医学和诊断学中的HLA-H的制作方法

医学和诊断学中的hla-h
1.本发明涉及用作免疫抑制剂、肿瘤疫苗或妊娠促进剂的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其组合，其中(i)所述核酸分子是(a)编码包含或由seq id no:1的氨基酸序列组成的多肽；或(b)由seq id no:2的核苷酸序列组成；或(c)编码与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％相同性的多肽；或(d)由与seq id no:2的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％相同性的核苷酸序列组成；或(e)由相对于(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成；或(f)上述(a)至(e)任一项的核酸分子的片段，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸核苷酸；或(g)对应于(a)至(f)任一项的核酸分子，其中t被u置换；(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)将所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；及(iv)所述蛋白质或肽由(i)的核酸分子编码。
2.在本说明书中，引用了许多文件，包括专利申请和制造商手册。这些文件的公开虽然被认为与本发明的可专利性无关，但通过引用将其全部内容并入本文。更具体地，所有参考文件均以引用方式并入，其程度与每个单独文件被具体和独自指明以引用方式并入的程度相同。
3.人类白细胞抗原(hla)系统或复合物是编码人类中的主要组织相容性复合物(mhc)蛋白质的基因复合物。这些细胞表面蛋白质负责调节人类的免疫系统。hla基因复合物位于染色体6p21内的3mbp序列段(stretch)上。该复合物中的基因分为三个基本组：i类、ii类和iii类。
4.人类有三种主要的mhc i类基因，即hla-a、hla-b和hla-c。由这些基因产生的蛋白质存在于几乎所有细胞的表面上。在细胞表面上，这些蛋白质与从细胞内输出的蛋白质片段(肽)结合。mhc i类蛋白质向免疫系统展示这些肽。如果免疫系统将肽识别为外来肽(如病毒或细菌肽)，它通过触发受感染细胞自我毁灭而应答。
5.人类有六种主要的mhc ii类基因：hla-dpa1、hla-dpb1、hla-dqa1、hla-dqb1、hla-dra和hla-drb1。mhc ii类基因为制造几乎只存在于某些免疫系统细胞表面的蛋白质提供指令。与mhc i类蛋白质一样，这些蛋白质向免疫系统展示肽。
6.mhc iii类基因产生的蛋白质具有一些不同的功能；它们参与炎症和其它免疫系统活性。一些mhc基因的功能尚不清楚。
7.hla基因有许多可能的变异，允许每个人的免疫系统对各种外来入侵者作出反应。一些hla基因有数百个已鉴别的版本(等位基因)，每个版本都有一个特定的编号(如hla-b27)。密切相关的等位基因被分类在一起；例如，至少有40个非常相似的等位基因是hla-b27的亚型。这些亚型被命名为hla-b*2701至hla-b*2743。
8.已有100多种疾病与hla基因的不同等位基因有关。例如，hla-b27等位基因增加了患一种叫做强直性脊柱炎的炎症性关节病的风险。许多其它涉及免疫功能异常的疾病和某些形式的癌症也与特定的hla等位基因有关。然而，经常不清楚hla基因在这些疾病的发病风险中扮演什么角色。
9.在三个主要mhc i类基因邻近，非经典的mhc i类分子hla-e、hla-f和hla-g由hla i类区域编码。hla-g、hla-e和hla-f的过表达是多种恶性肿瘤中常见的发现(kochan等,oncoimmunology.2013nov 1；2(11):e26491.)。据报道，hla-g和hla-e是癌症生物标志物，并且与癌症的不良临床结果呈正相关。
10.此外，据报道，hla i类区域包括i类假基因(hughes,mol biol evol.1995mar；12(2):247-58)以及基因片段。例如，hla-h、j、k和l被归类为i类假基因，而hla-n、s和x被归类为基因片段。
11.因此，人白细胞抗原(hla)基因作为生物医学科学和治疗的重要靶位有着悠久的研究历史。然而，鉴于hla系统的临床重要性，仍然需要重点研究hla基因，特别是基于hla系统鉴别生物医学科学和治疗的进一步靶位。本发明解决了这种需要。结合本发明，令人惊讶地发现hla-h是治疗和检测疾病的靶位，特别是通过激活或抑制hla-h的活性进行治疗和检测。
12.因此，本发明在第一方面涉及用作免疫抑制剂、肿瘤疫苗或妊娠促进剂的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其组合，其中(i)所述核酸分子是(a)编码包含或由seq id no:1的氨基酸序列组成的多肽；或(b)由seq id no:2的核苷酸序列组成；或(c)编码与seq id no:1的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％相同性的多肽；或(d)由与seq id no:2的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％相同性的核苷酸序列组成；或(e)由相对于(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成；或(f)上述(a)至(e)任一项的核酸分子的片段，所述片段包含至少150个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸核苷酸；或(g)对应于(a)至(f)任一项的核酸分子，其中t被u置换；(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；及(iv)所述蛋白质或肽由(i)的核酸分子编码。
13.本发明的第一方面同样涉及用作免疫抑制剂、肿瘤疫苗或妊娠促进剂的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其组合，其中(i)所述核酸分子(a)编码包含或由seq id no:1或54的氨基酸序列组成的多肽；或(b)由seq id no:2的核苷酸序列组成；或(c)编码与seq id no:1或54的氨基酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％相同性的多肽；或(d)由与seq id no:2的核苷酸序列具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％、最优选至少95％相同性的核苷酸序列组成；或(e)由相对于(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成；或(f)是上述(a)至(e)任一项的核酸分子的片段，所述片段包含至少250个核苷酸，优选至少300个核苷酸，更优选至少450个核苷酸，最优选至少600个核苷酸；或(g)对应于(a)至(f)任一项的核酸分子，其中t被u置换；(ii)所述载体包含(i)的核酸分子；(iii)所述宿主细胞用(ii)的载体转化、转导或转染；及(iv)所述蛋白质或肽由(i)的核酸分子编码。
14.根据本发明，术语“核酸分子”包括dna，例如cdna或双链或单链基因组dna和rna。在这方面，“dna”(脱氧核糖核酸)是指称作核苷酸碱基的化学构建模块腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和胸腺嘧啶(t)的任何链或序列，其在脱氧核糖主链上连接在一起。dna可以具有一条核苷酸碱基链，或两条可以形成双螺旋结构的互补链。“rna”(核糖核酸)是指称作核苷酸碱基的化学构建模块腺嘌呤(a)、鸟嘌呤(g)、胞嘧啶(c)和尿嘧啶(u)的任何链或序
列，其在核糖主链上连接在一起。rna通常具有一条核苷酸碱基链，例如mrna。还包括单链和双链杂合分子，即dna-dna、dna-rna和rna-rna。核酸分子也可以通过本领域已知的许多方式进行修饰。这种修饰的非限制性实例包括甲基化、“加帽”、用类似物取代一个或多个天然存在的核苷酸，以及核苷酸间修饰例如不带电荷的键(例如膦酸甲酯、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)和带电荷的键(例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)的那些修饰。核酸分子，在下文中也称为多核苷酸，可以包含一个或多个另外的共价连接部分，例如蛋白质(例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚-l-赖氨酸等)、嵌入剂(例如吖啶、补骨脂素等)、螯合剂(例如金属、放射性金属、铁、氧化金属等)和烷基化剂。多核苷酸可以通过形成甲基或乙基磷酸三酯或烷基氨基磷酸酯键来衍生。进一步包括本领域已知的核酸模拟分子，例如dna或rna的合成或半合成衍生物及混合的聚合物。根据本发明的这种核酸模拟分子或核酸衍生物包括硫代磷酸酯核酸、氨基磷酸酯核酸、2
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o-甲氧基乙基核糖核酸、吗啉代核酸、己糖醇核酸(hna)、肽核酸(pna)和锁核酸(lna)(见braasch and corey,chem biol 2001,8:1)。lna是一种rna衍生物，其中核糖环受到2
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氧和4
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碳之间的亚甲基键的约束。还包括含有修饰碱基的核酸，例如硫代尿嘧啶、硫代鸟嘌呤和氟尿嘧啶。核酸分子通常携带遗传信息，包括细胞机制用来产生蛋白质和/或多肽的信息。根据本发明的核酸分子可以另外包含启动子、增强子、应答元件、信号序列、多腺苷酸化序列、内含子、5
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和3
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非编码区等。
15.根据本发明的核酸分子编码衍生自seq id no:1或54的hla-h蛋白质的多肽或其片段，所述蛋白质由seq id no:2编码。因此优选根据本发明的核酸分子是基因组dna或mrna。在mrna的情况下，核酸分子可以另外包含poly-a尾。
16.如本文所用，术语“蛋白质”可与术语“多肽”互换使用，描述了含有至少50个氨基酸的氨基酸的线性分子链，包括单链蛋白质或其片段。如本文所用，术语“肽”描述了由至多49个氨基酸组成的一组分子，如本文所用，术语“多肽”(也称为“蛋白质”)描述了由至少50个氨基酸组成的一组分子。如本文所用，术语“肽”描述了由至少15个氨基酸、至少20个氨基酸、至少25个氨基酸和至少40个氨基酸优选性递增组成的一组分子。通过使用术语“(多)肽”来统称肽和多肽组。(多)肽可以进一步形成由至少两个相同或不同分子组成的寡聚体。这种多聚体的相应高级结构相应地称为同源或异源二聚体、同源或异源三聚体等。seq id no:1的hla-h蛋白质在93、127、229和285位置包含半胱氨酸，因此包含潜在的二聚位点。类似地，seq id no:54的hla-h蛋白质在89、124、225和281位置包含半胱氨酸，因此包含潜在的二聚位点。此外，本发明还涵盖其中氨基酸和/或肽键已被功能类似物置换的这种蛋白质/(多)肽的模拟肽。这种功能类似物包括除了20种基因编码的氨基酸之外的所有已知氨基酸，例如硒代半胱氨酸。术语“(多)肽”和“蛋白质”也指天然修饰的(多)肽和蛋白质，其中所述修饰是例如通过糖基化、乙酰化、磷酸化和本领域熟知的类似修饰实现的。
17.根据本发明，术语“序列相同性百分比(％)”描述了与两个或多个比对的核酸或氨基酸序列与构成模板核酸或氨基酸序列全长的核苷酸或氨基酸残基的数目相比相同的核苷酸/氨基酸的匹配(“命中”)数。换言之，当使用本领域已知的序列比较算法测量在比较窗口上或在的指定区域上比较和比对(子)序列以获得最大对应性时，或当手动比对和目视检查时，使用比对方法可以确定两个或更多个序列或子序列的相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比(例如70％、75％、80％、85％、90％或95％相同性)。这个定义也适用于要比对的任何序列的互补序列。
18.与本发明相关的核苷酸和氨基酸序列分析和比对优选使用ncbi blast算法进行(stephen f.altschul,thomas l.madden,alejandro a.jinghui zhang,zheng zhang,webb miller,and david j.lipman(1997),nucleic acids res.25:3389-3402)。blast可用于核苷酸序列(核苷酸blast)和氨基酸序列(蛋白质blast)。技术人员知道比对核酸序列的其它合适程序。
19.如本文所定义，本发明设想至少70％、优选至少80％、更优选至少90％和最优选至少95％相同的序列相同性。然而，本发明还设想逐步更优选的至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％和至少99.8％的序列相同性。
20.mhc i类分子通常由两条链组成：mhcα链(重链)和β2-微球蛋白质链(轻链)。只有α链跨越膜。所述α链具有三个细胞外结构域(称为α1、2和3，α1位于n末端)。据认为hla-h的α链结构域α1和α3主要决定了hla-h的免疫抑制能力，其中α3结构域最为重要。值得注意的是，hla-h包含只有13个氨基酸的截短的α3结构域，而其它hla类别的α3结构域具有大约93个氨基酸。seq id no:3和4的核苷酸序列分别编码hla-h的结构域α1和α3。seq id no:5和6的氨基酸序列分别是hla-h的α1和α3结构域的氨基酸序列。
21.因此优选地，与seq id no:2的核苷酸序列具有至少70％相同性或任一优选的更高相同性的核苷酸序列包含与seq id no:4具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的核苷酸序列。也优选的是，与seq id no:2的核苷酸序列具有至少70％相同性或任一优选的更高相同性的核苷酸序列编码与seq id no:6具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的氨基酸序列。更优选地，与seq id no:2的核苷酸序列具有至少70％相同性或任一优选的更高相同性的核苷酸序列包含与seq id no:4具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的核苷酸序列，和/或包含与seq id no:3具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的核苷酸序列。还更优选地，与seq id no:2的核苷酸序列具有至少70％相同性或任一优选的更高相同性的核苷酸序列编码与seq id no:6具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的氨基酸序列，和/或编码与seq id no:5具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的氨基酸序列。
22.最优选地，与seq id no:2的核苷酸序列具有至少70％相同性或任一优选的更高相同性的核苷酸序列包含(i)与seq id no:4具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的核苷酸序列，及(ii)与seq id no:3具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的核苷酸序列。
23.与seq id no:1具有至少95％相同性的氨基酸序列的一个特别优选的实例是seq id no:54的氨基酸序列。seq id no:54缺少seq id no:1的前4个氨基酸，但在其它方面与seq id no:1相同。已经发现seq id no:1的前4个氨基酸对于hla-h蛋白质的功能并不重要。因此，seq id no:54也可以替代或补充seq id no:1作为本文所述的任何实施方案中的hla-h多肽的供选序列。
24.根据本发明，术语“简并”是指遗传密码的简并。简并的结果是因为一个三联体密
码指定了20个氨基酸和一个终止密码子，并且因为存在用于编码遗传信息的四个碱基，需要三联体密码子产生至少21个不同的密码。三联体中碱基的可能的43可能性给出了64个可能的密码子，这意味着一定存在一些简并性。因此，一些氨基酸由不止一个三联体编码，即多达六个。简并起因于三联体中第三个位置的变化。这意味着具有与上述不同的核苷酸序列但仍编码相同多肽的核酸分子属于本发明的范围内。关于本发明的第一方面，技术人员因此理解如(i)(e)项中所述的“(e)由相对于(d)的核酸分子简并的核苷酸序列组成”描述了这样的“核酸分子”，其编码与(i)(d)项的核酸分子相同的氨基酸序列的核酸分子。这个氨基酸序列是seq id no:1或54的氨基酸序列或源自其的序列，所述后者的氨基酸序列与seq id no:1或54至少在主要的实施方案的(i)(d)项中列举的序列相同性数值所要求和暗示的程度上是相同的。
25.根据本发明第一方面的(i)(a)至(f)任一项的核酸分子的片段包含至少150个核苷酸。在这点上，逐步增加优选性的根据本发明的片段是至少200、至少250、至少300、至少350、至少400、至少450、至少500、至少550、至少600或至少650个核苷酸的多核苷酸，最优选所述片段是仅缺少5
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atp起始密码子和/或3
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tag终止密码子的片段。此外，优选所述片段包含与seq id no:4具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的核苷酸序列，或编码与seq id no:6具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的氨基酸序列。更优选地，所述片段包含与seq id no:4具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的核苷酸序列，和/或与seq id no:3具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的逐步增加优选性的核苷酸序列。类似地，更优选所述片段编码与seq id no:6具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的增加优先性的氨基酸序列，和/或编码与seq id no:5具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的增加优选性的氨基酸序列。最优选地，所述片段包含(i)与seq id no:4具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的增加优选性的核苷酸序列，及(ii)与seq id no:3具有至少97.5％、至少98.5％、至少99％、至少99.5％、至少99.8％和100％相同性的增加优选性的核苷酸序列。
26.根据本发明第一方面的优选实施方案，所述核酸分子与异源核苷酸序列融合，优选与异源启动子可操作地连接。
27.根据本发明，异源核苷酸序列可以直接或间接与核酸分子融合。在间接融合的情况下，优选将编码肽接头的核苷酸序列用于融合，如gs-接头(例如gly-gly-gly-gly-ser)n(seq id no:7)，其中n是1至3)。
28.如本文所用，异源核苷酸序列是在自然界中未发现的与seq id no:2的核苷酸序列融合的序列。注意到seq id no:2来自人，优选所述异源核苷酸序列也来自人。
29.因此，异源启动子是在自然界中未发现的与seq id no:2的核苷酸序列可操作地连接的启动子。所述异源启动子优选来自人。
30.启动子是启动特定基因转录的核酸序列，根据本发明所述基因源自seq id no:2的hla-h基因或者是seq id no:2。在这方面，“可操作地连接”是指异源启动子与本发明的核酸分子融合，从而通过该启动子可以例如在原核生物或真核细胞中启动本发明的核酸分
子转录。所述异源启动子可以是组成型活性启动子、组织特异性或发育阶段特异性启动子、诱导型启动子或合成启动子。组成型启动子在几乎所有组织中直接表达，并且在很大程度上(如果不是完全的话)独立于环境和发育因素。由于其表达通常不受内源性因素的限制，因此组成型启动子通常在跨物种甚至跨界都有活性。组织特异性或发育阶段特异性启动子指导基因在特定组织中或在某发育阶段的表达。诱导型启动子的活性是通过存在或不存在生物或非生物因素诱导的。诱导型启动子是基因工程中非常强大的工具，因为与其可操作地连接的基因的表达可以根据需要打开或关闭。合成启动子是通过将来自不同来源的启动子区域的主要元件组合在一起构建的。
31.在本领域中用于异源表达基因的异源启动子的非限制性实例是sv40、cmv、hsv、ubc、ef1a、pgk、vλ1、rsv和cagg(用于哺乳动物系统)；copia和act5c(用于果蝇系统)和gal1、gal10、gal7、gal2(用于酵母系统)也可以与本发明结合使用。
32.或者或此外，所述异源核酸序列可以是编码序列，由此本发明的核酸序列产生融合蛋白质。这种融合蛋白质在下文中更详细地讨论。
33.如果核酸分子未融合异源启动子，则出于表达目的，将其融合于其自身启动子。
34.根据本发明，术语“载体”优选意指质粒、粘粒、病毒、噬菌体或另外使用的载体，例如携带根据本发明的核酸分子的常规用于基因工程中的载体。根据本发明的核酸分子可以例如插入一些可商购的载体中。非限制性实例包括原核质粒载体，例如puc系列、pbluescript(stratagene)、pet系列表达载体(novagen)或pcrtopo(invitrogen)以及与哺乳动物细胞中表达相容的载体如prep(invitrogen)、pcdna3(invitrogen)、pcep4(invitrogen)、pmc1neo(stratagene)、pxt1(stratagene)、psg5(stratagene)、ebo-psv2neo、pbpv-1、pdbpvmmtneo、prsvgpt、prsvneo、psv2-dhfr、pizd35、plxin、psir(clontech)、pires-egfp(clontech)、peak-10(edge biosystems)、ptriex-hygro(novagen)和pcineo(promega)。适用于毕赤酵母的质粒载体的实例包含例如质粒pao815、ppic9k和ppic3.5k(均来自invitrogen)。
35.插入载体中的核酸分子可以例如通过标准方法合成，或从天然来源中分离。编码序列与转录调节元件和/或其它氨基酸编码序列的连接也可以使用已确立的方法进行。确保在原核生物或真核细胞中表达的转录调节元件(表达盒的一部分)是本领域技术人员熟知的。这些元件包含确保转录起始的调节序列(例如翻译起始密码子，启动子，例如天然相关或异源启动子和/或绝缘子；见上文)、内部核糖体进入位点(ires)(owens,proc.natl.acad.sci.usa 98(2001),1471-1476)和任选的poly-a信号，以确保转录终止和转录物稳定。其它调节元件可包括转录和翻译增强子。优选地，编码本发明的多肽/蛋白质或融合蛋白质的多核苷酸可操作地连接于这种表达控制序列，使得可以在原核生物或真核细胞中表达。所述载体可以进一步包含编码分泌信号的核酸序列作为进一步的调节元件。这种序列是本领域技术人员熟知的。此外，取决于使用的表达系统，能将表达的多肽导向细胞区室的前导序列可以加入本发明的多核苷酸的编码序列中。这种前导序列在本领域中是熟知的。
36.此外，优选所述载体包含可选择标记。可选择标记的实例包括编码对新霉素、氨苄青霉素、潮霉素和卡那霉素抗性的基因。特别设计的载体使得dna可以在不同宿主之间穿梭，例如细菌-真菌细胞或细菌-动物细胞(例如invitrogen提供的gateway系统)。根据本发
明的表达载体能指导本发明的多核苷酸和编码的肽或融合蛋白质的复制和表达。除了通过诸如噬菌体载体或病毒载体(例如腺病毒、逆转录病毒)等载体引入之外，上文所述的核酸分子可以设计为直接引入或通过脂质体引入细胞。此外，杆状病毒系统或基于痘苗病毒或塞姆利基森林病毒(semliki forest virus)的系统可用作本发明核酸分子的真核表达系统。
37.术语“宿主细胞”是指任何生物体的任何细胞，其被以任何方式选择、修饰、转化、生长或使用或操作，以由细胞产生根据本发明的蛋白质或肽或融合蛋白质。
38.本发明的宿主细胞通常通过将本发明的核酸分子或载体引入宿主细胞而产生，宿主细胞基于其存在介导编码本发明的蛋白质或肽或融合蛋白质的本发明的核酸分子的表达。衍生或分离自宿主细胞的宿主可以是任何原核或真核细胞或生物体，优选除外通过破坏人胚胎直接衍生的人胚胎干细胞。
39.可用作本发明宿主的合适原核生物(细菌)是例如通常用于克隆和/或表达的那些，如大肠杆菌(例如大肠杆菌菌株bl21，hb101，dh5a，xl1 blue，y1090和jm101)，鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)，粘质沙雷氏菌(serratia marcescens)，水稻细菌性谷枯病菌(burkholderia glumae)，恶臭假单胞菌(pseudomonas putida)，荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)，斯氏假单胞菌(pseudomonas stutzeri)，变铅青链霉菌(streptomyces lividans)，乳酸乳球菌(lactococcus lactis)，土垢分支杆菌(mycobacterium smegmatis)，天蓝色链霉菌(streptomyces coelicolor)或枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)。上述宿主细胞的合适培养基和条件是本领域熟知的。
40.合适的真核宿主细胞可以是脊椎动物细胞、昆虫细胞、真菌/酵母细胞、线虫细胞或植物细胞。真菌/酵母细胞可以是酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)细胞、毕赤酵母(pichia pastoris)细胞或曲霉菌(aspergillus)细胞。用本发明的核酸分子或载体进行基因工程改造的宿主细胞的优选实例是酵母、大肠杆菌和/或芽孢杆菌属物种(例如枯草芽孢杆菌(b.subtilis))的细胞。在一个优选的实施方案中，所述宿主细胞是酵母细胞(例如酿酒酵母(s.cerevisiae))。
41.在不同的优选实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物宿主细胞，例如中国仓鼠卵巢(cho)细胞、小鼠骨髓瘤幼成淋巴细胞、人胚胎肾细胞(hek-293)、人胚胎视网膜细胞(crucell's per.c6)或人羊水细胞(glycotope和cevec)。这些细胞在本领域中经常用于生产重组蛋白质。cho细胞是最常用的哺乳动物宿主细胞，用于工业生产人重组蛋白质治疗剂。
42.术语“蛋白质”和“肽”及其优选实施方案已在上文结合本发明的第一方面加以定义。这些定义和优选实施方案加上必要的变更适用于本发明的第二方面。根据本发明的肽优选与seq id no:1或54的子序列具有至少80％、优选至少90％和最优选至少95％的相同性。
43.根据本发明的蛋白质或肽可以通过本领域熟知的分子克隆技术产生。例如，可以通过使用如上文所述的载体和宿主细胞实现重组表达。
44.根据一个优选的实施方案，根据本发明的蛋白质或肽是融合蛋白质。
45.根据本发明的“融合蛋白质”含有至少一个另外的异源氨基酸序列。通常，但不一定，这些另外的序列位于所述(多)肽的n或c末端。例如最初可以方便地将多肽表达为融合
蛋白质，从中可以例如通过能特异性修剪融合蛋白质并释放本发明的(多)肽的蛋白质酶去除另外的氨基酸残基。所述氨基酸序列化合物可以直接或间接与本发明的核酸分子融合。在间接融合的情况下，通常可以使用肽接头进行融合，例如gs-接头(例如gly-gly-gly-gly-ser)n(seq id no:7)，其中n是1至3)。
46.所述融合蛋白质的那些至少一个另外的异源氨基酸序列包括赋予所需特性例如修饰/增强的稳定性、修饰/增强的溶解性和/或靶向一种或多种特定细胞类型的能力的氨基酸序列。例如，具有抗体的融合蛋白质。术语抗体在下文进一步定义并且尤其包括抗体片段和衍生物。所述抗体可以是例如特异于细胞表面标志物或者可以是所述抗体的抗原识别片段。根据本发明的蛋白质或肽可以融合于抗体的轻链和/或重链的n末端或c末端。根据本发明的蛋白质或肽优选与抗体轻链和/或重链的n末端融合，以使抗体的fc部分自由结合fc受体。
47.所述融合蛋白质还可以包含已知在信号转导中起作用和/或已知参与蛋白质-蛋白质相互作用的蛋白质结构域。这种结构域的实例是锚蛋白质重复；arm，bcl-同源物，bromo，card，ch，chr，c1，c2，dd，ded，dh，efh，enth，f-box，fha，fyve，gel，gyf，hect，lim，mh2，pdz，pb1，ph，ptb，px，rgs，ring，sam，sc，sh2，sh3，socs，start，tir，tpr，traf，tsnare，tubby，uba，vhs，w，ww和14-3-3结构域。关于这些和其它蛋白质结构域的进一步信息可得自数据库interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/,mulder等,2003,nucl.acids.res.31:315-318),pfam(http://www.sanger.ac.uk/software/pfam/,bateman等,2002,nucleic acids research30(1):276-280)和smart(http://smart.embl-heidelberg.de/,letunic等,2002,nucleic acids res.30(1),242-244)。
48.根据本发明的融合蛋白质的至少一个另外的异源氨基酸序列可以包含或由以下组成：(a)细胞因子，(b)趋化因子，(c)促凝血因子，(d)蛋白质毒性化合物，和/或(e)用于前药活化的酶。
49.细胞因子优选选自il-2、il-12、tnf-α、ifnα、ifnβ、ifnγ、il-10、il-15、il-24、gm-csf、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-9、il-11、il-13、lif、cd80、b70、tnfβ、lt-β、cd-40配体、fas-配体、tgf-β、il-1α和il-1β。正如本领域熟知的，细胞因子可能有利于免疫系统的促炎或抗炎反应。因此，根据要治疗的疾病，可能倾向于使用具有促炎或抗炎细胞因子的融合蛋白质。例如，对于炎性疾病的治疗，通常优选包含抗炎细胞因子的融合构建体，而对于癌症的治疗，通常优选包含促炎细胞因子的融合构建体。
50.趋化因子优选选自il-8、groα、groβ、groγ、ena-78、ldgf-pbp、gcp-2、pf4、mig、ip-10、sdf-1α/β、bunzo/strc33、i-tac、blc/bca-1、mip-1α、mip-1β、mdc、teck、tarc、rantes、hcc-1、hcc-4、dc-ck1、mip-3α、mip-3β、mcp-1-5、eotaxin、eotaxin-2、i-309、mpif-1、6ckine、ctack、mec、淋巴细胞趋化因子和fractalkine。趋化因子的主要作用是作为化学引诱物引导细胞迁移。被趋化因子吸引的细胞跟随趋化因子浓度向趋化因子来源增加的信号。因此，在融合蛋白质内，趋化因子可用于引导根据本发明的蛋白质或肽的迁移至例如特定的细胞类型或身体部位。
51.促凝血因子优选是组织因子。促凝血因子促进血液从液体变为凝胶的过程，形成血凝块。例如，促凝血因子可有助于伤口愈合。
52.蛋白质毒性化合物优选为蓖麻毒素a链、modeccin、截短的假单胞菌外毒素a、白喉
毒素和重组白树毒素。毒性化合物对整个生物体以及生物体的亚结构例如特定细胞类型可具有毒性作用。毒性化合物经常用于治疗肿瘤。肿瘤细胞通常比正常体细胞生长得更快，因此其优先积聚毒性化合物并且数量更多。
53.用于前药活化的酶优选是选自羧肽酶、葡糖醛酸酶和葡糖苷酶的酶。在已评估用于肿瘤治疗的众多基因中，编码前药活化酶的那些基因特别有吸引力，因为其直接补充进行中的临床化学疗法方案。这些酶可以使用细菌和酵母酶激活具有低固有毒性的前药，或通过哺乳动物酶增强对前药的活化。
54.根据一个优选实施方案，所述蛋白质或肽与异源非蛋白质化合物融合。
55.如本文所用，异源化合物是在自然界中未发现的与seq id no:1或54的氨基酸序列融合的化合物。
56.所述异源非蛋白质化合物可以直接或间接与本发明的核酸分子融合。例如，可以使用化学接头。化学接头可含有不同的官能团，例如伯胺、巯基、酸、醇和溴化物。我们的许多交联剂均用与胺反应的马来酰亚胺(巯基反应性)和琥珀酰亚胺酯(nhs)或异硫氰酸酯(itc)基团进行了功能化。
57.异源非蛋白质化合物优选是药物活性化合物或诊断活性化合物。所述药物活性化合物或诊断活性化合物优选选自(a)荧光染料，(b)光敏剂，(c)放射性核素，(d)用于医学成像的造影剂，(e)毒性化合物，或(f)ace抑制剂、肾素抑制剂、adh抑制剂、醛固酮抑制剂、血管紧张素受体阻滞剂、tsh受体、lh-/hcg受体、雌激素受体、孕激素受体、雄激素受体、gnrh-受体、gh(生长激素)受体或igf-i或igf-ii受体。
58.荧光染料优选是选自alexa fluor或cy染料的组分。
59.光敏剂优选是光毒性红色荧光蛋白质killerred或血卟啉。
60.放射性核素优选选自发射γ射线的同位素，更优选
99m
tc、
123
i、
111
in，和/或选自正电子发射物，更优选
18
f、
64
cu、
68
ga、
86
y、
124
i，和/或选自β射线发射物，更优选
131
i、
90
y、
177
lu、
67
cu、
90
sr，或选自α射线发射物，优选
213
bi、
211
at。
61.如本文所用的造影剂是在医学成像中用于增强体内结构或流体的对比度的物质。普通造影剂的工作原理基于x射线衰减和磁共振信号增强。
62.毒性化合物优选是小有机化合物，更优选选自加利车霉素(calicheamicin)、美登素(maytansinoid)、新抑癌蛋白质、拉霉素(esperamicin)、dynemicin、可达菌素(kedarcidin)、maduropeptin、阿霉素(doxorubicin)、柔红霉素(daunorubicin)和auristatin的毒性化合物。与本文上述的蛋白质毒性化合物相反，这些毒性化合物是非蛋白质的。
63.根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或其组合可以配制成药物组合物。根据本发明，术语“药物组合物”涉及用于施用患者、优选人患者的组合物。本发明的药物组合物包含上述化合物。其可以任选地包含能改变本发明化合物的特征从而例如稳定、调节和/或激活其功能的其它分子。所述组合物可以是固体、液体或气体形式，并且尤其可以是粉、片剂、溶液或气雾剂的形式。本发明的药物组合物可以任选及另外包含药学上可接受的载体。合适的药用载体的例子是本领域熟知的并且包括磷酸盐缓冲盐溶液、水、乳剂例如油/水乳剂、各种类型的润湿剂、无菌溶液、包括dmso的有机溶剂等。包含这种载体的组合物可以是通过熟知的常规方法配制。这些药物组合物可以以合适的剂量施用受试者。给
药方案将由主治医师和临床因素决定。正如医学领域所熟知的，任一患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康状况和其它同时施用的药物。给定情况下的治疗有效量很容易通过常规实验确定，并且在普通临床医生或医师的技能和判断范围内。通常，作为药物组合物的常规给药方案应该在每天1μg至5g单位的范围内。然而，更优选的剂量可以在每天0.01mg至100mg，甚至更优选0.01mg至50mg并且最优选0.01mg至10mg的范围内。此外，如果例如所述化合物是irna制剂例如sirna，则施用的药物组合物的总药学有效量通常小于约75mg/kg体重，例如小于约70、60、50、40、30、20、10、5、2、1、0.5、0.1、0.05、0.01、0.005、0.001或0.0005mg/kg体重。更优选地，所述量小于2000nmol的irna制剂(例如约4.4
×
10
16
拷贝)/kg体重，例如小于1500、750、300、150、75、15、7.5、1.5、0.75、0.15、0.075、0.015、0.0075、0.0015、0.00075或0.00015nmol的irna制剂/kg体重。观察变化所需的治疗时间和治疗后发生反应的时间间隔因所需效果而异。特定量可以通过本领域技术人员熟知的常规测试来确定。
64.免疫抑制剂是一种能抑制免疫反应的药物。其可用于免疫抑制治疗，例如(i)预防移植的器官和组织(例如骨髓、心脏、肾脏、肝脏)的排斥，(ii)治疗自身免疫性疾病或最可能源于自身免疫的疾病源(例如类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力、银屑病、白癜风、系统性红斑狼疮、结节病、局灶节段性肾小球硬化、克罗恩病、白塞病、天疱疮、硬皮病和溃疡性结肠炎)，和/或(iii)治疗非自身免疫性炎症性疾病(例如长期过敏性哮喘控制和强直性脊柱炎)。
65.肿瘤疫苗既可用于治疗现有的肿瘤，也可用于预防肿瘤的发生。治疗现有癌症的疫苗也称为治疗性癌症疫苗。所述疫苗可以是“自体的”，即从取自患者的样品中制备，并且是特异于该患者的。癌症疫苗接种的方法通常是将蛋白质从癌细胞中分离出来，并以这些蛋白质作为抗原对患者进行免疫，目的是刺激免疫系统杀死癌细胞。根据本发明，所述抗原来源于hla-h蛋白质/肽。
66.因此，本发明还涉及制备肿瘤疫苗的方法，包括将根据本发明的核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白质或肽、结合分子优选抑制剂或其组合与至少一种药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂混合。
67.妊娠促进剂是一种增加怀孕可能性及特别是胚胎着床(implantation)可能性的化合物。着床是已经受精的卵子附着在子宫壁上的妊娠阶段。正是通过这种附着，胚胎从母体接受氧和营养而能生长。在人体中，受精卵的附着和着床最有可能发生在排卵后5至6天左右。在三分之二的病例中，着床失败被认为是由子宫容受性不足引起的，而在另外三分之一的病例中，着床失败是由胚胎本身的问题引起的。这也取决于母亲的年龄。子宫容受性不足在年轻母亲中更为常见，而胚胎本身的问题(例如染色体畸变)在年长母亲中更为常见(尤其是35岁以上)。子宫容受性不足可能是由异常的细胞因子和激素信号传导以及表观遗传改变引起的。反复着床失败是女性不孕的一个原因。因此，可以通过优化子宫内膜对着床的容受性来改善妊娠率。
68.本发明的核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白质或肽、结合分子优选抑制剂或其组合因此可以用于例如体外受精，其中将卵母细胞在受精和着床母体之前在存在本发明的核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白质或肽、结合分子优选抑制剂或其组合条件下培养。
69.癌症患者组织样品中hla-h表达的检测在所附实施例中示出。更详细地，在实施例
1和2中示出膀胱癌患者中的hla-h表达，在实施例3中示出化学疗法前后的膀胱癌患者中的hla-h表达以及实施例4中示出化学疗法前后的卵巢癌患者中的hla-h表达。实施例2至4示出高水平的hla-h表达与不良结果相关，例如检查点治疗或化学疗法耐药后生存率低。此外，在实施例4中示出，hla-h表达的增加与较高的肿瘤分期呈正相关。因此可以安全地假设hla-h表达有助于肿瘤逃避免疫系统。这反过来表明hla-h作为免疫抑制剂起作用。
70.这些证据表明，hla-h不是假基因，实际上是编码蛋白质的功能基因。在这方面，参考数据库genecards(gc06p032554)的假基因hla-h基因条目。这个数据库条目提到了氨基酸序列uniportkb:p01893，并警告说该蛋白质可能是假基因的产物，并将该蛋白质描述为“推定的”。本文的实验数据出人意料地揭示了hla-h不是假基因，而是实际上编码了一种功能蛋白质。更出乎意料的是，这种功能蛋白质不是氨基酸序列uniportkb:p01893，而是seq id no:1的氨基酸序列。
71.氨基酸序列uniportkb:p01893是基于错误假设的开放读框。为此原因，本文提供的seq id no:1和54仅与uniportkb:p01893的子部分共享约90％的序列相同性。此外，uniportkb:p01893包含hla跨膜结构域，而本文公开的正确hla-h则否。推定的hla-h uniportkb:p01893就像hla-g一样是膜结合的，而意外发现hla-h实际上是可溶性hla。从现有技术中可以看出，包含在公众的基因和蛋白质数据库中的hla-h假基因和推定的hla-h蛋白质的可用序列是错误的，更别说seq id no:1和2是正确的序列。
72.实施例中的上述数据还提出用hla-h对肿瘤患者进行疫苗接种有助于抑制或消除肿瘤通过hla-h表达而从免疫系统中逃逸至少是合理的。因此，本发明的核酸分子、载体、宿主细胞或蛋白质或肽或组合可用作免疫抑制剂或肿瘤疫苗。所述核酸分子优选是本发明第一方面的(g)项的核酸分子。虽然wo 2018/140525设想使用hla-h抗体治疗癌症，但wo 2018/140525未公开任何hla-h，更不用说本文提供的seq id no:1和2的正确hla-h序列。类似地，wo 2018/183921提到了潜在的新型免疫治疗靶位的长名单，其中hla-h就在这个名单中。同样，没有公开hla-h序列。
73.此外，假设所述核酸分子、载体、宿主细胞、蛋白质或肽或其组合可用作妊娠促进剂，特别是用于优化子宫内膜对着床的容受性。所述核酸分子优选是本发明第一方面的(g)项的核酸分子。这是由于hla-g被认为通过调节细胞因子分泌以控制滋养层细胞侵润和维持局部免疫耐受性在着床中起关键作用(参见roussev and coulam，j assist reprod genet.2007jul；24(7):288
–
295)。此外，已知着床前胚胎表达可溶性hla-g和可溶性hla-f。可溶性hla-g和可溶性hla-f的表达水平越高，胚胎的着床率越高。因此，预计高水平的hla-h表达也与成功着床一致，而低水平的hla-h表达与着床失败一致。
74.本发明在第二方面涉及本发明第一方面定义的核酸分子的抑制剂和/或本发明第一方面定义的蛋白质的结合分子，优选本发明第一方面定义的蛋白质的抑制剂，用于作为免疫激活剂中的用途，优选用于在治疗肿瘤中的用途。
75.根据本发明的蛋白质的结合分子是能结合本发明的蛋白质的化合物。所述结合分子优选特异性结合本发明的蛋白质。特异性结合是指所述结合分子基本上不结合或基本上不与本发明的蛋白质以外的其它蛋白质或肽结合。特别地，优选结合分子不能与除hla-h之外的其它hla蛋白质结合。根据本发明的蛋白质的结合分子例如适用于研究目的。例如，与本发明的蛋白质结合的抗体可用于免疫测定，例如elisa或蛋白质印迹。根据本发明的蛋白
质的结合分子优选能本发明的抑制蛋白质。在这种情况下，结合分子被称为抑制剂。
76.本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质的表达的化合物根据本发明是(i)降低或阻止编码本发明的核酸分子和/或蛋白质的基因转录的化合物，或(ii)是降低或阻止编码本发明的蛋白质的mrna翻译的化合物。(i)的化合物包括干扰转录机制和/或其与所述基因的启动子和/或远离启动子的表达控制元件如增强子的相互作用的化合物。(ii)的化合物包括干扰翻译机制的化合物。本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质的表达的化合物特异性本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质的表达，例如通过特异性干扰控制表达的启动子区域进行。优选地，根据本发明的核酸分子和/或蛋白质的转录或根据本发明的蛋白质的翻译降低至少50％，更优选至少75％，例如至少90％或95％，甚至更优选至少98％，最优选约100％(例如与不存在所述化合物的相同实验设置相比)。
77.本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质活性的化合物导致所述核酸分子和/或蛋白质以降低的效力执行其功能。本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质活性的化合物特异性抑制所述核酸分子和/或蛋白质的活性。如下文进一步详述，本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质活性的化合物可以通过与所述核酸分子和/或蛋白质自身相互作用或者通过特异性抑制(优选杀死)产生所述核酸分子和/或产生所述蛋白质和/或结合所述蛋白质的细胞而特异性抑制所述核酸分子和/或蛋白质的活性。优选地，根据本发明的核酸分子和/或蛋白质的活性降低至少50％，更优选至少75％，例如至少90％或95％，甚至更优选至少98％，最优选约100％(例如与不存在所述化合物的相同实验设置相比)。
78.根据本发明的核酸分子和/或蛋白质的活性根据本发明优选是其在癌症患者中诱导对化学疗法的抗性的能力和/或在癌症患者中降低无进展生存率以及总生存率的能力(另见所附实施例)。本文所指的化学疗法可以是辅助化学疗法或新辅助化学疗法，优选新辅助化学疗法。化学疗法使用药物来破坏癌细胞、停止其生长或改善症状。在新辅助(也称为术前或初次)化学疗法中，药物治疗在手术切除肿瘤之前进行。这与辅助化学疗法相反，辅助化学疗法是手术后的药物治疗。确定这种活性的方式和方法已在本领域中确立并且在下文的实施例中进行了说明。根据本发明的医学方面，因此要抑制根据本发明的核酸分子和/或蛋白质的这些活性。
79.抑制剂的抑制效力可以通过比较存在和不存在所述抑制剂时的活性水平的方法来量化。例如，形成的本发明核酸分子和/或蛋白质的量的变化可以用于测量。可以同时以高通量形式测定几种抑制剂的效力。不依赖于生化、细胞或其它测定的高通量测定通常可以在微量滴定板的孔中进行，其中每个平板可以含有96、384或1536个孔。所述平板的处理，包括在不同于环境温度的温度下温育以及使测试化合物与测定混合物接触，优选通过包括移液装置的一个或多个计算机控制的机器人系统来实现。在筛选大的测试化合物库和/或在短时间内进行筛选的情况中，可以将例如10、20、30、40、50或100种测试化合物的混合物加入每个孔中。在孔表现出预期活性的情况下，可以对所述测试化合物的混合物进行去卷积以鉴定所述混合物中产生所述活性的一种或多种测试化合物。
80.本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质的表达和/或活性的化合物可以配制成囊泡，例如脂质体或外来体。从药物递送的角度来看，脂质体因其特异性和作用持续时间而引起了极大的兴趣。脂质体细胞型递送系统已用于有效地将核酸例如sirna在体内递送到细胞中(zimmermann等，(2006)nature,441:111-114)。脂质体是单层或多层囊泡，其具有由亲脂
性材料形成的膜和水性内部。水性部分含有待递送的组合物。阳离子脂质体具有能与细胞壁融合的优点。非阳离子脂质体虽然不能有效地与细胞壁融合，但在体内被巨噬细胞和其它细胞吞噬。外来体是可以携带包括rna在内的多种不同分子的脂质包装(alexander等，(2015),nat commun；6:7321)。包括其中包含的分子的外来体可以被受体细胞摄取。因此，外来体是细胞间通讯的重要介质和细胞生态位(cellular niche)的调节剂。外来体可用于诊断和治疗目的，因为其可以用作例如造影剂或药物的递送载体。
81.可以将根据本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质的表达和/或活性的化合物以合适的剂量和/或治疗有效量施用于受试者。这将在下文结合本发明的药物组合物进一步讨论。
82.观察变化所需的治疗时间和治疗后发生反应的时间间隔因所需效果而异。特定的量可以通过本领域技术人员熟知的常规测试来确定。合适的测试是例如在tamhane and logan(2002),“multiple test procedures for identifying the minimum effective and maximum safe doses of a drug”,journal of the american statistical association,97(457):1-9中描述的测试。
83.根据本发明的抑制核酸分子和/或蛋白质的表达和/或活性的化合物优选与药学上可接受的载体或赋形剂混合以形成药物组合物。合适的药学上可接受的载体或赋形剂以及药物组合物的配制已在上文讨论。
84.免疫激活剂是一种能促进免疫反应的药物。免疫激活剂可用于免疫激活疗法，例如促进和/或启动针对病变细胞的免疫反应。所述免疫反应优选是针对病变细胞的细胞毒性免疫反应和/或t细胞反应。
85.如所提及的，免疫激活剂优选用于治疗肿瘤。从所附实施例中显然可见，hla-h在肿瘤中表达。hla-h是一种分泌蛋白质，下文实施例中的数据表明hla-h是由肿瘤细胞分泌的，因此很可能在肿瘤细胞周围形成hla-h蛋白质“云”，所述云保护肿瘤细胞不会被免疫系统识别和清除。所述结合分子，优选本发明的抑制剂，从肿瘤细胞中带走这种保护云，从而促进和/或启动针对肿瘤细胞的免疫反应。这种免疫激活机制加上必要的变更适用于除肿瘤细胞之外的其它病变细胞。
86.肿瘤是组织的异常良性或恶性新生长，不具有生理功能并且由不受控制的通常快速的细胞增殖引起。与非实体(或液体)肿瘤相比，实体瘤是一种异常的组织团块，通常不包含囊肿或液体区域。
87.如上文所讨论的，基于下文实施例中的数据，可以安全地假设hla-h表达被肿瘤用于逃避免疫系统和变得对已建立的抗肿瘤疗法例如化学疗法和免疫检查点治疗产生抗性。hla-h被认为通过充当免疫抑制剂来帮助肿瘤。因此，也可以安全地假设hla-h抑制剂适合用作免疫激活剂，特别是用于治疗肿瘤。
88.优选hla-h抑制剂与已确立的抗肿瘤疗法、优选化学疗法或免疫检查点治疗、更优选免疫检查点治疗和最优选抗pd-l1疗法联合使用。在实施例1中示出hla-h表达和免疫检查点pd-l1的正相关，在实施例2中进一步示出表达高水平hla-h的肿瘤患者在用抗pd-l1抗体治疗时生存率降低。这表明表达pd-l1和hla-h的患者必须接受抗pd-l1疗法和hla-h抑制剂治疗，以防止抗pd-l1疗法失败。
89.根据本发明第二方面的优选实施方案，(i)所述核酸分子的抑制剂选自小分子、适
体、sirna、shrna、mirna、核酶、反义核酸分子、基于crispr-cas9的构建体、基于crispr-cpf1的构建体、大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活样(tal)效应子(tale)核酸酶，和/或(ii)所述蛋白质的结合分子，优选所述蛋白质的抑制剂选自小分子、抗体或抗体模拟物、适体，其中所述抗体模拟物优选选自affibodies、adnectins、anticalins、darpins、avimers、nanofitins、affilins、kunitz结构域肽、三特异性结合分子和前抗体(probodies)。
90.如本文所用，“小分子”优选为有机分子。有机分子涉及或属于具有碳基的化合物类别，碳原子通过碳-碳键连接在一起。术语有机一词的原始定义与化合物的来源有关，有机化合物是从植物或动物或微生物来源获得的那些含碳化合物，而无机化合物是从矿物来源获得的。有机化合物可以是天然的或合成的。有机分子优选为芳族分子，更优选为杂芳族分子。在有机化学中，术语芳香性用于描述具有共振键环的环形(环状)平面(扁平)分子，与具有相同系列原子的其它几何或连接排列相比表现出更高的稳定性。芳香族分子非常稳定，不易分解而与其它物质发生反应。在杂芳族分子中，芳环中的至少一个原子是碳以外的原子，例如n、s或o。对于所有上述有机分子，分子量优选在200da至1500da的范围内，更优选在300da至1000da的范围内。
91.或者，根据本发明的“小分子”可以是无机化合物。无机化合物来源于矿物，包括所有不含碳原子的化合物(二氧化碳、一氧化碳和碳酸盐除外)。优选地，所述小分子的分子量小于约2000da，或小于约1000da，例如小于约500da，甚至更优选小于约da amu。小分子的大小可以通过本领域熟知的方法例如质谱法来确定。例如，可以基于靶分子的晶体结构设计小分子，其中可以在体内测定例如体内高通量筛选(hts)测定中鉴定和验证可能负责生物活性的位点。
92.根据本发明使用的术语“抗体”包含例如多克隆或单克隆抗体。此外，其仍保留对靶位例如seq id no:1或54的hla-h蛋白质的结合特异性的其衍生物或片段也包括在术语“抗体”中。抗体片段或衍生物尤其包含fab或fab’片段、fd、f(ab’)2、fv或scfv片段、单结构域vh或v-样结构域，例如vhh或v-nar-结构域，以及多聚体形式例如微抗体、双体、三体或三倍体、四体或化学缀合的fab
’‑
多聚体(参见例如harlow and lane"antibodies,a laboratory manual",cold spring harbor laboratory press,198；harlow and lane“using antibodies:a laboratory manual”cold spring harbor laboratory press,1999；altshuler ep,serebryanaya dv,katrukha ag.2010,biochemistry(mosc).,vol.75(13),1584；holliger p,hudson pj.2005,nat biotechnol.,vol.23(9),1126)。多聚体形式特别包含可以同时结合两种不同类型抗原的双特异性抗体。第一种抗原可见于根据本发明的蛋白质上。第二种抗原可例如是在癌细胞或某种类型的癌细胞上特异性表达的肿瘤标志物。双特异性抗体形式的非限制性实例是biclonics(双特异性全长人igg抗体)、dart(双亲和性再靶向抗体)和bite(由不同抗体的两个单链可变片段(scfvs)组成)分子(kontermann and brinkmann(2015),drug discovery today,20(7):838-847)。
93.术语“抗体”还包括诸如嵌合抗体(人恒定结构域、非人可变结构域)、单链和人源化抗体(非人cdr除外的人抗体)的实施方案。
94.用于产生抗体的各种技术在本领域中是熟知的并且例如在harlow and lane(1988)和(1999)及altshuler等,2010,loc.cit.中描述。因此，多克隆抗体可以在用抗原与
and skerra,2009)。
100.如本文所用，术语“avimer”是指一类抗体模拟物，其由两个或多个肽序列组成，每个肽序列具有30至35个氨基酸，其衍生自各种膜受体的a结构域并通过接头肽连接。靶分子的结合通过a-结构域发生，具有即对于hla-h的所需结合特异性的结构域可以例如通过噬菌体展示技术选择。avimer中含有的不同a结构域的结合特异性可以但不必相同(weidle uh,等,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0101]“nanofitin”(也称为affitin)是一种抗体模拟蛋白质，来源于嗜酸热硫化叶菌的dna结合蛋白质sac7d。nanofitins通常具有约7kda的分子量，旨在通过随机化结合表面上的氨基酸而特异性结合靶分子，例如hla-h(mouratou b,b
é
har g,paillard-laurance l,colinet s,pecorari f.,(2012)methods mol biol.；805:315-31)。
[0102]
如本文所用，术语“affilin”是指通过使用γ-b结晶或泛素作为支架并通过随机诱变修饰这些蛋白质表面上的氨基酸而开发的抗体模拟物。例如，通过噬菌体展示或核糖体展示技术来选择具有即针对hla-h的所需靶特异性的affilins。取决于支架，affolins的分子量约为10或20kda。如本文所用，术语affilin还指affilin的二聚或多聚形式(weidle uh,等,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0103]“kunitz结构域肽”衍生自kunitz型蛋白酶抑制剂如牛胰蛋白酶抑制剂(bpti)、淀粉样前体蛋白质(app)或组织因子途径抑制剂(tfpi)的kunitz结构域。kunitz结构域的分子量约为6kda，具有即针对hla-h的所需靶特异性的结构域可以通过噬菌体展示等展示技术选择(weidle等,(2013),cancer genomics proteomics；10(4):155-68)。
[0104]
如本文所用，术语是指源自人fyn sh3结构域的非免疫球蛋白质衍生的结合多肽。fyn sh3衍生的多肽在本领域中是熟知的并且已经例如在grabulovski等，(2007)jbc,282,p.3196-3204、wo 2008/022759、bertschinger et al(2007)protein eng des sel 20(2):57-68、gebauer and skerra(2009)curr opinion in chemical biology 13:245-255或schlatter等，(2012),mabs 4:4,1-12)中描述。
[0105]
如本文所用，术语“三特异性结合分子”是指具有三个结合结构域并因此能结合、优选特异性结合三个不同表位的多肽分子。这三个表位中的至少一个表位是根据本发明的蛋白质的表位。另两个表位也可以是根据本发明的蛋白质的表位或可以是一种或两种不同抗原的表位。所述三特异性结合分子优选是tritac。tritac是实体瘤的t细胞接合剂，由三个结合结构域组成，旨在具有延长的血清半衰期，大小约为单克隆抗体的三分之一。
[0106]
如本文所用，术语“前抗体”是指蛋白酶可激活的抗体前药。前抗体由真正的igg重链和修饰的轻链组成。掩蔽肽通过可被肿瘤特异性蛋白酶切割的肽接头与轻链融合。所述掩蔽肽阻止前抗体与健康组织结合，从而使毒副作用最小化。
[0107]
适体是结合特异性靶分子的核酸分子或肽分子。适体通常是通过从大型随机序列库中选择来创建的，但天然适体也存在于核糖开关中。适体可作为大分子药物用于基础研究和临床。适体可以与核酶结合，在其靶分子存在的情况下进行自切割。这些化合物分子具有另外的研究、工业和临床应用(osborne et.al.(1997),current opinion in chemical biology,1:5-9；stull&szoka(1995),pharmaceutical research,12,4:465-483)。
[0108]
核酸适体是通常由(通常是短的)寡核苷酸链组成的核酸种类。典型地，其是通过重复的体外选择或等效的selex(通过指数富集系统进化配体)工程化为结合各种分子靶，
例如小分子、蛋白质、核酸，甚至细胞、组织和生物体。
[0109]
肽适体通常是设计为干扰细胞内其它蛋白质相互作用的肽或蛋白质。其由两端连接于蛋白质支架上的可变肽环组成。这种双重结构限制将肽适体的结合亲和力极大地增加至与抗体相当的水平(纳摩尔范围)。可变肽环通常包含10至20个氨基酸，并且支架可以是具有良好溶解性质的任何蛋白质。目前，细菌蛋白质硫氧还蛋白质-a是最常用的支架蛋白质，可变肽环被插入氧化还原活性位点，即野生蛋白质中-cys-gly-pro-cys-环(seq id no:8)，两条半胱氨酸侧链能形成二硫键。可以使用不同的系统进行肽适体选择，但目前使用最广泛的是酵母双杂交系统。
[0110]
适体为生物技术和治疗应用提供了实用性，因为其提供了可与常用的生物分子、特别是抗体相匹敌的分子识别性质。除了其有区别识别之外，适体还提供优于抗体的优势，因为其可以在试管中完全工程化，易于通过化学合成产生，具有理想的储存性质，并且在治疗应用中激发很少或没有免疫原性。未修饰的适体从血液中迅速清除，半衰期为几分钟到几小时，这主要是由于核酸酶降解和通过肾脏从体内清除，这是适体固有的低分子量的结果。未修饰的适体应用目前专注于治疗瞬时病症例如血液凝固，或治疗可以局部递送的器官例如眼睛。这种快速清除在如体内诊断成像等应用中可能是一个优势。科学家可以使用多种修饰，例如2
’‑
氟取代的嘧啶、聚乙二醇(peg)键、融合于白蛋白质或其它延长半衰期的蛋白质等，从而使适体的半衰期可以延长几天或甚至几周。
[0111]
如所讨论的，上述小分子、抗体或抗体模拟物和适体可以特异性结合本发明的蛋白质。这种结合可以阻断本发明的蛋白质的免疫抑制性质，优选阻断其在癌症患者中诱导对化学疗法的抗性和/或在癌症患者降低无进展生存以及总体生存率的能力。在这种情况下，所述小分子、抗体或抗体模拟物和适体也称为阻断小分子、抗体或抗体模拟物和适体。阻断小分子、抗体或抗体模拟物和适体阻断本发明的蛋白质与其它细胞成分例如通常与本发明的蛋白质相互作用的配体和受体的相互作用。
[0112]
所述小分子、抗体或抗体模拟物和适体也可以以药物偶联物的形式产生。在这种情况下，所述小分子、抗体或抗体模拟物和适体本身可能不具有抑制作用，但抑制作用仅由药物赋予。所述小分子、抗体或抗体模拟物和适体赋予药物与产生和/或结合本发明蛋白质的细胞的位点特异性结合。所述药物优选能杀死产生和/或结合本发明蛋白质的细胞。因此，通过将与本发明蛋白质结合的分子的靶向能力与药物的细胞杀伤能力相结合，所述药物缀合物成为可以区分健康与患病组织和细胞的抑制剂。用于设计药物缀合物的可切割和不可切割接头是本领域已知的。能杀死细胞的药物的非限制性实例是细胞抑制药物和直接向癌细胞递送辐射的放射性同位素。
[0113]
此外，可以将所述小分子、抗体或抗体模拟物和适体的结合和/或抑制活性限于特定的组织或细胞类型，特别是患病组织或细胞类型。例如，可以设计前抗体。在前抗体中，所述小分子、抗体或抗体模拟物或适体与掩蔽肽结合，该掩蔽肽限制或阻止与本发明的蛋白质的结合，并且该掩蔽肽可以被蛋白酶切割。蛋白酶是通过切割称为底物的特定氨基酸序列将蛋白质消化成更小片段的酶。在正常的健康组织中，蛋白酶活性受到严格控制。在癌细胞中，蛋白酶活性被上调。在蛋白酶活性受到调节且最小化的健康组织或细胞中，前抗体的靶结合区域仍然被掩盖，因此无法结合。另一方面，在蛋白酶活性被上调的患病组织或细胞中，前抗体的靶结合区域被暴露，因此能结合和/或抑制。
[0114]
根据本发明，术语“小干扰rna(sirna)”，也称为短干扰rna或沉默rna，是指18至30个、优选19至25个、最优选21至23个或甚至更优选长度为21个核苷酸的双链rna分子，其在生物学中发挥多种作用。最值得注意的是，sirna参与rna干扰(rnai)途径，其中sirna干扰特定基因的表达。除了其在rnai途径中的作用外，sirna还作用于rnai相关的途径，例如作为一种抗病毒机制或塑形基因组的染色质结构。
[0115]
天然存在于自然界中的sirna具有明确定义的结构：一条短的双链rna(dsrna)，在任一端带有2-nt的3’突出端。每条链均有一个5’磷酸基团和一个3’羟基(-oh)基团。这种结构是通过dicer加工的结果，dicer是一种将长dsrna或小发夹rna转变为sirna的酶。sirnas也可以经外源(人工)引入细胞，以实现感兴趣的基因的特异性敲低。因此，基本上已知序列的任何基因都可以基于与适当定制的sirna的序列互补性而被靶向。双链rna分子或其代谢加工产物能介导靶特异性核酸修饰，特别是rna干扰和/或dna甲基化。外源引入的sirna在其3’和5’末端可能没有突出端，然而，优选至少一条rna链具有5
’‑
和/或3
’‑
突出端。优选地，双链的一端具有1至5个核苷酸、更优选1至3个核苷酸及最优选2个核苷酸的3
’‑
突出端。另一端可以是平端或具有多达6个核苷酸的3
’‑
突出端。通常，本发明设想了任何适合充当sirna的rna分子。迄今为止，最有效的沉默是使用由21-nt有义链和21-nt反义链组成的sirna双链体获得的，所述双链以具有2-nt的3
’‑
突出端的方式配对。2-nt的3’突出端的序列对限于与第一个碱基对相邻的未配对核苷酸的靶向识别的特异性做出了很小的贡献(elbashir等，2001)。3’突出端中的2
’‑
脱氧核苷酸与核糖核苷酸一样有效，但通常合成成本更低，并且可能对核酸酶更具抗性。sirna的递送可以使用本领域已知的任何方法来完成，例如通过将sirna与盐水组合并通过静脉内或鼻内施用该组合或通过在葡萄糖(例如5％葡萄糖)或阳离子脂质和聚合物中配制sirna，可用于通过静脉内(iv)或腹膜内(ip)的全身途径在体内递送sirna(de fougerolles等，(2008),current opinion in pharmacology,8:280-285；lu等，(2008),methods in molecular biology,vol.437:drug delivery systems
–
chapter 3:delivering small interfering rna for novel therapeutics)。
[0116]
短发夹rna(shrna)是一种rna序列，其产生紧密的发夹转角，可用于通过rna干扰使基因表达沉默。shrna使用引入细胞的载体并利用u6启动子来确保shrna始终被表达。这个载体通常被传递给子细胞，从而使基因沉默得以遗传。shrna发夹结构通过细胞机制被切割成sirna，然后与rna诱导的沉默复合物(risc)结合。这种复合物结合并切割与其结合的匹配sirna的mrna。用于本发明的si/shrna优选是使用适当保护的核糖核苷亚磷酰胺和常规dna/rna合成仪化学合成的。rna合成试剂的供应商是proligo(hamburg,germany)、dharmacon research(lafayette,co,usa)、pierce chemical(part of perbio science,rockford,il,usa)、glen research(sterling,va,usa)、chemgenes(ashland,ma,usa)和cruachem(glasgow,uk)。最方便的是，sirna或shrna得自商业rna寡核苷酸合成供应商，这些供应商销售不同质量和价格的rna合成产品。通常，可用于本发明的rna是常规合成的，并且容易以适合rnai的质量提供。
[0117]
影响rnai的其它分子包括例如microrna(mirna)。所述rna种类是单链rna分子。内源性mirna分子通过与互补mrna转录物结合并通过类似于rna干扰的过程触发所述mrna转录物的降解来调节基因表达。因此，外源mirna可以在引入相应细胞后用作hla-h的抑制剂。
[0118]
核酶(来自核糖核酸酶，也称为rna酶或催化rna)是催化化学反应的rna分子。许多天然核酶催化其自身的切割或其它rna的切割，但也发现其催化核糖体的氨基转移酶活性。充分鉴定的小自切割rna的非限制性实例是锤头状核酶、发夹状核酶、丁型肝炎病毒核酶和体外选择的铅依赖性核酶，而i组内含子是较大核酶的一个实例。近年来，催化自裂解的原理已得到很好的确立。在具有核酶活性的rna分子中，锤头状核酶被最佳鉴定。由于显示锤头结构可以整合到异源rna序列中，因此核酶活性可以转移到这些分子上，似乎可以产生几乎任何靶序列的催化反义序列，只要所述靶序列包含潜在的匹配切割位点即可。构建锤头状核酶的基本原理如下：选择包含guc(或cuc)三联体的rna感兴趣区域。取两条寡核苷酸链，每条链通常有6至8个核苷酸，并在两条链之间插入催化的锤头序列。最好的结果通常是用短核酶和靶序列获得的。
[0119]
也可根据本发明使用的最近的一项发展是识别小化合物的适体与锤头状核酶的组合。基于结合靶分子而在适体中诱导的构象变化可以调节核酶的催化功能。
[0120]
如本文所用，术语“反义核酸分子”是指与靶核酸互补的核酸。根据本发明的反义分子能与靶核酸相互作用，更特别地是其能与靶核酸杂交。由于杂合体的形成，靶基因的转录和/或靶mrna的翻译被减少或阻断。已经描述了与反义技术相关的标准方法(参见例如melani等,cancer res.(1991)51:2897-2901)。
[0121]
crispr/cas9以及crispr-cpf1技术几乎适用于所有细胞/模式生物，可用于敲除突变、染色体缺失、dna序列编辑和基因表达调节。基因表达的调节可以通过使用与转录阻遏物缀合的催化性死亡的cas9酶(dcas9)来抑制特定基因(此处为hla-h基因)转录。类似地，催化性失活的“死亡的”cpf1核酸酶(来自prevotella和francisella-1的crispr)可以与合成的转录阻遏物或激活物融合以下调内源性启动子，例如控制hla-h表达的启动子。或者，锌指核酸酶(zfn)或转录激活物样效应子核酸酶(talen)的dna结合结构域可以设计为特异性识别hla-h基因或其启动子区域或其5
’‑
utr，从而抑制hla-h基因的表达。
[0122]
本文还设想了作为靶向hla-h基因或参与hla-h表达的调节分子的抑制性核酸分子提供的抑制剂。减少或消除hla-h表达或调节分子的这种分子包括但不限于大范围核酸酶、锌指核酸酶和转录激活物样(tal)效应子(tale)核酸酶。这种方法在silva等,curr gene ther.2011；11(1):11-27；miller等,nature biotechnology.2011；29(2):143-148和klug,annual review of biochemistry.2010；79:213-231中描述。
[0123]
结合本发明的第二方面，结合第一方面定义的蛋白质的结合分子、优选结合第一方面定义的蛋白质的抑制剂也可以是细胞，例如t细胞，其中t细胞优选是car-t细胞。
[0124]
所述细胞通常在其表面上携带结合分子，优选结合第一方面定义的蛋白质的抑制剂。在t细胞的情况下，所述结合分子、优选地抑制剂是天然存在的或嵌合的t细胞受体，其特异性靶向与第一方面有关的蛋白质。嵌合的抗原受体t细胞(也称为car t细胞)是经过基因工程改造以产生用于免疫治疗用途中的人工t细胞受体的t细胞。
[0125]
因此，嵌合的抗原受体(car，也称为嵌合的免疫受体、嵌合的t细胞受体或人工t细胞受体)是经过基因工程改造的受体蛋白质，可赋予t细胞特异性靶向第一方面定义的蛋白质的新能力。所述受体是嵌合的，因为其将抗原结合和t细胞激活功能组合到一个受体中。
[0126]
本发明在第三方面涉及如本发明第一方面的(i)(g)项定义的核酸分子或本发明第一方面定义的蛋白质或肽在得自受试者的样品在诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或预后肿
瘤和/或将肿瘤分类为hla-h低表达肿瘤或hla-h高表达肿瘤和/或诊断着床失败中的应用。
[0127]
所述样品可以是受试者的体液或来自受试者器官的组织样品。体液的非限制性实例是全血、血浆、血清、尿液、腹膜液和胸膜液、脑脊液、泪液或溶液中的细胞。组织的非限制性实例是结肠、肝脏、乳腺、卵巢和睾丸。组织样品可以通过抽吸或穿刺、切除或通过任何其它获得活检或切除的细胞材料的手术方法获取。所述样品可以是经过处理的样品，例如已冷冻、固定、包埋等的样品。优选的样品类型是福尔马林固定石蜡包埋(ffpe)样品。ffpe样品的制备是标准的医疗实践，这些样品可以长时间保存。
[0128]
如本文所用，术语“诊断”是指鉴定患有疾病症状的受试者中的疾病。根据本发明，所述疾病是肿瘤或着床失败。如本文所用，术语“分级”是指鉴定已被诊断患有肿瘤的受试者中肿瘤细胞的细胞间变程度。最常用的肿瘤分级系统是根据美国癌症联合委员会指南制定的系统。根据这些指南，区分为以下分级类别：gx(无法评估等级)、g1(高分化；低级)、g2(中分化；中级)、g3(低分化，高级)、g4(未分化，高级)。如本文所用，术语“预后”是指从疾病例如肿瘤中恢复的前景或机会和/或是疾病例如肿瘤的生存前景或机会。在肿瘤的情况下，预后可以包含靶病灶的肿瘤大小改变、疾病特异性生存(dss)、无复发生存(rfs)、无进展生存(pfs)和无远处复发生存中的一种或多种预后，其中优选dss。
[0129]
根据本发明的术语“受试者(subject)”是指哺乳动物，优选家畜或宠物动物，例如马、牛、猪、绵羊、山羊、狗或猫，最优选人。
[0130]
如上所述，肿瘤患者中hla-h表达水平升高与肿瘤患者的无进展生存率和总生存率显著降低有关。因此，较高水平的hla-h表达也与较高的肿瘤等级一致。在实施例中进一步证明，在所有肿瘤样品中都发现了hla-h表达，因此hla-h表达不仅可以作为预后标志物，而且可以作为肿瘤的诊断标志物。
[0131]
在上述用途中，可以含有阳性和/或阴性样品以及预定标准。对照样品可获自一名或多名受试者的样品，例如至少5名、至少10名、至少20名、至少30名、至少40名、至少50名、至少60名、至少70名、至少80名、至少90名、至少100名、至少200名、至少300名、至少400名、至少500名、至少600名、至少700名、至少800名、至少900名、至少1000名、至少1500名或至少2000名受试者。预定标准指定先前从阳性和/或阴性样品中获得的值。
[0132]
对于肿瘤的诊断，认为根本不需要标准，因为预计健康受试者不表达hla-h。此外，在实施例中显示在所有研究的肿瘤患者中均检测到hla-h表达。但是阳性和/或阴性样品以及预定标准可以被并入本发明的诊断肿瘤应用中。对于诊断，阳性样品来自一名或多名已知患有肿瘤的受试者，优选地是与要诊断的肿瘤相同身体部位的肿瘤。类似地，阴性样品来自一名或多名已知没有肿瘤的受试者。如果样品中本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽的表达水平与阴性对照或由其衍生的预定标准相比是其逐步增加优选的增加至少1.5倍、2倍、3倍、4倍，则诊断该受试者患有肿瘤。如果样品中本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽的表达水平与阳性对照或由其衍生的预定标准相比逐步增加优选性的相差低于50％、低于25％和低于10％，则受试者被诊断患有肿瘤。例如，如果将阳性对照设置为100％，则显示150％至50％、优选125％或75％的值的患者被诊断为患有肿瘤。
[0133]
同样对于着床失败的诊断，可以使用阳性和/或阴性样品以及预定标准。对于诊断，阳性样品来自一名或多名女性受试者，该受试者具有至少一次着床失败，优选至少两次着床失败，最优选至少三次着床失败。两次或更多次着床失败也称为重复性或复发性着床
失败。类似地，阴性样品来自至少一次成功怀孕、优选至少两次成功怀孕、最优选至少三次成功怀孕的一名或多名女性受试者。如果样品中根据本发明第一方面的核酸分子或第四方面的蛋白质或肽的表达水平与阴性对照或由其衍生的预定标准相比逐步增加优选性的降低至少1.5倍、2倍、3倍、4倍，则诊断该女性受试患有着床失败。如果样品中本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽的表达水平与阳性对照或由其衍生的预定标准相差逐步增加优选性的低于50％、低于25％和低于10％(即更高或更低)，则诊断该女性受试者患有着床失败。例如，如果阳性对照设置为100％，则显示125％或75％值的患者被诊断为着床失败。
[0134]
关于将肿瘤分类为hla-h低表达肿瘤或hla-h高表达肿瘤，注意到并非每个肿瘤都预期表达或大量表达hla-h。因此，为了揭示在患有肿瘤的受试者中根据本发明的结合分子、优选抑制剂是否可以作为治疗选择，可以将肿瘤分类为hla-h低表达肿瘤或hla-h高表达肿瘤，其中仅在后一种情况下所述结合分子或抑制剂是一种选择。对于分类，对照物可以来自已知患有表达hla-h的肿瘤并且优选已知患有可通过本发明的结合分子、优选抑制剂治疗的肿瘤的一名或多名受试者。在待分类的肿瘤的hla-h表达与对照组相比降低逐步增加优选性的至少2倍、至少3倍、至少3倍、至少4倍和至少5倍的情况中，则该肿瘤是hla-h低表达肿瘤。另一方面，如果待分类肿瘤的hla-h表达与对照组相比增加逐步增加优选性的至少2倍、至少3倍、至少3倍、至少4倍和至少5倍，则该肿瘤是hla-h高表达肿瘤。
[0135]
对于预后，阳性对照可以来自死于肿瘤(优选与待预后的肿瘤在同一身体部位的肿瘤)的一名或多名受试者，而阴性对照可以来自患有生存相当长的时间而没有肿瘤进展的肿瘤(优选与待预测的肿瘤在同一身体部位的肿瘤)的一名或多名受试者。相当长的时间是指逐步增加优选性的至少1年、至少2年、至少3年、至少4年和至少5年。如果样品中本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽的表达水平与阳性对照或由其衍生的预定标准相比降低逐步增加优选性的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍，则受试者具有良好的预后。如果样品中本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽表达水平与阴性对照或由此衍生的预定标准相差逐步增加优选性的低于50％、低于25％和低于10％，则受试者具有良好的预后。如果样品中本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽的表达水平与阴性对照或由其衍生的预定标准相比增加逐步增加优选性的至少1.5倍、2倍、3倍、4倍，则受试者具有不佳的预后。如果样品中本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽的表达水平与阳性对照或由此衍生的预定标准相差逐步增加优选性的低于50％、低于25％和低于10％，则受试者具有不佳的预后。预后优选地是对肿瘤治疗的预期治疗成功的预测，其中抗肿瘤治疗优选是化学疗法和/或待诊断的患者优选患有乳腺癌。
[0136]
对于分级，阳性样品可以来自被分级为g1至g4类别之一的一名或多名受试者。对于分级，可以使用多于一个阳性样品，其中阳性样品来自g1至g4类别中的两个、优选三个、最优选所有四个级别的样品。如果在样品中本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽的表达水平与阳性g1对照或由此衍生的预定标准相比相差逐步增加优选性的低于50％、低于25％和低于10％，则将该受试者分级为具有g1肿瘤。这加上必要的变更适用于g2至g4阶段。
[0137]
用于获得本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽的水平的方法如在本领域中确立的方法。
[0138]
例如，根据本发明的核酸分子的水平可以通过实时定量pcr(rt-qpcr)、电泳技术或dna微阵列(roth(2002),curr.issues mol.biol.,4:93-100)获得，其中优选rt-qpcr。在
这些方法中，表达水平可以针对样品中一种或多种参考基因的(平均)表达水平进行标准化。如本文所用，术语“参考基因”意指在被检查的系统即癌症中在rna转录物/mrna水平上具有相对不变的表达水平的基因。这种基因可以称为管家基因。参考基因的非限制性实例是calm2、b2m、rpl37a、gusb、hprt1和gapdh，优选calm2和/或b2m。其它合适的参考基因是本领域技术人员已知的。
[0139]
通过实施例示例说明了rt-qpcr。rt-qpcr在热循环仪中进行，所述热循环仪具有用至少一个特定波长的光束照射每个样品并检测激发的荧光团发出的荧光的能力。热循环仪还能快速加热和冷却样品，从而利用核酸和dna聚合酶的物理化学性质。在实时qpcr中检测pcr产物的两种常用方法是：(1)插入任何双链dna的非特异性荧光染料，及(2)序列特异性dna探针，由标记有荧光报告蛋白质的寡核苷酸组成，只有在探针与其互补序列杂交后才能进行检测(如taqman探针)。后一种检测方法用于下文的实施例中。探针通常是荧光标记的探针。优选地，荧光标记的探针由用荧光报告染料和猝灭剂染料标记的寡核苷酸组成(＝双标记探针)。合适的荧光报告和猝灭染料/部分是本领域技术人员已知的并且包括但不限于报告染料/部分6-famtm、joetm、和猝灭剂染料/部分dabcyl、tamratm、bhqtm-1、-2或-3。优选地，用于本发明所述用途的引物的长度为15至30个核苷酸，特别是脱氧核糖核苷酸。在一个实施方案中，引物被设计成(1)特异于hla-h的靶mrna序列或衍生自其的序列，(2)提供小于120bp(优选小于100bp)的扩增子大小，(3)是mrna特异性的(考虑外显子/内含子；优选不扩增基因组dna)，(4)没有二聚化倾向趋势和/或(5)解链温度tm在58℃至62℃范围内(优选tm约为60℃)。
[0140]
作为qpcr的替代方案，也可以使用电泳技术或dna微阵列来获得本发明的核酸分子的水平。常规的mrna鉴定和定量方法是组合提供大小信息的凝胶电泳及序列特异性探测。northern印迹是这类方法中最常用的技术。核糖核酸酶保护测定(rpa)是作为northern印迹的更灵敏、劳动强度更低的替代方法而开发的。在溶液中用标记的核糖核苷酸探针进行杂交，然后用选择性降解单链rna的核糖核酸酶(例如rnase a和rnase t1)的混合物消化未杂交的样品和探针。随后的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳提供了一种定量方法，也提供了探针杂交区域的大小。对于northern印迹和rpa，定量的准确度和精密度取决于检测方法和使用的参考或标准。最常见的是，探针用32p或33p进行放射性标记，在这种情况下最终的凝胶暴露于x射线胶片或荧光屏，并分别用光密度计或荧光成像仪量化每个条带的强度。在这两种情况下，都可以调整曝光时间以适应所需的灵敏度，但基于荧光体的技术通常更敏感，并且具有更大的动态范围。作为使用放射性的替代方法，探针可以用抗原或半抗原标记，随后与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶缀合的抗体结合，并在加入底物后通过胶片或荧光成像仪上的化学发光进行量化。在所有这些成像应用中，应该从没有探针的凝胶的相邻区域中减去背景。凝胶形式的最大优点是任何参考标准都可以与样品同时成像。同样，对于所有样品，在相同条件下进行管家基因的检测。
[0141]
对于dna微阵列的构建，出现了两种技术。通常，在每种情况下，设计阵列的起点是一组对应于要探测的基因或推定基因的序列。在第一种方法中，寡核苷酸探针是从玻璃底物开始化学合成的。由于寡核苷酸与cdna探针杂交的效率不同，因此合成了与每个感兴趣的基因互补的多个寡核苷酸探针。此外，对于阵列上的每个完全互补的寡核苷酸，构建在单个核苷酸位置具有错配的寡核苷酸并将其用于标准化。寡核苷酸阵列通常以约104至106个
探针/cm2的密度创建。dna微阵列构建的第二种主要技术是将cdna探针直接自动打印到载玻片或其它合适的底物上。获得每个感兴趣基因的dna克隆、纯化并使用通用引物通过pcr从常用载体中扩增。探针自动沉积在大小为50-200μm的点中。在这个间距下，可以实现例如大约103个探针/cm2的密度。
[0142]
根据本发明的蛋白质或肽的水平可以例如通过使用“与蛋白质或肽结合的分子”和优选“与蛋白质或肽特异性结合的分子”来确定。与蛋白质或肽结合的分子是指在已知条件下主要与蛋白质或肽结合的分子。可以使用本文上述结合分子之一的“与蛋白质或肽结合的分子”，优选本发明的蛋白质或肽的抑制剂，例如抗体、适体等。本发明的蛋白质或肽的水平也可以通过使用western印迹分析、质谱分析、facs-分析、elisa和免疫组织化学来获得。这些技术是可用于定性、半定量和/或定量检测蛋白质或肽的方法的非限制性实例。
[0143]
western印迹分析是一种广泛使用且熟知的分析技术，用于检测给定样品例如组织匀浆或机体提取物中的特定蛋白质或肽。其使用凝胶电泳根据(多)肽的长度(变性条件)或蛋白质的3-d结构(天然/非变性条件)分离天然或变性蛋白质或肽。然后将蛋白质或肽转移至膜(通常是硝酸纤维素或pvdf)上，在此使用特异于靶蛋白质的抗体对其进行探测(检测)。
[0144]
此外，质谱(ms)分析是一种广泛使用且熟知的分析技术，其中测量荷电粒子的质荷比。质谱法用于确定粒子的质量，用于确定样品或分子的元素组成，以及用于阐明分子的化学结构，例如蛋白质、肽和其它化合物。ms原理包括将化合物电离以产生荷电分子或分子片段并测量其质荷比。
[0145]
荧光激活细胞分选(facs)分析是一种广泛使用且熟知的分析技术，其中基于每个细胞的荧光特性的特定光散射对生物细胞进行分选。细胞可以固定在4％甲醛中，用0.2％triton-x-100透化，并与荧光团标记的抗体(例如单克隆或多克隆抗hla-h抗体)一起温育。
[0146]
酶联免疫吸附测定(elisa)是一种广泛使用且熟知的灵敏分析技术，其中酶与抗体或抗原连接，作为检测特定蛋白质或肽的标志物。
[0147]
免疫组织化学(ihc)是免疫染色最常见的应用。其涉及通过利用抗体与生物组织中的抗原特异性结合的原理，选择性地鉴别组织切片细胞中的抗原(蛋白质)的过程。组合特定装置，ihc可用于蛋白质表达的定量原位评估(参见cregger等，(2006)arch pathol lab med,130:1026-1030)。定量ihc利用染色强度与绝对蛋白质水平相关的事实。
[0148]
除了本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽之外，从受试者获得的样品中的一种或多种其它化合物可以用于诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或用于肿瘤预后。本领域已知的用于诊断肿瘤和/或用于分级肿瘤和/或用于肿瘤预后的大量标志物可与本发明的核酸分子或本发明的蛋白质或肽联合使用。一些肿瘤标志物可指示特定的肿瘤，例如乳腺癌或结肠癌。肿瘤标志物例如在national cancer institute(https://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosis-staging/diagnosis/tumor-markers-fact-sheet)或癌症基因和标志物的综合数据库cgmd(http://cgmd.in/)中列出。使用一种或多种其它标志物通常会增加诊断、分级或预后的可靠性。
[0149]
本发明在第四方面涉及诊断肿瘤的方法，包含检测得自受试者的样品中本发明第一方面(i)(g)项中定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的存在，其中存在本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一个方面定义的蛋白质表示
受试者中存在肿瘤。
[0150]
本发明在第五方面涉及对肿瘤进行分级和/或肿瘤预后的方法，包含确定得自受试者的样品中本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的水平，其中与对照相比本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的水平升高与更高级别的肿瘤和/或不利的肿瘤预后相关。
[0151]
本发明的第四方面和第五方面的方法以方法的形式实现了本发明第三方面的用途。由此可见，上文提供的与本发明第三方面相关的定义和优选实施方案可同样适用于本发明的第四方面和第五方面。
[0152]
本发明在第六方面涉及用于诊断肿瘤和/或对肿瘤进行分级和/或用于肿瘤预后的试剂盒，其包含(a)用于检测和/或量化得自受试者的样品中本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的方式，和(b)该试剂盒的使用说明书。
[0153]
本发明第六方面的试剂盒以试剂盒的形式实现了进行本发明第三方面的应用所需的方式。为此，上文提供的与本发明第三方面相关的定义和优选实施方案同样可应用于本发明第六方面的试剂盒。
[0154]
用于检测和/或量化本发明第一方面的核酸分子的方式优选是hla_h的一种或多种引物和探针，如用于rt-qpcr中的实施例的表1中所示，特异性hla-h引物对可以任选与相应探针结合使用。用于检测本发明的蛋白质或肽的方式优选是如上文所述的抗体和/或抗体模拟物。为了检测和/或定量，可以例如通过荧光染料或放射性标记对所述抗体和/或抗体模拟物进行标记。上文还描述了荧光染料和放射性标记的实例。
[0155]
试剂盒的各种组分可以包装在一个或多个容器中，例如一个或多个小瓶中。除了所述组分之外，小瓶还可以包含用于储存的防腐剂或缓冲剂。所述试剂盒可包含如何使用该试剂盒的说明书，其优选告知如何使用该试剂盒的组分来诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或用于肿瘤预后。
[0156]
如上文所讨论的，实施例示出hla-h在不同阶段的肿瘤中表达并被肿瘤用于逃避免疫系统。hla-h的高表达水平与较差的预后相关。在实施例4中，进一步显示升高的hla-h表达与晚期肿瘤阶段正相关。因此，通过上文所述的方法和试剂盒在得自受试者的样品中检测和/或定量本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽，是一种诊断肿瘤和/或分级肿瘤和/或肿瘤预后的方式。
[0157]
本发明在第七方面涉及一种监测肿瘤治疗在患有肿瘤的受试者中的无效性的方法，该方法包含(a)确定在治疗开始前从受试者获得的样品中本发明的第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的量；及(b)确定在治疗开始后一次或多次从受试者获得样品中本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的量，其中与a)相比b)中所述量增加表示肿瘤治疗的无效，和/或与a)相比b)中所述量减少表示肿瘤治疗的效力。
[0158]
类似地，本发明在第九方面涉及用于监测需要免疫抑制治疗的受试者中的这种免疫抑制治疗的无效性的方法，包含(a)确定在治疗开始前从受试者获得的样品中本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的量；及(b)确定在治疗开始后一次或多次从受试者获得的样品中本发明第一方面(i)(g)项义的核酸分子
和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的量，其中与a)相比b)中所述量减少表示所述免疫抑制治疗的无效，和/或与a)相比b)所述量增加表示所述免疫抑制治疗的效力。
[0159]
上文提供的与本发明其它方面相关的定义和优选实施方案同样可适用于本发明的第八和第九方面。例如，用于确定本发明的核酸分子和/或本发明的蛋白质或肽的量的方式和方法已经在上文结合本发明的第三方面进行了描述。这些方式和方法同样可以用于本发明的第八和第九方面。
[0160]
肿瘤治疗可以是任何肿瘤治疗方法，例如手术、放射疗法或化学疗法。肿瘤治疗优选是化学疗法。化学疗法包含施用化学治疗剂。可根据本发明使用的化学治疗剂包括细胞抑制化合物和细胞毒性化合物。传统的化学治疗剂通过杀死快速分裂的细胞起作用，快速分裂是大多数肿瘤细胞的主要特性之一。化学治疗剂包括但不限于紫杉烷类、核苷类似物、喜树碱类似物、蒽环类和蒽环类类似物、依托泊苷、博来霉素、长春瑞滨、环磷酰胺、抗代谢物、抗有丝分裂剂和烷化剂。化学疗法也可以是基于铂的，即包含施用基于铂的化合物，例如顺铂。化疗药物经常联合使用，通常持续3-6个月。最常用的治疗方法之一包含施用环磷酰胺加多柔比星(阿霉素；属于蒽环类和蒽环类类似物组)，称为ac。有时，会添加紫杉烷类药物，例如多西紫杉醇，然后将该方案称为cat；紫杉烷攻击癌细胞中的微管。另一种产生相同结果的常用治疗包含施用环磷酰胺、甲氨蝶呤(一种抗代谢物)和氟尿嘧啶(一种核苷类似物)，即cmf。另一种标准化学疗法治疗包含施用氟尿嘧啶、表柔比星和环磷酰胺，即fec，其可以补充紫杉烷例如多西他赛，或补充长春瑞滨。
[0161]
根据第八方面的肿瘤优选地是non-luminal型肿瘤。non-luminal型肿瘤是激素受体(雌激素受体和/或孕激素受体)阴性肿瘤或表达低水平激素受体(雌激素受体和/或孕激素受体)的肿瘤。在乳腺肿瘤的情况下，luminal a型肿瘤是激素受体阳性、her2阴性，并且表达低水平的ki-67，而luminal b型肿瘤是(i)激素受体阳性、her2阴性，并且表达高水平的ki-67，或者是(ii)雌激素受体阳性、孕激素受体阴性、her2阴性，并表达低水平的ki-67。non-luminal型乳腺肿瘤可分为her2阳性肿瘤和tnbc(三阴性乳腺癌)，即her2阴性和激素受体(雌激素受体和/或孕激素受体)阴性。
[0162]
同样，免疫抑制治疗可以是任何免疫抑制治疗方法。例如，免疫抑制治疗可以包含施用一种或多种免疫抑制药物，例如选自糖皮质激素、细胞抑制剂和抗体。根据第十五方面，受试者可能已经接受了移植的器官或组织(例如骨髓、心脏、肾脏、肝脏)，或者可能患有自身免疫疾病或最可能源自自身免疫的疾病(例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、重症肌无力、银屑病、白癜风、系统性红斑狼疮、结节病、局灶节段性肾小球硬化、克罗恩病、白塞氏病、天疱疮、强直性脊柱炎和溃疡性结肠炎)或其它非自身免疫性炎症性疾病(例如长期过敏性哮喘控制或强直性脊柱炎)。
[0163]
如实施例4所示，hla-h表达的增加与较高的肿瘤分期呈正相关。这表明临床上更具侵润性的肿瘤通过增加hla-h表达而对化学疗法产生耐药性。因此，确定本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽的量可用于确定肿瘤治疗在受试者中的无效性。由于hla-h通过其免疫抑制功能帮助肿瘤逃避抗肿瘤治疗，因此本发明第一方面(i)(g)项定义的核酸分子和/或本发明第一方面定义的蛋白质或肽可同样可以用于监测免疫抑制治疗的无效性。
[0164]
根据本发明关于上述肿瘤的所有方面的优选实施方案，所述肿瘤是癌症。
[0165]
癌症是组织的异常恶性新生长，其不具有生理功能，并且由不受控制的通常快速的细胞增殖引起。
[0166]
根据本发明所有方面的一个更优选的实施方案，如上文所述，癌症选自乳腺癌、卵巢癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、膀胱癌、唾液腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、肾癌、肺癌、上消化道癌、结肠癌、结直肠癌、前列腺癌、头颈部鳞状细胞癌、宫颈癌、胶质母细胞瘤、恶性腹水、淋巴瘤和白血病。
[0167]
根据本发明关于上述肿瘤的所有方面的一个更优选的实施方案，所述癌症是膀胱癌或妇科癌症。
[0168]
根据本发明关于上述肿瘤的所有方面的进一步更优选的实施方案，癌症是乳腺癌或卵巢癌。
[0169]
优选卵巢癌，因为在实施例4中对其进行检验。
[0170]
根据如上所述的本发明所有方面的优选实施方案，样品是体液或来自器官的组织样品。
[0171]
关于在本说明书中特别是在权利要求中表征的实施方案，旨在将在从属权利要求中提及的每个实施方案与所述从属权利要求所依赖的每个权利要求(独立或从属)的每个实施方案组合。例如，在独立权利要求1列举了3个选项a、b和c，从属权利要求2列举了3个选项d、e和f以及权利要求3从属于权利要求1和2并列举3个选项g、h和i的情况中，应当理解，说明书明确地公开了对应于以下组合的实施方案：a、d、g；a、d、h；a、d、i；a、e、g；a、e、h；a、e、i；a、f、g；a、f、h；a、f、i；b、d、g；b、d、h；b、d、i；b、e、g；b、e、h；b、e、i；b、f、g；b、f、h；b、f、i；c、d、g；c、d、h；c、d、i；c、e、g；c、e、h；c、e、i；c、f、g；c、f、h；c、f、i，除非另有说明。
[0172]
类似地，并且在独立和/或从属权利要求没有列举选项的那些情况下，应当理解，如果从属权利要求重新提及多个前述权利要求，则由此涵盖的主题的任何组合被认为是明确公开的。例如，在独立权利要求1、从属权利要求2引用权利要求1和从属权利要求3引用权利要求2和1的情况下，由此权利要求3和1的主题的组合如同权利要求3、2和1的主题的组合一样清楚且明确地公开。如果存在引用权利要求1至3任一项的进一步从属权利要求4，则权利要求4和1、权利要求4、2和1、权利要求4、3和1以及权利要求4、3、2和1的主题的组合被清楚且明确地公开。
[0173]
附图简述
[0174]
图1：通过rnaseq在肌肉浸润性膀胱癌样品中测定的膀胱癌中hla-h基因表达和亚型候选基因包括fgf受体的数据分布(n＝407)。
[0175]
图2：通过rnaseq在肌肉浸润性膀胱癌样品中测定的hla-h表达与luminal、basal和emt标志物的spearman相关性(n＝407)。
[0176]
图3：肌肉浸润性膀胱癌样品中hla-h表达与性别、组织学亚型、年龄和淋巴结状态等临床变量的spearman相关性(n＝407)。
[0177]
图4：晚期或转移性尿路上皮癌队列的consort图。在排除具有不足和/或淋巴结组织的ffpe团块后，55名患者的组织可用于分析。
[0178]
图5：在外显子2/外显子3边界确定的hla-h表达与通过标准ihc组确定的亚型标志物的spearman相关性(n＝55)。
[0179]
图6：在外显子2/外显子3边界确定的hla-h表达与通过rt-qpcr确定的亚型标志物
的spearman相关性(n＝55)。
[0180]
图7：在外显子2/外显子3确定的hla-h表达与通过rt-qpcr确定的fgfr靶基因表达的spearman相关性(n＝55)。
[0181]
图8：示出肌肉浸润性膀胱癌患者的疾病特异性生存(dss)概率的kaplan meier图，基于通过rt-qpcr测定量化的hla-h ex2/3表达的分层。使用calm2作为参考基因，通过40-dct方法确定相对mrna表达。
[0182]
图9：示出已经转移至肺和骨或肝脏的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝17)的疾病特异性生存(dss)概率的kaplan meier图，基于通过rt-qpcr测定量化的hla-h外显子2/3表达的分层。使用calm2作为参考基因，通过40-dct方法确定相对mrna表达。
[0183]
图10：示出已经转移至肺和骨或肝脏的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝17)的疾病特异性生存(dss)概率的kaplan meier图，基于通过rt-qpcr测定量化的hla-h外显子2/3和fgfr2表达的分层。使用calm2作为参考基因，通过40-dct方法确定相对mrna表达。
[0184]
图11：示出已经用pd-l1特异性检查点抑制剂治疗的化疗抗性的肌肉浸润性膀胱癌患者(n＝18)的疾病特异性生存(dss)概率的kaplan meier图，基于通过rt-qpcr测定量化的hla-h外显子2/3的分层。使用calm2作为参考基因，通过40-dct方法确定相对mrna表达。
[0185]
图12：示出化疗抗性的肌肉浸润性膀胱癌患者的疾病特异性生存(dss)概率的kaplan meier图，基于通过对肿瘤浸润免疫细胞进行基于ihc的pd-l1染色及通过rt-qpcr测定量化的hla-h外显子2/3进行分层。使用calm2作为参考基因，通过40-dct方法确定相对mrna表达。
[0186]
图13：示出化疗抗性的肌肉浸润性膀胱癌患者的疾病特异性生存(dss)概率的kaplan meier图，基于通过对肿瘤细胞进行基于ihc的pd-l1染色及通过rt-qpcr测定量化的hla-h外显子2/3进行分层。使用calm2作为参考基因，通过40-dct方法确定相对mrna表达。
[0187]
图14：晚期或转移性尿路上皮癌队列的consort图。在除外与新辅助化学疗法前后不足组织配对的匹配ffpe团块后，52名患者可用于分析。
[0188]
图15：膀胱癌中hla-h基因表达和亚型标志物以及药物靶位的数据分布，通过rt-qpcr在肌肉浸润性膀胱癌样品(n＝52)的治疗幼稚tur活检中确定。
[0189]
图16：在外显子2/外显子3边界确定的hla-h表达与通过rt-qpcr确定的亚型标志物的spearman相关性(n＝52)。
[0190]
图17：在3个周期新辅助化学疗法(gem/cis)后病理学完全反应(pcr)的分区检验，基于通过rt-qpcr在tur活检样品中确定的hla-h外显子2/外显子3mrna表达(n＝52)。图中描绘了每组的患者数量和各自化学疗法反应的百分比。
[0191]
图18：在3个周期新辅助化学疗法(gem/cis)后病理学完全反应(pcr)的分区检验，基于通过rt-qpcr在膀胱切除术样品中确定的hla-h外显子2/外显子3mrna表达(n＝52)。图中描绘了每组的患者数量和各自化学疗法反应的百分比。
[0192]
图19：通过rt-qpcr测定法定量的新辅助化学疗法前后hla-h外显子2/外显子3mrna表达和hla-g外显子2/外显子3mrna表达。使用calm2作为参考基因，通过40-dct方法确定相对mrna表达。40-dct值越高，基因表达越高。由于pcr方法的指数性质，每增加1意味
着基因表达翻倍。增加3个dct值意味着hla-h mrna表达增加8倍。
[0193]
图20：通过rt-qpcr确定的在化学疗法前和后样品中hla-h外显子2/外显子3mrna变化与临床病理学变量和反应参数的spearman相关性(n＝27)。
[0194]
实施例举例说明了本发明。
[0195]
实施例1：hla-h表达与膀胱癌候选基因的spearman相关性
[0196]
第一个队列包含407个病例，这些病例由cancer genome atlas(tcga)research network从19个站点积累(network cgar.comprehensive molecular characterization of urothelial bladder carcinoma.nature.2014；507(7492):315-22.doi:10.1038/nature12965.pubmed pmid:24476821；pubmed central pmcid:pmcpmc3962515)。如前所述，rna-seq(hiseq)用于肿瘤样品中的全基因组分析。这样，基于mrna表达模式定义了四种分子亚型(即tcga亚型)：亚型i和ii被描述为luminal样，亚型i由fgfr3改变和升高的fgfr3表达定义，而亚型ii特征在于erbb2突变和雌激素受体β(esr2)富集。亚型iii和iv被描述为基底样，定义为上皮谱系基因和干细胞/祖细胞角蛋白质的表达增加。临床和分子数据可在cbioportal癌症基因组学网站(http://www.cbioportal.org/study？id＝blca_tcga#clinical)上公开获得。数据集已下载并验证。由于tcga队列中的大多数患者患有肌肉浸润性膀胱癌(mibc)，因此t0和t1期的患者被排除在分析之外。除了10名接受放射治疗的患者外，没有记录确切的治疗方式。因此，我们使用记录的pn状态作为手术治疗的替代指标。所有pnx患者均被排除在分析之外，接受新辅助治疗、根治性放疗或有转移记录的患者也是如此。我们分析了hla基因表达与选择的候选标志物之间在相关肿瘤生物学基序方面的关联，例如分子亚型(例如krt5、krt20)、激素轴(例如esr1、esr2)、粘附基序(例如cdh1、cdh2、cdh11)、细胞周期基因(例如ccnd1、ccne2)、亚型特异性靶基因(例如erbb和fgfr)。
[0197]
如图1所示，大量的hla-h“假基因”mrna可以通过rna seq确定，达到与明确定义的基因如erbb2、cdh1和fgfr2及fgfr3相似量。
[0198]
接下来，我们分析了hla-h表达与其它膀胱癌候选基因在亚型和药物靶向方面是否相关。如图2所示，hla-h的mrna表达与luminal样亚型标志物esr2、erbb2、erbb3、cdh1和krt 20呈负相关(p《0.0001)，但与基底样亚型标志物krt5(spearman rho 0.2953；p《0.0001)和上皮间充质转化(emt)标志物snai1-3的候选基因呈正相关。此外，mrna表达与fgfr2、fgfr3和fgfr4呈负相关，相关系数范围介于spearman rho-0.1813至-0.2404之间(分别为p＝0.0002、p《0.0001和p《0.0001)。
[0199]
然后，我们根据淋巴结状态、年龄、性别和组织学亚型(乳头状相对于非乳头状)分析了mibc中hla-h mrna表达与与肿瘤分期、肿瘤分级的关联。如图3所示，hla-h mrna表达与非乳头状组织学亚型显著相关(p＝0.0029)。关于其它临床变量例如性别、年龄或淋巴结状态，没有发现显著的关联。
[0200]
实施例2：通过逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)确定在膀胱切除术及接受化疗方案失败后疾病进展时接受检查点抑制剂药物治疗的肌肉浸润性膀胱癌患者队列中的hla mrna表达水平
[0201]
来自根治性膀胱切除术和相应的经尿道切除术的手术样品的石蜡包埋的肿瘤组织样品来自78名患有中心确认的mibc(pt2-t4)的晚期尿路上皮癌患者。患者接受了靶向pd-1或pd-l1的靶向免疫调节检查点的治疗性抗体治疗。所有参与中心均获得了伦理许可，
所有患者均知情同意。对于从ffpe组织中提取rna，根据可商购的基于珠的提取方法(xtrakt试剂盒；stratifyer molecular pathology gmbh，cologne,germany)处理单个10μm的卷曲样品。简而言之，使用裂解缓冲液液化ffpe组织切片，同时在热混合仪中进行石蜡的熔化。用蛋白质酶k溶液完成组织裂解。此后，在特殊缓冲液的存在下，将裂解物与锗包被的磁性颗粒混合，促进核酸结合。通过混合、磁化、离心和去除污染物的连续循环进行纯化。用100μl洗脱缓冲液洗脱rna，然后将rna洗脱液储存在-80℃直至使用。通过使用实时pcr(rt-qpcr)对被称为稳定参考/管家基因的组成型表达的基因calmodulin 2基因(calm2)进行定量，测试所有提取物的足够高质量rna含量。具有低calm2表达的样品被排除在外。
[0202]
为了通过rt-qpcr方法详细分析基因表达，使用了感兴趣区域两侧的引物和在其间杂交的荧光标记的探针。使用ncbi引物设计工具(www.ncbi.nlm.nih.go)选择靶特异性引物和探针。rna特异性引物/探针序列用于可以通过定位跨越外显子/外显子边界的引物/探针序列进行rna特异性测量。此外，选择引物/探针不与具有已知多态性(snp)的序列区域结合。在存在同一基因的多个同种型的情况中，选择引物以酌情扩增所有相关或选择的剪接变体。通过常规pcr反应检查所有引物对的特异性。进一步优化引物/探针后，表1中列出的引物和探针给出最好的结果。这些引物/探针优于现有技术已知的引物/探针，例如在特异性和扩增效力方面。进行验证实验表明靶向和对照扩增的效力大致相等，这是通过比较δct方法相对定量基因表达的先决条件。
[0203]
表1：进行hla mrna量化使用的引物和探针
[0204][0205][0206]
最后一个队列由来自原发性肿瘤组织的55个膀胱切除术样品组成。尽可能对来自转移病灶或同步的上尿路肿瘤(utuc)的tur活检和ffpe样品进行比较分析。
[0207]
设计用于评估hla-h mrna表达的基因特异性基于taqman的引物/探针组，并针对敏感性和特异性进行了测试。对ck5、ck20、gata3、foxa1、cd44进行免疫组织化学染色以确定hla-h表达是否与国际分类共识定义的膀胱癌亚型相关。选择具有至少50％肿瘤含量(最小肿瘤大小5
×
5mm)、界限分明的侵润边界且没有坏死区域或肉芽肿性炎症的代表性ffpe团块。如下所述在整个载玻片切片上进行和读取所有ihc染色。使用自动ventana benchmark ultra autostainer(ventana,tucson,arizona,usa)对4μm组织切片进行免疫组织化学染色。
[0208]
简而言之，将组织切片脱蜡，通过在tris/borate/edta溶液ph 8.4(ventana)中热处理恢复抗原，并用1％的h2o2封闭内源性过氧化物酶。pdl1免疫染色使用来自dako的可商购检测试剂盒进行，该试剂盒适用于ventana平台(dako 28-8，dako，usa)并经过验证。将ck5(克隆xm26，单克隆小鼠，1:50稀释)、ck20(克隆ks 20.8，小鼠单克隆，稀释1:50)，gata3(克隆l50-823，小鼠，单克隆，1:100稀释)、cd44(克隆df1485，小鼠，单克隆，1:50稀释)和foxa1(克隆ab55178，小鼠，单克隆，abcam，1:2000稀释)根据标准化和认可的染色方案使用benchmark ultra autostainer(ventana,usa)进行免疫染色。使用ultraview tm dab系统(ventana)进行显示。所有组织切片均用苏木精ii/mayer苏木精(ventana)复染。
[0209]
如图5所示，当通过ihc在这组晚期化疗抗性肿瘤中确定膀胱癌亚型时，hla-h的mrna表达与干细胞标志物cd44特别相关(spearman rho 0.3349；p＝0.0125)，该标志物在krt5阳性的基底膀胱癌中更常见。
[0210]
膀胱癌的分子亚型已成为一种主要工具，可将肿瘤分层为免疫细胞浸润较少的激素依赖性luminal肿瘤，以及具有较高肿瘤浸润频率的基底或炎症亚型率，这会影响在肌肉浸润性膀胱癌的非io治疗中的生存。(pfannstiel c,strissel pl,chiappinelli kb,sikic d,wach s,wirtz rm,wullweber a,taubert h,breyer j,otto w,worst t,burger m,wullich b,bolenz c,fuhrich n,geppert ci,weyerer v,stoehr r,bertz s,keck b,erlmeier f,erben p,hartmann a,strick r,eckstein m；bridge consortium,germany；bridge consortium,germany；bridge consortium,germany；bridge consortium,germany.the tumor immune microenvironment drives a prognostic relevance that correlates with bladder cancer subtypes.cancer immunol res.2019jun；7(6):923-938.doi:10.1158/2326-6066.cir-18-0758.epub 2019apr 15.)。
[0211]
因此，特别感兴趣基于分子亚型和免疫检查点靶的靶位确定hla-h mrna表达的相关性。此外，为了进一步阐明剪接事件对这种先前预期的“假基因”的潜在影响，在不同的外显子/外显子边界处设计了不同的引物探针组。
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如图6所示，化疗抗性肌肉浸润性膀胱癌队列中针对分子亚型的标准标志物的mrna表达揭示了pd1阳性免疫细胞在基底型krt5阳性亚型中的浸润优势。然而，krt5和krt20无负相关，表明这个选择的治疗抗性的肿瘤群体是异种的。有趣的是，当量化在外显子2/3的外显子/外显子边界时，hla-h mrna的多样性变得明显，所述外显子2/3编码hla-h的细胞外部分，其中包含与高pd-l1表达密切相关的外显子2/外显子3边界(spearman rho 0.5053；p＝0.0044)，但与pd1表达不相关，并且在膀胱癌的krt5和krt20阴性亚群中占主导地位。
[0213]
hla-h剪接变体与fgfr1、fgfr2、fgfr3和fgfr4的mrna表达的相关性表明，含有外显子2/外显子3的同种型与fgfr mrna表达无关(见图7)。此外，可以确定fgfr家族表达可预测晚期或转移性膀胱癌的生存率，其中fgfr2与良好的结果相关，而fgfr3的突变、融合或过表达与不良结果相关，尽管已在别处提请了使用检查点抑制药物的免疫肿瘤学治疗(ep19168923.1；申请人stratifyer molecular pathology gmbh)。
[0214]
这促使我们研究尽管存在抗pd-l1和pd-1治疗，但与pd-l1 mrna表达相关的hla-h外显子2/外显子3mrna表达的相互作用是否确实对具有较高癌症特异性生存风险的fgfr2
阴性肿瘤的生存率产生影响。如图8所示，如果通过rna特异性rt-qpcr确定原发的fgfr2阴性肿瘤确实表达hla-h，则晚期或转移性尿路上皮癌患者的疾病特异性生存率明显较差，这一情况从使用免疫调节检查点抑制剂如阿特珠单抗、派姆单抗或纳武单抗的一线、二线或三线治疗开始就确定了。表达高水平hla-h ex2/3的fgfr2阴性肿瘤患者2年后生存概率为10％，而不表达hla-h ex2/3的fgfr2阴性肿瘤患者2年后生存概率为65％(p＝0.0013)。
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为了进一步阐明hla-h表达与io治疗后生存率的相关性，通过还考虑原发性转移部位来指定分析。这是基于最初发现io治疗根据转移部位的不同而产生不同的效果，并且对例如内脏转移至肝脏的治疗效果较差，可能是由于pd1阳性t细胞独立于经典检查点机制而被从转移性尿路上皮癌患者的肝脏中排除(eckstein m,sikic d,strissel pl,erlmeier f.evolution of pd-1and pd-l1 gene and protein expression in primary tumors and corresponding liver metastases of metastatic bladder cancer.,eur urology 2018.)。因此，将患者根据转移的第一次表现进行分组，将局部进展、局部区域淋巴结或区域外腹膜后淋巴结分别分类为0或0,5，而扩散到骨、肝、肺、肺和骨或肺和肝以增加的指数分类(分别为1、2、3、4、5)。对于这项分析，有55个来自具有足够临床日期和原发肿瘤组织材料的原发性肿瘤组织数据集可用，其中20名患者有局部进展或淋巴结转移，而18名患者最初转移至骨或肝，17名患者转移至肺部受累无论是作为单一部位还是与骨或肝受累相结合，而所有这些患者都接受了io药物治疗并且主要是》第1线治疗(74％)。
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感兴趣的是，hla-h表达的不良结果在转移情况下特别明显。如图9所示，高hla-h外显子2/3mrna表达(》＝29.95)与较差的疾病特异性生存率相关，其中6名hla-h外显子2/3阳性患者在1年后的生存概率仅为30％，而11名hla-h外显子2/3阴性患者在1年后的生存概率为80％，这仅是由于曲线的早期交叉破坏了对数秩检验而趋于显著。
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当考虑到fgfr2表达时，预测值可能会增加。如图10所示，fgfr阴性患者中的高hla-h外显子2/3mrna表达(》＝29.95)与较差的疾病特异性生存率相关，hla-h外显子2/3阳性患者1年后的生存概率仅为0％，而hla-h外显子2/3&fgfr2阴性患者1年后生存概率为70％。具有高fgfr2表达的转移性膀胱癌患者在1年后具有100％的疾病特异性生存率(p＝0.0012)。
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如上所述，发现hla-h外显子2/外显子3边界的mrna表达与pd-l1 mrna表达相关(spearman rho 0.5053；p＝0.0044)。因此，通过应用的免疫调节检查点治疗的基本原则，即是否应用了pd-1或pd-l1治疗，对整个患者队列(晚期和转移性；n＝55)进行分层似乎是合理的。虽然派姆单抗和纳武单抗通过与pd-1阳性t细胞结合来特异性影响检查点，但阿特珠单抗与存在于肿瘤细胞或巨噬细胞和其它细胞来源的pd-l1结合，从而可能具有更多的多效性。重要的是，当仅观察阿特珠单抗治疗的患者时，hla-h外显子2/外显子3边界表达的重要性变得特别明显。如图11所示，高hla-h外显子2/3mrna表达(》＝29.89)与较差的疾病特异性生存率相关，hla-h外显子2/3阳性患者在1年后的生存概率仅为10％，而hla-h外显子2/3阴性患者在1年后的生存概率为80％(p＝0.0240)。
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为了进一步阐明pd-l1表达与hla-h功能之间的相互作用，并鉴于多效性效应，根据免疫细胞(可能是巨噬细胞)上pd-l1蛋白质表达对接受免疫调节检查点抑制剂治疗的晚期和转移性膀胱癌患者队列进行分层，基于用于pd-l1测定的ivd检测。在此，基于与ihc检测系统无关的基础过氧化物酶活性，选择5％阳性免疫细胞的阳性截止值以排除对巨噬细
胞的非特异性染色影响。
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有趣的是，pd-l1阳性肿瘤浸润免疫细胞频率较低的患者生存率较高，而pd-l1阳性肿瘤浸润免疫细胞频率较高的患者生存率较低，特别是在表达hla-h外显子2/外显子3同种型时。如图12所示，高hla-h外显子2/3mrna表达(》＝29.95)与具有5％以上pd-l1阳性免疫细胞的患者中不良的疾病特异性生存率相关，hla-h外显子2/3阳性患者1年后生存概率仅为10％，而hla-h外显子2/3阴性患者和没有或较低频率pd-l1阳性免疫细胞的患者1年后生存概率为60％(p＝0.0156)。
[0221]
然而，已知具有pd-l1阳性免疫细胞的肿瘤组织相对于pd-l1阳性肿瘤细胞存在重叠，我们还检验了肿瘤细胞上hla-h表达与pd-l1表达的相互作用，采用10％的pd-l1阳性肿瘤细胞标准截止值。
[0222]
同样，与具有较低hla-h外显子2/外显子3表达水平的患者相比，具有高hla-h外显子2/外显子3表达水平的pd-l1阳性患者的生存率较差。如图13所示，高hla-h外显子2/3mrna表达(》＝33.19)与具有至少10％pd-l1阳性肿瘤细胞的患者和hla-h外显子2/3阳性患者中较差的疾病特异性生存率相关，1年后生存概率仅为0％，而hla-h外显子2/3阴性患者1年后的生存概率为40％，没有或低于10％pd-l1阳性肿瘤细胞的患者有生存概率为65％(p＝0.0022)。
[0223]
实施例3：通过逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)在用3个周期的吉西他滨/顺铂化疗方案新辅助治疗的肌肉浸润性膀胱癌患者队列中测定hla-h mrna表达水平
[0224]
在化疗和相应的根治性膀胱切除术之前经尿道切除术的手术样品的石蜡包埋的肿瘤组织样品来自55名组织学证实为mibc、uicc ii和iii期(ct2-3和cn0或cn m0)的晚期尿路上皮癌患者。患者接受了3个新辅助治疗周期，所述新辅助治疗是吉西他滨1250mg/m2(d1；d8)和顺铂70mg/m2(d1)，然后进行根治性膀胱切除术。主要纳入标准是治疗前和治疗后ffpe组织的可用性。主要排除标准是变异的组织学以获得同质膀胱癌队列进行分析。从参与中心获得伦理许可，所有患者均知情同意。对于从ffpe组织中提取rna，根据可商购的基于珠的提取方法(xtrakt试剂盒；stratifyer molecular pathology gmbh，cologne,germany)处理单个的10μm卷曲样品。简而言之，使用裂解缓冲液液化ffpe组织切片，同时在热混合仪中进行石蜡的熔化。用蛋白质酶k溶液完成组织裂解。此后，在特定缓冲液的存在下，将裂解物与锗包被的磁性颗粒混合，促进核酸结合。通过混合、磁化、离心和去除污染物的连续循环进行纯化。用100μl洗脱缓冲液洗脱rna，然后将rna洗脱液储存在-80℃直至使用。通过对被称为稳定参考/管家基因的组成型表达的基因钙调蛋白质2基因(calm2)进行定量，针对足够高质量rna含量对所有提取物进行测试。具有低calm2表达的样品被排除在外。由于肿瘤材料不足而排除了6个样品后，最终队列由来自原发性肿瘤组织的52个膀胱切除术样品组成。对来自膀胱切除术组织的tur活检样品和ffpe样品进行了比较分析。
[0225]
为了验证hla-h表达在膀胱癌中的意义，除了io疗法之外，hla-h已在一个类似大小的肌肉浸润性膀胱癌队列中进行了量化，该队列尚未接受任何全身治疗。如图15所示，可通过rt-qpcr确定外显子2/外显子3边界处的大量hla-h“假基因”mrna。此外，确定了膀胱癌亚型标志物(krt5，krt20)和靶位(pd-1、pd-l1、esr1、erbb2、fgfr1-4)。
[0226]
首先，在新辅助治疗mibc队列的tur活检样品中评估了hla-h与膀胱癌亚型标志物和靶位的关联。如图16所示，通过对外显子2/外显子3边界进行rt-qpcr确定的hla-h表达与
krt5和fgr1表达正相关，这两者都与基底表型相关。此外，与krt20和esr1呈现负相关，krt20是经典的luminal型标志物。因此，这些关联反映了在400个mibc的大部分膀胱切除术样品中的初步发现，其也含有t1肿瘤和变异组织学，尽管可能由于样品大小有限而未达到统计学意义。
[0227]
接下来，如上所述，hla-h外显子2/外显子3mrna表达与对三个周期的新辅助化疗(gem/cis)的反应相关，病理学完全反应被定义为化疗后手术(膀胱切除术)样品中没有有活力的肿瘤细胞。共42％的患者达到了病理学完全缓解。当通过基于相对hla-h外显子2/外显子3mrna表达的分区测试对患者进行分层时，占所有肿瘤60％的表达高水平hla-h的肿瘤对新辅助化疗的反应性降低2倍，hla-h阳性肿瘤在29％的病例中有反应，hla-h阴性肿瘤在62％的病例中有反应。这表明在化疗前膀胱癌活检材料中确定了hla-h表达。共计70％的高hla-h表达肿瘤对新辅助化疗没有反应。
[0228]
接下来在三个周期的新辅助化疗(gem/cis)后确定膀胱切除术样品中hla-h外显子2/外显子3mrna的表达。如图18所示，hla-h表达在无反应的肿瘤中保持同样高，并且几乎相同的分为耐药和有反应的肿瘤。共计70％的高hla-h表达肿瘤对新辅助化疗没有反应。
[0229]
实施例4：通过逆转录(rt)定量pcr(rt-qpcr)在用6个周期的紫杉醇/顺铂化疗方案新辅助治疗的晚期卵巢癌患者队列中确定hla-h mrna表达水平
[0230]
在2004年9月至2007年12月间，将45名新诊断患者纳入研究，所述患者经组织学证实为figo iii-iv期上皮性卵巢癌或腹膜癌且不适合最佳前期手术和新辅助化疗候选者(所述癌在下文中也称为卵巢癌)。其它纳入标准是年龄》18岁，血液学、肾、肝和心脏功能足以进行基于铂类的化疗。排除标准是karnofsky体能状态(kps)低于70％、有其它恶性肿瘤病史和手术禁忌症。通过开放式腹腔镜检查在基线时排除了最佳减瘤手术的可能性。在排除了9名活检样品不足以进行微阵列分析的患者和1名因组织学修正后诊断为腹膜间皮瘤而发现不合格的患者之后，最初的45名患者的研究人群被限制在35名。施用6个周期的新辅助治疗方案，所述方案是每3周q3施用超过3小时的卡铂auc 5和紫杉醇175mg/m2的标准方案。在3名75岁以上的患者和1名体力状态较差的患者(kps 70％)中，卡铂单药优于联合化疗。
[0231]
手术后通过手术样品分析评估组织病理学反应。迄今为止，还没有建立明确的组织病理学标准来描述卵巢癌新辅助化疗后的治疗反应。根据有关卵巢癌(le等，2007,sassen等，2007)和乳腺癌(ogston等，2003)对初级化疗反应的文献，作为完全病理学反应，手术样品中没有癌细胞，并且作为非常好的部分缓解认为是仅持续存在小簇(《1cm)或单独的癌细胞，并且手术后没有肉眼可见的残留物。与初始诊断性腹腔镜检查相比，部分病理学缓解定义为手术时肿瘤负荷减少30％至90％，而疾病稳定定义为手术时肿瘤负荷没有减少或减少低于30％。只有完全和非常好的部分缓解的患者被认为是病理学反应者，而所有其它病例被认为是病理学无反应者。
[0232]
对于mrna分析，将收集的组织速冻并储存在液氮中直到分析。将大约20-100mg冷冻卵巢肿瘤组织在液氮中碾碎。使用商业试剂盒(qiagen)提取rna，在agilent 2100生物分析仪(agilent technologies，palo alto，ca，usa)上评估rna完整性，使用invitrogen试剂盒(invitrogen corp.)从1mg总rna合成cdna，并使用针对hla-h和亚型标志物以及靶基因的rna特异性引物探针组进行rt-qpcr，如上所述。分析仅限于治疗前和治疗后组织样品可
用的病例，总共可以对29名患者进行配对分析。
[0233]
与上述膀胱癌的情况类似，在卵巢癌患者治疗前活检样品和治疗后切除样品的rna提取物中可检测到大量hla-h mrna，其在相同组织中达到与hla-g相当的水平。然而，hla-h外显子2/外显子3的中位mrna表达(40-dct为31.22)低于hla-g外显子2/外显子3(40-dct为35.00)。正如预期的那样，hla-h和hla-g表达没有密切的相关性。
[0234]
当将化疗前后的hla-h外显子2/外显子3mrna表达的差异与病理学反应相关联时，化疗后hla-h表达增加与病理学反应呈负相关，通过pearson相关性(r＝-0.2290)和spearman相关性(r＝-0.1922)均示出这个结果。如图20所示，与病理分期的相关性表明，hla-h表达的增加与较高的figo分期呈正相关(spearman r＝0.4219；p＝0.0226)，表明临床上更具侵润性的肿瘤通过增加hla-h表达对化疗产生反应。有趣的是，这种能力往往在低级别肿瘤中占主导地位(spearman r＝-0.3274；p＝0.095)。