可羟基化维生素D3C-1和C-25的P450酶及其基因、表达载体、重组菌与应用的制作方法

可羟基化维生素d3 c-1和c-25的p450酶及其基因、表达载体、重组菌与应用
技术领域
1.本发明涉及一种可羟基化维生素d3 c-1和c-25的p450酶及其基因、表达载体、重组菌与应用，属于酶工程技术领域。


背景技术：

2.维生素d是固醇类衍生物，基本母核结构是环戊氢烯菲，维生素d3是最重要的维生素d族化合物。哺乳动物体内维生素d3是缺乏活性的激素前体，需要经过肝、肾等细胞中细胞色素p450酶的作用，转化为具有生理活性的羟基化形式。常见的活性羟基维生素d3有25(oh)vd3(骨化二醇)和1α,25(oh)2vd3(骨化三醇)。25(oh)vd3是维生素d3的主要活性形式，被认为是检测体内维生素d状态的最佳指标，医学检验中通过测定25(oh)vd3浓度确定体内维生素d的含量。25(oh)vd3被用于治疗骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病的治疗，以及血液透析所致的低血钙症，使血清钙水平增高。25(oh)vd3是获得美国食品药品管理局(fda)认证的一般公认安全级(gras)维生素d3代谢物，在人用药、饲料添加剂等方面有广泛应用。1α,25(oh)2vd3是比25(oh)vd3活性更高的形式，用于调节血浆钙和磷的稳态，控制多种细胞反应，包括细胞分化和增殖，已经在临床上用于治疗慢性肾功能衰竭，甲状旁腺功能亢进症，骨质疏松症和牛皮癣，生理活性比25(oh)vd3高2-5倍。
3.化学法合成25(oh)vd3(骨化二醇)和1α,25(oh)2vd3(骨化三醇)的基本合成路线是zhu等提出的以胆固醇及相关衍生物为原料，通过多步化学反应(过程需要多步基团保护和脱保护，经光照反应，开环和异构化)，该过程反应步骤多、转化率低，且分离纯化过程复杂。微生物转化法，以sakak为代表的通过p450酶系进行，具有生产成本低、反应高度特异性等优点，在维生素d3活性药物生产领域具有广泛的应用前景。
4.现有报道的p450酶cyp109a2只有维生素d3的c25位羟化活性，被誉为维生素d3选择性最高的p450，而现有报道的p450酶cyp109e1对维生素d3的24s和25位羟化活性，目前还没有报道用来催化维生素d3 c-1和c-25的p450酶，为了提高维生素d3生物转化产物的活性，筛选能够用来生产1α,25(oh)2vd3且1α,25(oh)2vd3产量高的p450酶具有重要的意义。


技术实现要素：

5.为解决上述技术问题，本发明提供一种可羟基化维生素d3 c-1和c-25的p450酶。本发明的p450酶能够在枯草芽孢杆菌中高效表达，催化维生素d
3 1α位、25位双羟化，且重组菌能够在37℃转化维生素d3为25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3，转化率达87.64％，25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3产量分别为7.78mg/l和10.62mg/l，产物中1α，25(oh)2vd3产量高于25(oh)vd3，产物的生物活性高，对于活性羟基维生素d3的生产具有重要作用。
6.本发明的第一个目的是提供一种可羟基化维生素d3 c-1和c-25的p450酶，所述的p450酶的氨基酸序列如seq id no.1所示。
7.本发明的第二个目的是提供一种编码所述的p450酶的基因。
8.进一步地，所述的基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
9.本发明的第三个目的是提供一种携带所述基因的重组表达载体。
10.进一步地，所述的重组表达载体是以pma5为质粒。
11.本发明的第四个目的是提供一种表达所述的p450酶的重组菌。
12.进一步地，所述的重组菌是以枯草芽孢杆菌wb600为表达宿主。
13.本发明的第五个目的是提供所述的p450酶或所述的重组菌在催化维生素d3生产25(oh)vd3和1α,25(oh)2vd3中的应用。
14.进一步地，所述的催化是在28-40℃，120-280r
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转化50～100h，得到产物25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3。
15.进一步地，所述的催化的底物维生素d3的浓度为0.25-0.5g/l。
16.在本发明中，底物维生素d3浓度选择0.25-0.5g/l，维生素d3为脂溶性，在进一步提高浓度时，大部分会沾在反应容器上，产量和转化率会有所提高，但是会造成大量底物的浪费，因此选择0.25-0.5g/l的维生素d3，能够较高的利用底物进行转化。
17.本发明的有益效果是：
18.本发明的p450维生素d3羟化酶cyp109a2-h和重组菌及应用，与现有技术相比，本发明的p450维生素d3羟化酶cyp109a2-h，经与已报道来源于dsm319的cyp109a2氨基酸序列比对，同源性为95.53％；本发明的p450酶能够在枯草芽孢杆菌中高效表达，催化维生素d
3 1α位、25位双羟化，且重组菌能够在37℃转化维生素d3为25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3，转化率达87.64％，25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3产量分别为7.78mg/l和10.62mg/l，产物中1α，25(oh)2vd3产量高于25(oh)vd3，产物的生物活性高，对于活性羟基维生素d3的生产具有重要作用。
附图说明：
19.图1为枯草芽孢杆菌重组菌蛋白sds-page图谱。
20.m：marker；泳道为枯草芽孢杆菌wb600-pma5-cyp109a2-h全蛋白样品。
21.图2为实施例5重组菌转化维生素d3为25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3的高效液相色谱图。
22.图3为不同温度下重组菌转化维生素d3为25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3的高效液相色谱图。
具体实施方式
23.下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
24.以土壤基因组提取试剂盒提取样品总dna为模板扩增p450 vd3羟化酶cyp109a2-h基因cyp109a2-h如seq id n0:2所示，cyp109a2-h氨基酸序列如seq id n0:1所示。以pma5为质粒构建重组表达质粒pma5-cyp109a2-h，以枯草芽孢杆菌wb600为表达宿主，实现p450 vd3 1α、25-双羟化羟化酶cyp109a2-h的高效表达。
25.所述的p450 vd3羟化酶cyp109a2-h的克隆及表达方法：
26.实施例1：宏基因组技术筛选p450酶基因
27.基于宏基因组技术，在提前埋有维生素d3的土壤收集土样，用土壤基因组提取试剂盒提取样品总dna。为宏基因组dna为模板，以p450酶的保守序列进行简并引物设计并且进行pcr扩增，筛选目的p450酶基因，然后根据测序结果进一步设计引物通过pcr技术扩增获得完整的基因编码序列。扩增获得的片段测序后与ncbi数据库进行比对，根据结果再进一步设计引物，扩增获得完整的维生素d3羟化p450酶基因编码序列。该方法基于宏基因组技术，结合数据库中角p450的保守序列进行直接扩增筛选，与基于宏基因组文库构建筛选方法相比，具有操作方法简单易行，筛选周期短等优点。
28.实施例2：维生素d
3 1α、25-双羟化p450酶cyp109a2-h及其基因序列cyp109a2-h的克隆
29.前期通过基于宏基因组技术获得了维生素d3羟化p450酶基因信息，设计引物扩增目的基因，引物序列如下：
30.引物f:aaaaggagcgatttacatatgatgaatccaaaagcagtgaaaaga
31.引物r:gagctcgactctagaggatcctcaggcgttattaaaagcaatttc
32.以获得的dna序列为模板，以上述核苷酸序列作为引物，pcr扩增巨大芽孢杆菌(bacillus megaterium)h-1的维生素d
3 1α、25-双羟化p450酶cyp109a2-h及其基因序列cyp109a2-h。pcr反应在50μl的体系中进行，反应条件为：95℃预变性3min后开始循环；95℃变性30s，62.4℃退火30s，72℃延伸1.5min，共34个循环；72℃终延伸5min。
33.通过对获得pcr产物进行测序、基因走读和基因拼接，获得了cyp109a2-h基因全序列(1212bp)，如seq id no:2所示。经与已报道来源于dsm319的cyp109a2核酸序列比对，同源性仅为94.64％。经翻译获得了cyp109a2-h氨基酸序列(403aa)，如seq id no:1所示。经与已报道来源于dsm319的cyp109a2氨基酸序列比对，同源性为95.53％。因此，确定为一新的p450酶基因。
34.实施例3：重组表达质粒的构建
35.采用的表达质粒是枯草芽孢杆菌表达质粒pma5，将质粒pma5与维生素d
3 1α位、25位双羟化p450酶cyp109a2-h的pcr产物分别双酶切后割胶回收，用t4连接酶在16℃连接过夜，连接产物转化e.coli jm109感受态细胞，在含氨苄抗性(50mg/l)的lb平板培养过夜，筛选阳性转化子，进行富集培养后提取质粒，命名为pma5-cyp109a2-h。
36.实施例4：重组工程菌的构建及诱导表达
37.取实施例3获得的枯草芽孢杆菌表达质粒pma5-cyp109a2-h转化枯草芽孢杆菌bacillus subtilis wb600感受态细胞，在含kana抗性(100mg/l)的lb平板培养过夜，筛选阳性转化子wb600-pma5-cyp109a2-h。挑取转化子至10ml lb液体培养基37℃培养36h，对菌液的蛋白进行sds-page分析。结果如图1所示，泳道为枯草芽孢杆菌wb600-pma5-cyp109a2-h菌液样品，目的蛋白cyp109a2-h大小约为46kda，从图看到在相应的位置出现正确的条带，证明该酶蛋白可以在枯草芽孢杆菌中可溶性表达。
38.实施例5：重组菌转化维生素d3的分析
39.将重组菌枯草芽孢杆菌wb600-pma5-cyp109a2-h在lb培养基培养12h，加入0.25g/l的vd3进行转化。30℃，220r
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转化72h后，取样进行高效液相色谱分析，结果如图2所示。计算得到cyp109a2-h转化维生素d3为25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3，转化率达73.98％。
40.实施例6：维生素d3羟化酶最适催化温度分析
41.将重组菌枯草芽孢杆菌wb600-pma5-cyp109a2-h在lb培养基培养12h，加入0.25g/l的vd3进行转化。分别在30℃和37℃，220r
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转化72h后，取样进行高效液相色谱分析，结果如图3所示。30℃计算得到cyp109a2-h转化维生素d3为25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3，转化率达73.98％，25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3产量分别为14.81mg/l和5.31mg/l。37℃计算得到cyp109a2-h转化维生素d3为25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3，转化率达87.64％，25(oh)vd3和1α，25(oh)2vd3产量分别为7.78mg/l和10.62mg/l。本发明的重组菌能够催化维生素d3为活性更高的产物，具有重要的工业应用价值。
42.以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
43.44.45.46.