一种促进T淋巴细胞的肿瘤浸润性的外泌体及其制备方法

一种促进t淋巴细胞的肿瘤浸润性的外泌体及其制备方法
技术领域
1.本发明属于肿瘤治疗技术领域，具体涉及一种促进t淋巴细胞的肿瘤浸润性的外泌体及其制备方法。


背景技术：

2.肿瘤的免疫治疗近来受到了极大关注，于2013年被science评为年度十大科技突破之首，具有广阔的应用前景。尽管肿瘤免疫治疗血液系统肿瘤和恶性黑色素瘤治疗中取得了令人振奋的效果，但是在大多实体肿瘤中却收效甚微。
3.免疫细胞的肿瘤浸润度低是抗肿瘤细胞治疗的主要瓶颈之一。外泌体作为细胞间重要的天然媒介微粒,参与了细胞迁移、趋化等活动。t淋巴细胞是抗肿瘤免疫的最终效应细胞，将肿瘤特异性抗原(tumor-associatedantigen,taa)激活后的t淋巴细胞回输以治疗肿瘤的过继细胞治疗(adoptive cell therapy，act)近年来得到了广泛关注。但是t淋巴细胞的肿瘤组织浸润度低，使免疫疗法的效果大大折扣。如何提高t淋巴细胞在肿瘤组织的浸润度是我们急需解决的问题。
4.外泌体是细胞释放的一种直径约30
–
160nm的膜性囊泡。外泌体一度被认为是细胞产生的碎片和代谢废物。然而最近的研究表明外泌体能够携带细胞特异的信息，并将相应信息传递给其它细胞和远处组织。作为细胞-细胞间交流的“运载工具”，外泌体在生理、病理状态下都发挥着重要的调控作用。外泌体中除了脂质、蛋白外，还存在mrna和mirna等遗传物质。作为纳米级“运载工具”，外泌体在抗肿瘤药物/免疫/基因治疗载体方面的应用价值近年来也获得了极大的关注。外泌体作为细胞分泌的纳米级小泡，具有高效传递蛋白质和核酸的能力，其作为载体进行药物运输有以下优势：
①
外泌体的磷脂双分子膜结构在体内稳定性好，且可以有效保护其负载的药物；
②
自身来源的外泌体注入体内后引起免疫排斥反应率低；
③
外泌体具有一定的靶向性，可以与靶细胞膜融合将药物释放到细胞中。
5.然而，外泌体在药物投递中的应用研究才刚刚起步，最显著的问题是肿瘤组织摄取外泌体率低的问题。进入临床试验的载药外泌体多数是通过高注射量增加外泌体的肿瘤摄取率，但这种方式并未从根本解决外泌体的肿瘤摄取率低的问题。高外泌体注射量极有可能激发机体的固有免疫，已经有实验证明，在每周给药1.3x10
13
树突细胞外泌体治疗非小细胞肺癌的临床试验中，三分之一患者出现了nk细胞裂解以及mage特异性t淋巴细胞显著升高，并预示引发细胞因子风暴的风险。


技术实现要素：

6.针对相关技术的缺陷，本发明提出一种促进t淋巴细胞的肿瘤浸润性的外泌体及其制备方法，通过对t淋巴细胞外泌体的膜结构进行修饰，修饰后的t淋巴细胞外泌体不仅能够募集循环t淋巴细胞浸润肿瘤组织，还有改善肿瘤微环境的潜在临床价值。本发明可以实现精准诱导循环t淋巴细胞进入肿瘤组织，解决癌症治疗中t淋巴细胞浸润度低的普遍问题，提高免疫细胞治疗的效用。
7.本发明的第一方面提供了一种外泌体具有促进t淋巴细胞的肿瘤浸润性的能力，该外泌体的膜上含有目标基因cxcr2表达的蛋白。
8.进一步地，该外泌体的膜上还含有目标基因cxcr3表达的蛋白。
9.进一步地，该外泌体的膜上还含有目标基因cd47表达的蛋白。
10.本发明的第二方面提供了一种重组载体，载体为真核表达载体或病毒载体，在载体上重组有目标基因cxcr2、cxcr3或cd47中的一种或多种。
11.进一步地，所述载体为重组病毒载体。
12.进一步地，所述重组病毒载体为重组慢病毒载体。
13.本发明的第三方面提供了一种重组细胞，包含上述的重组载体。
14.进一步地，重组细胞是重组t淋巴细胞。
15.进一步地，重组t淋巴细胞是jurkat细胞。
16.本发明的第四方面提供了一种制备上述外泌体的方法，包括如下步骤：
17.s1、把目标基因cxcr2、cxcr3以及cd47重组到慢病毒表达载体上，转染jurkat细胞,利用5μg/ml氨苄西林青霉素素筛选高度表达gfp的细胞株，并进行传代增殖，进行纯化；
18.s2、加入10ng/ml il-2在37℃，5％co2的条件下刺激jurkat 8h后进行离心,1500g x5 min离心，取培养基上清，即含exo-c的培养基；
19.s3、使用截取分子量＝4k的pall 20ml超滤管，离心25k x 20min；使用外泌体提取试剂盒,并提取外泌体；
20.s4、通过avanti匀质仪进行颗粒筛选，筛选出孔径《200nm的exo-c粒径。
21.本发明的经过改进的外泌体具有多种有益效果：能够促进载药外泌体的肿瘤浸润性，提高了治疗的靶向性和高效性，提高了肿瘤细胞的摄取率。已经有证据表明，外泌体膜上表达了丰富的趋化因子受体，可诱导t淋巴细胞逆外泌体浓度梯度方向迁移。该改进后的外泌体膜上含有丰富的趋化因子受体cxcr2和cxcr3，可诱导t淋巴细胞逆外泌体浓度梯度方向迁移，促进t淋巴细胞向肿瘤组织移动，从而提高浸润率。采用了高效的提纯方法，外泌体提取纯度高达97％并产量提高20倍以上，超越了传统的超离心以及单外泌体试剂盒。制备出了首个含有靶向cxcl7、cxcl10等趋化因子的外泌体载体，大大提高了t淋巴细胞外泌体的肿瘤浸润性。通过高表达cd47极大程度降低巨噬细胞吞噬外泌体的可能性，增加了外泌体的稳定性。本发明通过对t淋巴细胞外泌体膜上结构修饰，增强了含有药物的外泌体肿瘤靶向性并增强了外泌体向肿瘤移动的能力，并可以持续平稳地促进免疫t淋巴细胞的肿瘤浸润。即含有药物的t淋巴细胞外泌体同时起到诱导循环t淋巴细胞进入肿瘤组织并进行细胞杀伤，外泌体内部的药物在肿瘤组织内循环并缓慢释放，最终载药外泌体和肿瘤浸润t淋巴细胞达到最高值，并将外周组织炎症等不必要副作用降到最低。
附图说明
22.图1a是构建重组细胞的过程示意图；
23.图1b是含有目标基因的慢病毒构建示意图；
24.图2a是外泌体提取纯化改进方案示意图；
25.图2b是未经改进方案提取的外泌体纯度示意图；
26.图2c是经过方案改进的外泌体提取纯度示意图；
27.图3a是外泌体的transwell测试的实验构建示意图；
28.图3b是以jurkat外泌体为研究代表对象的促趋化作用示意图；
29.图3c是血清浓度对外泌体促趋化作用的影响对比示意图；
30.图3d是外泌体促趋化率的对比示意图。
具体实施方式
31.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
32.本发明通过对t淋巴细胞外泌体膜上结构修饰，增强了含有药物的外泌体肿瘤靶向性并增强了外泌体向肿瘤移动的能力，并可以持续平稳地促进免疫细胞的肿瘤浸润。即含有药物的t淋巴细胞外泌体不仅能够精准诱导循环t淋巴细胞进入肿瘤组织，提高t淋巴细胞在肿瘤组织中的浸润度且能够提高外泌体的靶向性。另外，此发明可作为抗肿瘤治疗低应答人群的辅助治疗。
33.本发明制备出了一种能够与肿瘤细胞高效结合的外泌体，该外泌体的膜上含有目标基因cxcr2和cxcr3表达的蛋白。该外泌体的膜上除了含有目标基因cxcr2和cxcr3表达的蛋白，还含有目标基因cd47表达的蛋白。
34.本发明制备出了一种t淋巴细胞，该t淋巴细胞的外泌体膜进行了修饰，膜上含有cxcr2和cxcr3表达的蛋白。
35.本发明涉及一种重组载体，该重组载体上包含有目标基因cxcr2和cxcr3。携带目标基因的重组慢病毒载体结构参见图1b。
36.外泌体的制备和提纯方法以及趋化实验的证实采用下文涉及到的方法。
37.外泌体的制备方法如下：
38.外泌体的表达：把目标基因cxcr2、cxcr3以及cd47重组到慢病毒表达载体上，转染jurkat t淋巴细胞(简称jurkat细胞)。48h后利用5μg/ml氨苄西林素筛选高度表达gfp的细胞株(图1a和图1b)，并进行传代增殖，进行纯化。通过电穿孔仪把硫酸盐肝素电转到exo-c膜上。
39.外泌体生成：加入10ng/ml il-2在37℃，5％co2的条件下刺激jurkat8h后进行离心,1500g x5 min离心，取培养基上清，即含exo-c的培养基。exo-c浓缩及纯化：使用截取分子量＝4k的pall 20ml超滤管，离心25k x20min。使用外泌体提取试剂盒(thermal fisher),依照生产厂家的指引，提取外泌体。
40.二度纯化：通过avanti匀质仪进行颗粒筛选孔径《200nm的exo-c粒径。
41.通过上述这种方法制备的外泌体膜上含有目标基因cxcr2和cxcr3表达的蛋白，cxcr2高表达，结合cxcr2的配体cxcl7。cxcr3高表达，结合cxcr3的配体cxcl10。cxcl7与cxcl10在多种实体瘤患者血液中含量显著偏高。能够促进含有药物的外泌体与肿瘤细胞的结合。
42.通过以上方法制备的外泌体，具有较多的有益效果:能够促进含有药物的外泌体与肿瘤细胞的结合，提高了治疗的靶向性和高效性，提高了肿瘤细胞的摄取率。已经有证据
表明，外泌体膜上表达了丰富的趋化因子受体，可诱导t淋巴细胞逆外泌体浓度梯度方向迁移，该改进后的外泌体膜上含有丰富的趋化因子受体cxcr2和cxcr3，可诱导t淋巴细胞逆外泌体浓度梯度方向迁移，促进t淋巴细胞向肿瘤组织移动，从而提高浸润率。采用了高效的提纯方法，外泌体提取纯度高达97％并产量提高20倍以上，超越了传统的超离心以及单外泌体试剂盒。制备出了首个含有靶向cxcl7、cxcl10的外泌体载体，大大提高了外泌体与肿瘤细胞的结合。通过高表达cd47极大程度降低巨噬细胞吞噬外泌体的可能性，增加了外泌体的稳定性。
43.趋化效果证实：
44.试验方案-外泌体提取、纯化方案对比,如图2a、2b、2c所示。
45.在未经改良纯化方案处理的外泌体纯度74％。使用30k peg和2.5k cut-off weight的透析膜进行透析，将用于培养细胞的培养基进行透析浓缩,如45ml的rpmi培养基浓缩至6ml。用外泌体提取试剂盒thermofisher进行提取，测得蛋白质含量达1.52mg/ml*400ul(约0.6mg纯化物),离心10k,21min 19.4k,5min。所得外泌体产物符合外泌体的粒度范围颗粒～100％，如图2c所示，峰型清晰。通过invitrogen试剂盒将外泌体从未转染的健康人原t淋巴细胞、car-t、jurkat细胞中提取。提取方法：将5x105细胞培养于透明六孔板，在标准条件下培养24h后，向jurkat细胞加入100u/ml的il-2刺激，再在24h后按试剂盒指引提取外泌体。并进行马尔文粒度仪测试对微粒大小进行确认。
46.实验方案-transwell，如图3a所示。
47.上腔：将1.0x105健康的jurkat细胞吹打，稀释于200μl的无血清rpmi培养基，种于24孔5um pc膜-transwell小室上腔内。在共聚焦显微镜下观察人源t淋巴细胞与jurkat细胞移动。测定多少jurkat细胞迁移至高浓度下室区域来测试外泌体对jurkat细胞的趋化作用。
48.实验结论：jurkat外泌体(19％)即实验组在transwell实验中表现出了明显的高于空对照组(0％)的促t淋巴细胞趋化作用(p＝0.03)，外泌体在无外泌体添加的情况下，jurkat在下室测得的细胞数量为0，如图3b所示，因此在无外泌体的情况下，jurkat细胞在无血清与外泌体刺激的培养基中短时间内被限制了迁移能力；而在添加外泌体实验中，jurkat外泌体显示了绝对高于空对照组的促趋化能力，并非由于血清饥饿造成的随机运动，如图3c所示。在transwell测试的现象表明，外泌体的促趋化作用并非由于外泌体释放膜内物质所引起，将外泌体共培养4h的无血清培养基上清提取，并用超滤管(截取值＝3k,pall)滤出不含外泌体，提取加入transwell下室，并未发现能促进jurkat向下室迁移(图3d)。
49.本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。