一种生物酶催化制备3,4-二羟基苯乙醇的方法与流程

1.本发明涉及一种生物酶催化制备3,4-二羟基苯乙醇的方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.3,4-二羟基苯乙醇，又名羟基酪醇，分子式c8h
10
o3，是一种天然多酚类化合物，发现于橄榄油和加工橄榄油产生的废水中，主要是以酯化物橄榄苦苷经过水解后可得到游离的3,4-二羟基苯乙醇，研究表明3,4-二羟基苯乙醇具有较强的抗氧化活性，另外，还具有多种生物和药理活性，可预防骨质疏松，有助于糖尿病、肥胖症等与线粒体功能失调相关疾病的治疗，并可降低该类疾病的发病率，广泛用于食品工业、营养保健和化妆品中。因此，3,4-二羟基苯乙醇的提取和制备具有一定的现实意义和较好的经济效益。
3.3,4-二羟基苯乙醇，传统制备方法是从橄榄油或橄榄叶中提取，提取过程中需要用到乙酸乙酯、无水乙醇、二氯甲烷等大量易燃易爆的有机试剂，提取的收率仅有8.4％，收率低，同时在提取过程中会含有较多的副产物，导致对羟基苯乙醇的纯度较低；目前常用的制备方法一般是通过合成制备，例如，肖艳、张杨等公开的羟基酪醇的合成方法，报道了以邻苯二酚和乙醛酸为原料，经3,4-二羟基扁桃酸合成3,4-二羟基苯乙醇，通过四步反应合成了3,4-二羟基苯乙醇，总收率为52.7％，收率较低；还有的制备方法是采用生物制备方法，例如，中国专利cn201710659225.1公开的一种工程菌及应用，报道了以l-氨基酸氧化酶，α-酮酸脱羧酶，醇脱氢酶，nad(p)还原酶四种酶共表达大肠杆菌，生物合成2-苯乙醇、酪醇、羟基酪醇，其中，3,4-二羟基苯乙醇产量为435mg/l，产量较低；中国专利cn201710659225.1公开的表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用，报道了构建的大肠杆菌含有并能够表达aro10、hpabc和ugt基因，重组大肠杆菌酪氨酸通过相关基因进行表达，获得3,4-二羟基苯乙醇，其产量可达401mg/l，产量较低。因此，为提高3,4-二羟基苯乙醇的产量、转化率，本发明提供了一种生物酶催化制备3,4-二羟基苯乙醇的方法。


技术实现要素：

4.针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种生物酶催化制备3,4-二羟基苯乙醇的方法，以诱导生产3,4-二羟基苯乙醇的菌株作为生物酶，对羟基苯乙醇作为底物，通过生物酶催化合成3,4-二羟基苯乙醇，催化效率高，无副产物，可用于大规模工业化生产。
5.为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种生物酶催化制备3,4-二羟基苯乙醇的方法，具体包括以下步骤：
6.s1、将诱导产酶的大肠杆菌发酵液进行离心处理，离心转速为2000～8000rpm/min，离心时间为1～10min，去除离心液，获得菌体；
7.s2、向步骤s1的菌体中加入缓冲液，使菌体悬浮，移至四口烧瓶内，然后进行磁力搅拌，搅拌转速为200～1200rpm/min，并进行水浴加热，加热温度为25～45℃，接着向菌体
悬浮液中通入氧气，实时控制ph；
8.s3、称取对羟基苯乙醇底物，并用少量缓冲液进行溶解混合均匀，后分多次加入四口烧瓶分内，并持续搅拌进行反应，后使用高效液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内没有对羟基苯乙醇底物时，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液冷藏保存；
9.s4、采用高效液相色谱检测分析步骤s3中反应液中的3,4-二羟基苯乙醇产物，获得3,4-二羟基苯乙醇的产量，达到13g/l以上，并获得3,4-二羟基苯乙醇的转化率，达到99％以上。
10.优选地，所述对羟基苯乙醇的添加总质量≤13.9g，且对羟基苯乙醇的添加总量控制在12.0～12.5g/l，所述对羟基苯乙醇的添加总量＝对羟基苯乙醇的添加总质量/缓冲液的总体积。
11.优选地，所述菌体的生物量为15～45g/m3。
12.优选地，每次对羟基苯乙醇的添加量为0.5～5g/30min。
13.优选地，所述大肠杆菌发酵液为大肠杆菌mg1655发酵液、大肠杆菌bl21(de3)发酵液或大肠杆菌bmga发酵液的一种。
14.优选地，所述缓冲液为pb缓冲液、pbs缓冲液或tris缓冲液的一种
15.优选地，所述通氧量为0.5～5l/min。
16.优选地，所述ph值为5.5～8.5。
17.优选地，所述冷藏保存的温度为4℃。
18.本发明的有益效果：本发明以对羟基苯乙醇底物，采用生物酶催化，生物合成得到3,4-二羟基苯乙醇，反应条件温和，无副产物，底物残留量少；本发明将对羟基苯乙醇的添加总质量控制在不大于13.9g，保证了生物酶具有较高的催化效率，使酶催化效率大于99％，并将对羟基苯乙醇的添加总量控制在12.0～12.5g/l，提高产物3,4-二羟基苯乙醇的产量，高达13.78g/l，并提高产物3,4-二羟基苯乙醇的转化率，高达99.4％；本发明的制备方法能够使羟基苯乙醇、生物酶、缓冲液得到最大化利用，不会造成资源浪费；同时本发明的制备方法绿色环保，反应周期短，可应用于大规模工业化生产，满足市场需。
附图说明
19.图1为本发明的3,4-二羟基苯乙醇生物合成路线图；
20.图2为本发明的对羟基苯乙醇的标准曲线图；
21.图3为本发明的3,4-二羟基苯乙醇标准曲线图；
22.图4为本发明实施例10获得的3,4-二羟基苯乙醇产物反应液的高效液相色谱图。
具体实施方式
23.为了对本发明作出更加清楚完整地说明，下面用具体实施例说明本发明，但并不是对发明的限制。
24.以下实施例中，采用大肠杆菌mg1655、大肠杆菌bl21(de3)或大肠杆菌bmga的一种用于本发明中的基因表达蛋白酶，大肠杆菌mg1655、大肠杆菌bl21(de3)或大肠杆菌bmga的构建方法与专利(表达羟基酪醇和羟基酪醇葡萄糖苷的大肠杆菌及构建方法及应用，
cn201610158902.7)报道一致。
25.构建的重组大肠杆菌置于培养液中进行过夜培养，以获得表达蛋白酶的大肠杆菌发酵培养液，培养过程如下：
26.一、将构建的重组大肠杆菌mg1655置于培养液中，该培养液包括胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，纯水定容至1.0l，在37℃、ph7.0的条件下进行过夜培养，得到大肠杆菌mg1655发酵液。
27.二、将构建的大肠杆菌bl21(de3)置于培养液中，该培养液包括胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，纯水定容至1.0l，在37℃、ph7.0的条件下进行过夜培养，得到大肠杆菌bl21(de3)发酵液。
28.三、将构建的大肠杆菌bmga置于培养液中，该培养液包括胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，nacl 10g，纯水定容至1.0l，在37℃、ph7.0的条件下进行过夜培养，得到大肠杆菌bmga发酵液。
29.通过上述获得大肠杆菌mg1655发酵液、大肠杆菌bl21(de3)发酵液或大肠杆菌bmga发酵液，获得的上述大肠杆菌的基因表达蛋白酶，用于下列实施例中。
30.实施例1
31.(1)将诱导产酶的大肠杆菌mg1655发酵液置于离心管，在转速2000rpm/min的离心机中离心3min，去除离心清液，收集菌体；
32.(2)向菌体中加入90ml pb缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为15g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速200rpm/min、温度25℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量0.5l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值5.5；
33.(3)称取对羟基苯乙醇底物0.5g，溶于10ml pb缓冲液中，完全溶解后，以0.5g/30min一次滴加四口烧瓶内，并持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
34.实施例2
35.(1)将诱导产酶的大肠杆菌mg1655发酵液置于离心管，在转速2000rpm/min的离心机中离心3min，去除离心清液，收集菌体；
36.(2)向菌体中加入40ml pb缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为42g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速200rpm/min、温度25℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量0.5l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值5.5；
37.(3)称取对羟基苯乙醇底物0.5g，溶于1.5ml pb缓冲液中，完全溶解混匀后，以0.5g/30min分一次滴加四口烧瓶内，并持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
38.实施例3
39.(1)将诱导产酶的大肠杆菌mg1655发酵液置于离心管，在转速2000rpm/min的离心机中离心3min，去除离心清液，收集菌体；
40.(2)向菌体中加入250ml pb缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为15g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速200rpm/min、温度25℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌
体悬浮液中以通氧量0.5l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值5.5；
41.(3)称取对羟基苯乙醇底物3.25g，溶于20ml pb缓冲液中，完全溶解混匀后，以0.65g/30min分五次滴加四口烧瓶内，并持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
42.实施例4
43.(1)将诱导产酶的大肠杆菌bl21(de3)发酵液置于离心管，在转速2000rpm/min的离心机中离心3min，去除离心清液，收集菌体；
44.(2)向菌体中加入350ml pb缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为40g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速500rpm/min、温度25℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量1l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值8.5；
45.(3)称取对羟基苯乙醇底物4.45g，溶于10ml pb缓冲液中，完全溶解混匀后，以0.89g/30min分五次滴加四口烧瓶内，并持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
46.实施例5
47.(1)将诱导产酶的大肠杆菌bmga发酵液置于离心管，在转速3000rpm/min的离心机中离心3min，去除离心清液，收集菌体；
48.(2)向菌体中加入500ml pb缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为20g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速500rpm/min、温度25℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量2l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值6.6；
49.(3)称取对羟基苯乙醇底物6.2g，溶于10ml pb缓冲液中，完全溶解混匀后，以3.1g/30min分两次滴加四口烧瓶内，并持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
50.实施例6
51.(1)将诱导产酶的大肠杆菌bmga发酵液置于离心管，在转速4000rpm/min的离心机中离心5min，去除离心清液，收集菌体；
52.(2)向菌体中加入700ml tris缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为20g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速500rpm/min、温度25℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量4l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值6.5；
53.(3)称取对羟基苯乙醇底物8.5g，溶于8ml tris缓冲液中，完全溶解混匀后，以4.25g/30min分两次滴加四口烧瓶内，并持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
54.实施例7
55.(1)将诱导产酶的大肠杆菌bl21(de3)发酵液置于离心管，在转速6000rpm/min的离心机中离心7min，去除离心清液，收集菌体；
56.(2)向菌体中加入880ml pbs缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为35g/m3，后倒入
四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速800rpm/min、温度45℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量5l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值7.2；
57.(3)称取对羟基苯乙醇底物10.8g，溶于20ml pbs缓冲液中，完全溶解混匀后，以1.08g/30min分十次滴加四口烧瓶内，并持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
58.实施例8
59.(1)将诱导产酶的大肠杆菌mg1655发酵液置于离心管，在转速8000rpm/min的离心机中离心9min，去除离心清液，收集菌体；
60.(2)向菌体中加入1000mlpbs缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为40g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速1000rpm/min、温度35℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量3.1l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值8.5；
61.(3)称取对羟基苯乙醇底物12.24g，溶于10ml pbs缓冲液中，完全溶解混匀后，以2.04g/30min分六次滴加四口烧瓶内，持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
62.实施例9
63.(1)将诱导产酶的大肠杆菌bl21(de3)发酵液置于离心管，在转速8000rpm/min的离心机中离心10min，去除离心清液，收集菌体；
64.(2)向菌体中加入1100mltris缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为45g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速1200rpm/min、温度27℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量5l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值6.3；
65.(3)称取对羟基苯乙醇底物13.9g，溶于16ml tris缓冲液中，完全溶解混匀后，以1.7375g/30min分八次滴加四口烧瓶内，持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
66.实施例10
67.(1)将诱导产酶的大肠杆菌bl21(de3)发酵液置于离心管，在转速8000rpm/min的离心机中离心10min，去除离心清液，收集菌体；
68.(2)向菌体中加入1100mltris缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为45g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速1200rpm/min、温度27℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量5l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值6.4；
69.(3)称取对羟基苯乙醇底物14g，溶于16ml tris缓冲液中，完全溶解混匀后，以1.75g/30min分八次滴加四口烧瓶内，持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
70.实施例11
71.(1)将诱导产酶的大肠杆菌bl21(de3)发酵液置于离心管，在转速8000rpm/min的离心机中离心10min，去除离心清液，收集菌体；
72.(2)向菌体中加入1250mltris缓冲液，使菌体悬浮，菌体的生物量为60g/m3，后倒入四口烧瓶内，再将四口烧瓶放入转速1200rpm/min、温度27℃的磁力搅拌水浴锅内，接着向菌体悬浮液中以通氧量6l/min通入氧气，并用氨水实时调控ph值6.4；
73.(3)称取对羟基苯乙醇底物15.2g，溶于16ml tris缓冲液中，完全溶解混匀后，以1.9g/30min分八次滴加四口烧瓶内，持续搅拌进行反应，后通过液相检测反应液中的对羟基苯乙醇底物，当反应液内无对羟基苯乙醇底物，停止搅拌并关闭通气，使反应停止，获得3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，反应液置于温度4℃下进行冷藏保存。
74.测定例
75.(1)对羟基苯乙醇的标准曲线绘制
76.称取对羟基苯乙醇底物标准样0.1g，移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，后取0.5ml、1ml、2ml、4ml、6ml、8ml分别移至6个10ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，分别获得浓度为0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.8g/l、1.2g/l、1.6g/l，分别通过高效液相色谱仪进行检测，色谱条件：色谱柱为c18，流动相a为0.1％乙酸水，流动相d为甲醇，流动相a：流动相d(v:v)＝80：20，流速：1ml/l，柱温：35℃，波长：276nm，进样体积：10μl，保留时间：18min，对羟基苯乙醇出峰时间约为13min，以浓度(g/l)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制对羟基苯乙醇标准曲线，结果如图2所示，y＝7
×
106x-17381，r2＝1(r2是线性拟合常数)。
77.(2)3,4-二羟基苯乙醇的标椎曲线绘制
78.称取3,4-二羟基苯乙醇标准样0.1g，移至50ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，0.5ml、1ml、2ml、4ml、6ml、8ml分别移至6个10ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，分别获得浓度为0.1g/l、0.2g/l、0.4g/l、0.8g/l、1.2g/l、1.6g/l的标准样品，分别通过高效液相色谱仪进行检测，色谱条件与本测定例中上述(1)中的色谱条件一致，3,4-二羟基苯乙醇出峰时间约为7.5min，以浓度(g/l)为横坐标、峰面积为纵坐标，绘制3,4-二羟基苯乙醇标准曲线，结果如图3所示，y＝1
×
107x 14745，r2＝0.9999(r2是线性拟合常数)。
79.(3)实施例1至实施例11的3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液的测定
80.分别取2ml实施例1至实施10获得的3,4-二羟基苯乙醇产物的反应液，离心后，再分别取上清液1ml，并分别移至10个10ml容量瓶中，用甲醇稀释定容，再经高效液相色谱检测分析，色谱条件与本测定例中上述(1)中的色谱条件一致，出峰时间约为7.5min，色谱图如4所示，且该图4是实施例10获得的产物反应液的色谱图。获得如下表所示的3,4-二羟基苯乙醇的产量、转化率，其产量根据3,4-二羟基苯乙醇标准曲线获得，本发明的转化率＝产物实际产量/产物理论产量，产物理论产量＝底物添加总量/底物相对分子质量
×
产物相对分子质量，底物添加总量＝底物添加总质量/(菌体悬浮的缓冲液体积 底物溶解的缓冲液体积)。
81.表3,4-二羟基苯乙醇的产量、转化率
[0082][0083]
从上表可以看出，实施例2至实施例9的对羟基苯乙醇的添加总质量不大于13.9g，且对羟基苯乙醇的添加总量控制在12.0～12.5g/l，使生物酶的催化效率较高，达到99％，使3,4-二羟基苯乙醇的转化率较高，大于99％，3,4-二羟基苯乙醇的产量较高，大于13g/l，对羟基苯乙醇、生物酶都具有很好的利用率；虽然实施例1的生物酶催化效率达到99％，但实施例1中对羟基苯乙醇的添加总量小于12.0g/l，得到的3,4-二羟基苯乙醇的实际产量也小于13g/l，即缓冲液体积用量较大，造成的缓冲液浪费；实施例10的对羟基苯乙醇的添加总质量大于13.9g，且对羟基苯乙醇的添加总量也超过12.5g/l，但是生物酶催化效率仍然降低，3,4-二羟基苯乙醇的转化率也降低，小于99％，也就说明了，对羟基苯乙醇的添加过量，会降低生物酶催化效率，影响3,4-二羟基苯乙醇的转化率和产量；虽然实施例11的对羟基苯乙醇的添加总量控制在12.0～12.5g/l，使3,4-二羟基苯乙醇的实际产量能够达到13g/l，但是对羟基苯乙醇的添加总质量大于13.9g，3,4-二羟基苯乙醇的转化率小于99％，虽然也增加生物酶的用量，但是生物酶催化效率仍然降低，也很好的说明了对羟基苯乙醇的添加过量会影响生物酶催化效率，进而降低3,4-二羟基苯乙醇的转化率和产量。
[0084]
综上所述，本发明将对羟基苯乙醇的添加总质量控制在≤13.9g，且对羟基苯乙醇的添加总量控制在12.0～12.5g/l，生物酶能够获得较大的酶催化效率，达到99％，使3,4-二羟基苯乙醇的转化率大于99％，3,4-二羟基苯乙醇的产量13g/l，进而使对羟基苯乙醇、生物酶、缓冲液得到最大化利用，不会造成资源浪费。
[0085]
最后应说明的是，以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域技术人员应当理解，依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。