筛查提供了良好的技术支撑。
附图说明
25.图1是对设计的5组gⅰ群诺如病毒基础型era检测引物的筛选结果。图中m表示dl2000 dna ladder，1-5分别表示gif1/gir1，gif2/gir2， gif3/gir3，gif4/gir4，gif5/gir5的扩增结果，ck表示ddh2o空白对照。
26.图2是使用上述优先的引物组合gif2/gir2、gif4/gir4对gⅰ群诺如病毒的灵敏度检测结果。图中m表示dl2000 dna ladder，1-5分别表示dna模板浓度分别为10、1、10-1
、10-2
、10-3 ng/μl的扩增结果，ck表示ddh2o空白对照。
27.图3是使用上述优选的引物组合gif2/gir2对gi群诺如病毒的特异性检测结果。图中m表示dl2000 dna ladder；1-8分别为：gi诺如病毒标准核酸样品、gii群诺如病毒cdna、轮状病毒cdna、甲肝病毒cdna，每个样品2个平行重复；ck表示ddh2o空白对照。
28.图4是对设计的3组荧光型era检测探针扩增效率的分析结果。图中1-3分别表示上述优选的引物对gif2/gir2与3个探针gip2-1、gip2-2、gip2-3组合的扩增结果，ck表示ddh2o空白对照。
29.图5是上述优选的引物探针组合gif2/gir2/gip2-2对gi群诺如病毒特异性检测的结果，对照样本为：gii群诺如病毒cdna、轮状病毒cdna、甲肝病毒cdna，每个样品2个平行重复；ck表示ddh2o空白对照。
30.图6是上述优选的引物探针组合gif2/gir2/gip2-2对gi群诺如病毒荧光型era方法灵敏度的分析结果。模板浓度分别为10、1、10-1
、10-2
、10-3 ng/μl。
31.图7是对设计引物探针组合扩增的靶序列在6种gⅰ群诺如病毒的序列比对结果。
具体实施方式
32.通过实施例的方式对本发明作进一步的说明，但是本发明并不仅仅局限于以下实施例。
33.实施例1本实施例为通过如下试验对gⅰ群诺如病毒检测的基础型era引物进行了筛选。
34.设计了5组gⅰ群诺如病毒基础型era检测候选引物：gif1/gir1，gif2/gir2， gif3/gir3，gif4/gir4，gif5/gir5，分别进行了扩增效率、灵敏度和特异性分析。
35.检测主要步骤：1）病毒rna提取和反转录：使用rneasy mini kit试剂盒对病毒进行rna提取，使用fast king rt kit (with gdase)试剂盒将提取的rna反转录成cdna，并稀释成2 ng/μl 进行试验。
36.2）检测体系和程序：参照基础型核酸扩增试剂盒（era法）说明书配置，每份样本预混液体系为：溶解剂20 μl，正向引物2.5 μl，反向引物2.5 μl，模板1 μl，ddh2o 22 μl。取48 μl上述预混液转移至扩增pcr 管中，振荡混匀并短暂离心。在管盖上加入2 μl的激活剂，小心盖好管盖，短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂振荡混匀并再次快速离心，放入pcr仪中37 ℃反应10 min，同时以无菌ddh2o为空白对照。
37.3）电泳检测：反应结束后加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）试剂，振荡混匀
后充分离心，上层溶液用2％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定，4）结果判定：空白对照在168 bp左右无条带，结果才能判为有效，否则视实验结果无效。检测样本如果在1684 bp左右有电泳条带，表示扩增结果为阳性，否则为阴性。
38.如图1所示，对设计的5组gⅰ群诺如病毒基础型era检测候选引物进行扩增效率的比较，结果发现gif2/gir2和gif4/gir4扩增条带明亮单一，效果明显优于其他3组。
39.如图2所示，对筛选的引物对gif2/gir2和gif4/gir4进行检测灵敏度分析，结果显示寡核苷酸引物对gif2/gir2对gⅰ群诺如病毒的扩增效果最好，最低检出限为0.01 ng/μl。
40.如图3所示，对筛选的引物对gif2/gir2进一步进行特异性分析，结果发现仅gⅰ群诺如病毒的2个平行样本有扩增，gⅱ诺如病毒标准核酸样品、轮状病毒cdna、甲肝病毒cdna以及ddh2o空白对照的2个平行样本无扩增，充分说明本实验筛选的特异性寡核苷酸引物对gⅰ群诺如病毒样品表现优异的特异性。
41.实施例2本实施例为通过如下试验对gⅰ群诺如病毒检测的荧光型era引物探针组合进行了筛选。
42.对设计的gip2-1、gip2-2、gip2-3和上述优选的基础型era引物对gif2/gir2进行了3种荧光型era引物探针组合，通过进行扩增效率、灵敏度和特异性分析，最终确定了gⅰ群诺如病毒检测的荧光型era引物探针。
43.检测主要步骤：1）病毒rna提取和反转录实验操作条件如实施例1所述。
44.2）检测体系：参照荧光型核酸扩增试剂盒（era法）使用说明书制备每份样本的预混液：溶解剂20 μl，正向引物2.1 μl，反向引物2.1 μl，探针0.6 μl，模板1 μl，ddh2o 22.2 μl。将上述预混液转移至有荧光型扩增试剂的pcr管中，振荡混匀并短暂离心。在管盖上加入2 μl的激活剂，小心盖好管盖，短暂离心使激活剂进入预混液中，短暂振荡混匀并再次快速离心，放入迷你qpcr仪。
45.3）反应程序：37 ℃ 1 s；37 ℃ 5 s，40个循环；在第二反应阶段荧光通道选择fam，阈值设为默认。同时以无菌水为空白对照，每个反应设置2个平行。
46.4）结果判定：空白对照无扩增曲线结果才能判为有效，否则视实验结果无效。如有明显扩增曲线，则判定为阳性。如无荧光曲线，则判定为阴性。
47.如图4所示，对3种组合的gⅰ群诺如病毒荧光型era检测候选引物探针扩增效率的比较，结果显示gif2/gir2/gip2-2扩增效率最好。
48.如图5所示，对筛选的引物探针组合gif2/gir2/gip2-2进行特异性分析，结果发现仅gⅰ群诺如病毒的2个平行样本有扩增，gⅱ诺如病毒标准核酸样品、轮状病毒cdna、甲肝病毒cdna以及ddh2o空白对照的2个平行样本无扩增，充分说明本实验筛选的特异性寡核苷酸引物对gⅰ群诺如病毒样品表现优异的特异性。
49.如图6所示，对筛选的引物探针组合gif2/gir2/gip2-2进一步进行检测灵敏度分析，结果显示该寡核苷酸引物组合的灵敏度最高，能够检出gⅰ群诺如病毒的最低含量为0.01 ng/μl。
50.虽然已经对本发明的具体实施方案进行了描述，但是本领域技术人员应认识到，在不偏离本发明的范围或精神的前提下可以对本发明进行多种改变与修饰。因而，本发明
意欲涵盖落在权利要求书及其同等物范围内的所有这些改变与修饰。