转基因马铃薯AM04-1020特异性实时荧光PCR检测引物、探针、方法和试剂盒与流程

转基因马铃薯am04-1020特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒
技术领域
1.本发明属于转基因产品检测领域，具体涉及转基因马铃薯am04-1020实时荧光pcr检测引物探针、方法和试剂盒。


背景技术：

2.目前国外上市的转基因马铃薯约47种(isssa数据)，目前国外上市的品系中，仅欧盟建立的eh92-527-1品系品系特异性检测方法：savini c.,foti n.,mazzara m.,charles delobelc.,van den eede g.；"event-specific method for the quantification of event eh92-527-1potatousing real-time pcr-validation report and protocol-sampling and dna extraction of potato" online publication(2006)；此外，高宏伟等建立的一种未上市马铃薯品系av43-6-g7检测方法：(gao h,yu x,deng t,et al.event-specific detection of transgenic potato av43-6-g7 usingreal-time and digital pcr methods[j].bmc biotechnology,2016,16(1):74.)。尚未有马铃薯其他转基因品系的品系特异性实时荧光pcr检测方法的文献。
[0003]
支链淀粉马铃薯am04-1020是由马铃薯品种库拉斯(kuras)采用rna干扰技术研发的降低颗粒结合的淀粉合酶的表达转基因马铃薯品系。am04-1020马铃薯显著降低了直链淀粉的水平，使支链淀粉含大于98％；同时其转入编码乙酰羟酸合酶的csr1-2基因(咪唑啉酮类除草剂耐受)用作组织培养过程中的筛选基因。
[0004]
与另一种转基因马铃薯品系eh92-527-1通过反义技术单独下调粒状淀粉合酶(bgss) (wo 92/11376，ep0563 189)而产生支链淀粉型淀粉不同，am04-1020通过基因遗传工程方法，通过同时rna干扰下调三个可溶性淀粉合酶基因(granule-bound starch synthasegene,ss)使直链淀粉含量降低生产支链淀粉型淀粉，并且am04-1020转基因品种的峰值粘度(淀粉的粘度)降至野生型马铃薯品种的70％，而eh92-527-1品系与非转基因马铃薯流行品种相比，峰值粘度不变。
[0005]
目前对转基因产品多数国家均采用相应的标识管理制度，标识管理制度的建立和实施依赖于有效准确的检测鉴定技术。针对转基因马铃薯am04-1020构建特异性实时pcr检测方法。
[0006]
目前欧盟等其他国家和地区均尚无转基因马铃薯am04-1020特异性实时荧光pcr检测方法。
[0007]


技术实现要素：

[0008]
本发明的目的是提供一种特异性好、灵敏度高、稳定性强，快速准确鉴别转基因马铃薯 am04-1020特异性实时荧光pcr检测引物、探针、方法和试剂盒。
[0009]
本发明的第一个目的是提供一种转基因马铃薯am04-1020特异性实时荧光pcr检测引物组，包括检测引物和检测探针：
[0010]
所述的检测引物如下所示：
[0011]
am04-1020-5f2：5
’‑
atttttcatccacatttaaatttattag-3’(如seq id no.1所示)；
[0012]
am04-1020-5r2：5
’‑
tggtcatagctgtttcctactagatc-3’(如seq id no.2所示)；
[0013]
所述的检测探针如下所示：
[0014]
am04-1020-5p2：5
’‑
ttcgcaaacactgatagtttaaactgaagg-3’(如seq id no.3 所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
[0015]
所述的荧光报告基团优选为vic，所述的荧光淬灭基团优选为bhq1。
[0016]
本发明的第二个目的是提供一种转基因马铃薯am04-1020特异性实时荧光pcr检测试剂盒，包括实时荧光定量pcr反应液、耐热dna聚合酶、检测引物和检测探针：
[0017]
所述的检测引物如下所示：
[0018]
am04-1020-5f2：5
’‑
atttttcatccacatttaaatttattag-3’(如seq id no.1所示)；
[0019]
am04-1020-5r2：5
’‑
tggtcatagctgtttcctactagatc-3’(如seq id no.2所示)；
[0020]
所述的检测探针如下所示：
[0021]
am04-1020-3p：5
’‑
ttcgcaaacactgatagtttaaactgaagg-3’(如seq id no.3 所示)，探针的5’端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团。
[0022]
本发明的第三个目的是提供一种转基因马铃薯am04-1020特异性实时荧光pcr检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
[0023]
(1)提取待测样品的基因组dna作为模板；
[0024]
(2)加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系；
[0025]
(3)将扩增反应体系在荧光pcr仪上进行实时荧光pcr反应，反应结束后，根据扩增曲线判断样品是否为am04-1020转基因马铃薯。
[0026]
优选，所述的步骤(3)的根据扩增曲线判断样品是否为转基因马铃薯am04-1020的标准为：如果扩增曲线有典型荧光扩增曲线，则说明样品为转基因马铃薯am04-1020；如果扩增曲线无典型荧光扩增曲线，则说明样品不是am04-1020转基因马铃薯。
[0027]
优选，所述的步骤(2)的扩增反应体系为：25μl，包括premix ex taq 12.5μl，roxreference dye ii 0.2μl，10μmol/l检测引物am04-1020-5f2 0.5μl，10μmol/l检测引物 am04-1020-5r2 0.5μl，10μmol/l检测探针am04-1020-3p 0.5μl，dna模板2μl和ddh2o 8.8μl；所述的步骤(3)的实时荧光pcr反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34 s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
[0028]
本发明的第四个目的是提供一种转基因马铃薯am04-1020特异性实时荧光pcr定量检测方法，包括以下步骤：
[0029]
(1)提取转基因马铃薯am04-1020的基因组dna进行梯度稀释以用作不同起始浓度的模板，分别加入上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光pcr仪上进行实时荧光pcr反应；
[0030]
(2)反应后得到各起始浓度模板对应的ct值，该ct值与起始模板量的常用对数(lg) 呈线性关系，据此得到该线性范围内am04-1020转基因马铃薯的标准曲线；
[0031]
(3)提取待测样品的基因组dna为模板，加入与步骤(1)中相同体系的上述的检测引物和检测探针，与实时荧光定量pcr反应液及耐热dna聚合酶混合形成扩增反应体系，在荧光pcr仪上进行实时荧光pcr反应，反应后得到ct值，将其代入步骤(2)获得的转基因马铃
薯am04-1020的标准曲线方程，计算得到待测样品中转基因马铃薯am04-1020基因组dna的含量(拷贝数或质量)。
[0032]
优选，所述的步骤(1)的扩增反应体系为：25μl，包括premix ex taq 12.5μl，roxreference dye ii 0.2μl，10μmol/l检测引物am04-1020-5f2 0.5μl，10μmol/l检测引物 am04-1020-5r2 0.5μl，10μmol/l检测探针am04-1020-3p 0.5μl，dna模板2μl和ddh2o 8.8μl；所述的步骤(1)的实时荧光pcr反应，其反应程序为95℃30s；95℃5s、60℃34 s，40个循环，于60℃收集荧光信号。
[0033]
本发明针对转基因马铃薯am04-1020特异性序列设计引物和taqman探针，建立转基因马铃薯am04-1020实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)检测方法，利用该检测引物和检测探针，按照本发明的方法进行检测发现其定量检测下限为0.025％，建立的标准曲线线性相关系数(r2)为0.99，扩增效率e为94.39％，重复性实验显示本方法的标准偏差(sd)及相对标准偏差(rsd)都在可接受范围内，特异性良好、灵敏度高、稳定性强，可满足监管部门和公众对转基因马铃薯am04-1020进行品系特异性检测鉴定的需求。
附图说明
[0034]
图1是转基因马铃薯am04-1020特异性检测方法特异性实验结果，阳性扩增为转基因马铃薯am04-1020；阴性扩增分别为：转基因马铃薯eh92-527-1、非转基因马铃薯、转基因玉米mir162、转基因苜蓿j163
×
j101、转基因大豆das44406-4、转基因大豆das81419-2、转基因大豆das68416、转基因大豆gts40-3-2、转基因油菜mon88302、转基因油菜dp073496-4、转基因玉米mon98034、转基因棉花mon15985-7、非转基因大米、小麦、非转基因甜菜和空白对照。
[0035]
图2是转基因马铃薯am04-1020特异性检测灵敏度试验扩增图；从左至右1～7分别为： 10％、2.5％、0.5％、0.25％、0.05％、0.025％和0.01％(对应拷贝数2777.70copies/μl、694.43 copies/μl、138.89copies/μl、69.44copies/μl、13.89copies/μl、6.94copies/μl、2.78copies/μl，以马铃薯基因组重量1.8pg计)。
[0036]
图3是实时荧光pcr检测am04-1020转基因马铃薯的标准曲线。
具体实施方式
[0037]
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0038]
主要材料：转基因马铃薯am04-1020、转基因马铃薯eh92-527-1、非转基因马铃薯、转基因玉米mir162、转基因苜蓿j163
×
j101、转基因大豆das44406-4、转基因大豆 das81419-2、转基因大豆das68416、转基因大豆gts40-3-2、转基因油菜mon88302、转基因油菜dp073496-4、转基因玉米mon98034、转基因棉花mon15985-7、非转基因大米、小麦、非转基因甜菜为本实验室购置储备。
[0039]
选择马铃薯光诱导组织特异性st-ls1(light-inducible tissue-specific，st-ls1)引物 ls1-f/r和探针ls1-p用于检测样品基因组dna是否成功提取以及是否适于进行实时荧光 pcr扩增；其序列信息详见表1。
[0040]
主要试剂：primex ex taq(2
×
)for qpcr，大连宝生物；dna提取试剂盒，北京天根
3p (具体引物序列见表1)对所有提取的样品的dna进行实时荧光pcr时，只有阳性样品 am04-1020的dna模板有典型荧光扩增曲线，以其他农作物材料dna为模板的均无典型荧光扩增曲线(图1)。表明本发明的检测方法特异性良好。
[0052]
实施例3：灵敏度测试、可重复性测试及标准曲线建立
[0053]
将提取的am04-1020转基因马铃薯dna溶液加te缓冲液分别稀释至10％、2.5％、0.5％、 0.25％、0.05％、0.025％和0.01％(对应拷贝数2777.70copies/μl、694.43copies/μl、138.89 copies/μl、69.44copies/μl、13.89copies/μl、6.94copies/μl、2.78copies/μl，以马铃薯基因组重量1.8pg计)作为dna模板，进行am04-1020转基因马铃薯实时荧光pcr检测，进行线性范围测试及可重复性测试，每个样品进行3次重复实验，水为空白对照，实时荧光pcr 检测反应体系和反应程序同实施例1。测试结果显示(表2和图2)，在10％、2.5％、0.5％、0.25％、0.05％、0.025％范围内1-6的6个浓度梯度3个平行均能有典型扩增曲线(图2)；此外，表2中1-6个浓度各3个平行所得ct值的sd介于0.43～2.19，rsd介于1.15％～7.74％，均小于25％，显示重复性良好，loq为0.025％。6个浓度的对数值与所得ct值建立标准曲线(图3)，线性回归方程为：y＝-3.464x 39.99(r2＝0.9915)，扩增效率为94.39％(介于 90％～110％)，表明其线性相关性良好，扩增效率较高。
[0054]
表2实时荧光pcr方法的灵敏度及可重复性测试
[0055][0056]
本发明针对转基因马铃薯am04-1020品系特异性序列设计引物和探针，建立的转基因马铃薯am04-1020特异性实时荧光pcr检测方法，可对am04-1020转基因马铃薯进行特异性快速、高通量的定性及定量检测，满足检测、监管部门对其进行标识的需求。