通过Npas2抑制来再生结缔组织的功能和表型

通过npas2抑制来再生结缔组织的功能和表型
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年9月4日提交的美国临时专利申请第62/895,821号的权益和优先权，其内容通过引用以其整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及用于改善或加速受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向需要其的受试者的伤口施用抑制时钟基因(clock gene)的表达的药剂，其中所述时钟基因是神经元pas结构域蛋白2(npas2)。本发明还涉及用于再生牙槽骨的方法，所述方法包括向需要其的受试者的骨丢失部位施用抑制npas2的表达的药剂。本发明进一步涉及再生需要其的受试者的伤口部位处的结缔组织的方法，所述方法包括向伤口施用治疗有效量的npas2表达抑制剂。本发明还涉及用于减小伤口面积大小(wound area size)的方法，所述方法包括向受试者的开放性伤口部位局部施用抑制npas2的表达的药剂。


背景技术：

4.皮肤和口腔中未闭合的开放性伤口对当前的医疗和牙科治疗构成重大威胁。软组织伤口管理的治疗目标是感染控制和伤口闭合。当eliason和mclaughlin在1934年发表一篇关于术后伤口并发症的经典评论时，他们的关注点主要是手术部位感染。如今，抗生素和无菌程序的有效使用显著降低了手术部位感染的风险。然而，限制疤痕形成的挑战仍然存在问题。目前实现伤口闭合的方法采用缝合线和粘合剂(4)，这些方法在一个多世纪以来基本上没有变化。
5.面部和头部是受伤最频繁的区域之一，受伤可能是由于事故、袭击或战场受伤造成的。面部伤口占所有急诊科就诊的4％至7％，并且急诊科治疗近90％的面部软组织损伤，其中多种伤口闭合方法对于临床医生是可获得的。虽然严重的面部损伤(如面部癌症、烧伤或骨折)显然会给患者带来许多社会后果，但即使轻微的面部损伤也会表现出重大的社会心理影响，导致对生活的满意度下降，对身体形象的感知改变，以及创伤后应激障碍、酗酒、入狱、失业或婚姻问题的发生率更高。
6.口腔中的原发性牙周炎军团在牙龈与牙齿表面之间呈现出开放的空间(被称为牙周袋)，其为口腔微生物群提供了异常的环境，导致病原菌的生长。牙周袋的闭合目前仅通过袋缩小手术来实现。美国非住院人口的全国健康和营养检查调查(national health and nutrition examination survey)报告称，46％的有牙齿的成年人(代表6470万人)患有牙周炎。牙周炎的患病率与年龄增长正相关，并且其中8.9％的人患有严重或侵袭性牙周炎。类似地，牙周炎是伴侣犬中最常见的口腔疾病。根据美国兽医牙科学院(american veterinary dental college)，牙周病是最常见的临床病症，并且在一些犬品种中患病率可能达到超过90％，呈现出大量未被满足的兽医患者群体。
7.因此，鉴定可以施用于受试者的伤口(特别是皮肤和口腔中的开放性真皮伤口)以增强伤口愈合、再生牙槽骨和/或再生伤口部位处的结缔组织的药剂是非常重要的。


技术实现要素：

8.在一个方面中，本发明提供了一种用于改善或加速受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向需要其的所述受试者的伤口施用抑制时钟基因的表达的药剂，其中所述时钟基因是神经元pas结构域蛋白2(npas2)。
9.在另一个方面中，本发明提供了一种用于再生牙槽骨的方法，所述方法包括向需要其的受试者的骨丢失部位施用抑制npas2的表达的药剂。
10.在另外的方面中，本发明提供了一种用于在需要其的受试者的伤口部位处再生结缔组织的方法，所述方法包括向伤口施用治疗有效量的npas2表达抑制剂。
11.在另一个方面中，本发明提供了一种用于减小伤口面积大小的方法，所述方法包括向受试者的开放性伤口部位局部施用抑制npas2的表达的药剂。
12.本发明的其他特征和优点将通过以下详细描述、实例和附图变得显而易见。然而，应当理解，详细说明和具体实例虽然指示了本发明的某些实施例，但仅以说明的方式给出，因为根据该详细描述，在本发明的精神和范围内的各种变化和修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。只要合适，本发明的任何实施例都可以与本发明的一个或多个其他实施例组合，即使这些实施例是在本发明的不同方面下描述的。
附图说明
13.以下附图形成本说明书的一部分，并且被包含以进一步说明本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个并结合本文呈现的具体实施例的详细描述，可以更好地理解所述本公开的发明。本专利或申请文件含有至少一幅彩色附图。在请求并支付必要的费用后，专利局将会提供带有彩色附图的本专利或专利申请公开物的副本。
14.图1a-1c示出了在npas2-/-小鼠中全层皮肤穿孔伤口愈合被加速。图1a是从手术后0至12天获得的皮肤伤口的标准化照片，其描绘了进行性伤口闭合和收缩。图1b示出了在第2、4、6和12天计算的相对伤口面积。npas2 ko小鼠示出了在第12天的伤口面积明显小于wt小鼠的伤口面积(**p《0.01)。图1c示出了第7天伤口的组织学观察结果，其显示肉芽组织(gt)的形成和上皮完整性(ep)的恢复；然而，清楚地观察到伤口边缘(虚线)。在第14天，由毛囊(hf)突出的伤口边缘不太清晰，并接近肉芽组织(gt)。
15.图2a-2c示出了wt、npas2 /-和npas2-/-皮肤成纤维细胞的表征。图2a示出了通过基因组dna pcr确定的每个成纤维细胞批次的基因型。wt npas2等位基因产生250bp pcr产物，而突变等位基因产生350bp pcr产物。图2b示出了wst-1测定显示npas2 ko成纤维细胞中增加的细胞增殖率(**p《0.01，经由tukey分析在时间点与wt相比的显著差异)。图2c示出了核心时钟基因的表达，并且lacz报告基因每6次通过rt-pcr测定48小时(图中的p值：时间与基因型因素之间的相互作用的双向anova。*p《0.05，**p《0.01，经由tukey分析在各时间点与wt相比的显著差异)(图2c)。
16.图3a-3h(c)示出了使用wt、npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞的体外伤口愈合实验。图3a是延时显微照片的图像，其捕捉了进行性划痕伤口愈合测定。图3b示出了在npas2 ko组中在12小时和24小时时在划痕的区域内迁移细胞的数量显著较多(**p《0.01)。图3c示出了浮动胶原凝胶的标准化图像，其描绘了npas2 ko成纤维细胞组中的增加的胶原凝胶收缩。图3d示出了胶原凝胶的面积随着时间的推移而减少。凝胶收缩速度在npas2 ko成纤维
细胞中较快(**p《0.01，仅示出了与wt相比的显著差异)。图3e是基于flecs的单细胞收缩的示意图。图3f示出了在npas2 ko成纤维细胞中收缩细胞的比率增加。图3g示出了npas2 ko突变不影响真皮成纤维细胞中β-肌动蛋白(actb)和α-sma(acta2)的基因表达。图3h(a)-3h(c)示出了真皮成纤维细胞中整合素亚基αv(itgav)、β3(itgb3)和β5(itgb5)的稳态基因表达水平不受npas2 ko突变的影响。
17.图4a-4c示出了通过wt、npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞在体外的胶原合成。图4a示出了i型胶原(col1a1和col1a2)、iii型胶原(col3a1)、xii型胶原(col12a1)和xiv型胶原(col14a1)的基因表达(**p《0.01，*p《0.05，仅显示与wt相比的显著差异)。facit xii型和xiv型胶原在npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞中示出了显著增加的稳态mrna水平。图4b示出了培养的成纤维细胞的图像，其中天狼猩红染色突出了胶原纤维的合成。图4c示出了通过天狼猩红染色来测量体外胶原纤维沉积(**p《0.01，通过单向anova和事后holm测试)。
18.图5a-5c示出了伤口愈合区域中胶原纤维结构的评价。图5a示出了共聚焦激光扫描显微镜检查，其描绘了在手术后14天用天狼猩红染色的胶原纤维结构。图5b示出了使用伤口闭合面积(wca)测量伤口闭合率，该伤口闭合面积被计算为肉膜(pc)之间的isa(a)的宽度减去肉芽组织面积(gt:b)，其通过isa被归一化。图5c示出了在npas2 /-和npas2-/-小鼠中在第14天伤口闭合率更大，尽管仅在wt与npas2-/-组之间实现了统计学显著性。
19.图6a-6e示出了在npas2 ko小鼠中拔牙诱导的牙槽骨再生。图6a示出了用上颌左侧第一磨牙拔除治疗c57bl6j(b6)野生型(wt)小鼠，其经历口腔粘膜和牙槽骨两者的伤口愈合(箭头)。b6背景上的npas2 ko小鼠在拔牙窝中表现出快速的伤口闭合和稳健的骨再生。图6b示出了第2周拔牙伤口愈合的microct图像。图6c示出了3个根窝中每一个的基于microct的三维数据分析(bv/tv)，其描绘了在npas2 ko小鼠中在第1周(w1)和第2周(w2)中的快速骨填充。tukey的多重比较检验，*：p《0.05；**：p《0.01。图6d示出了骨髓msc的体外矿化。在成骨培养基中温育28天后，msc合成茜素红阳性矿化结节区域，其在npas2 ko bmsc中显著增加。图6e示出了通过rt-pcr的bmp-2的表达。npas2 ko msc(骨髓来源的间充质基质/干细胞)在成骨培养基中温育后显著增加了bmp-2的表达。统计分析：图6c、6d tukey的多重比较检验，*：p《0.05；**：p《0.01，图6e学生t检验，**：p《0.01。
20.图7a-7b示出了利血平对骨髓基质细胞成骨分化的影响。图7a示出了，在补充有利血平(dwn-c)的成骨培养基中培养的野生型bmsc在培养第21天时证明了增加的茜素红阳性体外矿化。条形图：tukey分析，其中p《0.05。图7b示出了，从培养21天后的bmsc制备的总rna经受骨桥蛋白(opn)和骨钙素(ocn)以及看家基因(gapdh)的实时rtpcr。表达值用第0天的rna归一化。
21.图8示出了用利血平包封的dnv治疗小鼠背部皮肤穿孔。
22.图9a-9c示出了小鼠牙周炎模型中的牙周组织再生。图9a示出了牙周炎诱导的牙槽骨再吸收和结扎诱导的小鼠牙周炎的microct图像。图9b是结扎诱导的牙周炎的小鼠模型的流程图，其中在结扎线去除后局部应用利血平 dnv。
23.图9c示出了结扎线放置诱导的严重炎症、上皮增生和结缔组织胶原紊乱，与牙周炎一致。结扎线去除消退了炎症反应；然而，上皮和结缔组织异常仍然存在。牙槽骨的高度没有变化(黑色箭头)。在利血平 dnv治疗组中，上皮和结缔组织被归一化。存在明显的迹象表明牙槽骨被再生(在白色箭头与黑色箭头之间)。利血平 dnv治疗的组表现出与对照相似
的牙龈结缔组织胶原的重新排列，并且还观察到牙槽骨的再生。
24.图10示出了顶部抑制剂化合物dwnc的滴定测定。将dwn1从100μm连续稀释至0.2nm，并应用于msc npas2-lacz。有效浓度(ec)通过lacz表达来确定，并且抑制浓度(ic)使用钙黄绿素am/hoechst 33342染色通过细胞活力来确定。dwnc和dwn1都是利血平。
25.图11a-11d(b)示出了npas2抑制化合物dwn1(利血平)的体外生物学测定的结果。图11a示出了，通过dwn1补充，msc体外矿化呈剂量依赖性增加。dwn1(1μm)达到了与bmp-2(100ng/ml)补充相似的水平的效果。图11b示出了骨钙素(ocn)的表达，其表达水平早在第21天就由dwn1增加。图11c示出了dwn1不影响bmal1的表达。图11d(a)-11d(b)示出了npas2 /-msc对dwn1有应答，但npas2-/-没有，表明dwn1的作用是由npas2抑制介导的。**：通过tukey分析，p《0.01至无处理对照
26.图12a-12h示出了dwn1在修饰的结扎诱导的小鼠牙周炎中的作用。图12a示出了将5.0丝线缝合线(silk suture)放置在上颌左侧第二磨牙(m2)处14天然后去除。图12b示出了，牙龈肿胀表明结扎诱导的牙周炎症。图12c示出了，牙龈组织的rt-pcr证实了炎性细胞因子的表达。图12d示出了显示进行性牙槽骨丢失的microct。图12e示出了，使用口腔矫治器将可变形纳米级囊泡(dnv)应用于腭牙龈。经口腔黏膜施用通过牙槽骨上的荧光双膦酸盐来证明。图12f示出了在去除缝合线后将dwn1/dnv应用于腭牙龈。媒介物对照示出了异常的上皮增厚(白色箭头)。图12g示出了microct，其证明了在dwn1处理的腭侧中增加的骨高度，但在未处理的颊侧中骨高度没有增加。图12h示出了h&e(上排)和天狼猩红(下排)染色的组织切片，其证明了牙槽骨再生(上排)和用sharpey纤维(sf)进行的牙龈/pdl结缔组织重建(下排)。*:p《0.05；**:p《0.01
27.图13a-13c示出了，使用无偏倚的化学遗传学分析来确定植入物骨整合的分子机制。图13a示出了使用携带npas2-lacz报告系统的bmsc的化学遗传学分析的流程图。图13b示出了lopac1280化合物对小鼠bmsc的npas2-lacz表达的高通量筛选。命中化合物被鉴定为z评分》2.5或《-2.5。图13c示出了在三次实验中命中化合物的npas2-lacz表达的验证。与未处理的对照(白色条)相比，化合物(黑色条)显著调节了npas2-lacz的表达(p《0.05)。
28.图14a-14d示出了npas2 ko小鼠通过骨再生对骨损伤作出反应。图14a示出了，在b6背景下c57bl6j野生型(wt)和npas2-/-小鼠的临界大小的颅盖骨缺损用携带325ng的bmp2的胶原海绵处理，并通过体内microct监测4周。图14示出了npas2-/-小鼠的再生的骨体积明显大于wt小鼠。图14c示出了在npas2 ko小鼠中拔牙诱导的牙槽骨再生。wt小鼠用上颌左侧第一磨牙拔除处理，其经历口腔黏膜和牙槽骨两者的伤口愈合(箭头)。npas2 ko小鼠在拔牙窝中表现出快速的伤口闭合和稳健的骨再生。图14d示出了3个根窝中的每一个的microct数据分析(bv/tv)，其描绘了第2周npas2 ko小鼠中的快速骨填充。图14b学生t检验，**：p《0.01图14d turkey的多重比较检验，*：p《0.05；**：p《0.01
29.图15a-15g示出了结扎诱导的小鼠牙周炎和在结扎线去除后的npas2-/-小鼠的牙槽骨再生。图15a示出了在14天(d)内围绕上颌第2磨牙(m2)发展的牙龈炎症(虚线)的结扎线放置。图15b示出了在腭牙龈的结扎线放置侧中增加的促炎细胞因子组织如il-17a的表达。图15c示出了通过microct监测的牙槽骨丢失逐渐增加。图15d示出了npas2的牙龈表达逐渐增加。图15e示出了在第14天，去除结扎线，模拟刮治和根部平整(srp)。在第28天，牙龈炎症消退。在wt小鼠中，在m2周围观察到牙龈缺陷(白色箭头)，这在npas2-/-小鼠中不太明
显。图15f示出了在第14天缝合线去除之前，wt和npas2-/-小鼠显示出由牙周炎诱导的等效牙槽骨丢失。图15g示出了，当wt小鼠的牙槽骨高度保持低时，npas2-/-小鼠表现出增加的骨高度，表明骨再生。*:p《0.05；***:p《0.001
30.图16a-16d示出了在hts、再生的牙槽骨中鉴定的npas2抑制化合物(dwn1)。图16a示出了，在第14天(图15e)去除结扎线，并将dwn1局部应用于腭牙龈。在第28天时，在对照小鼠(续)中看到的牙龈缺损在dwn1处理的小鼠中不太明显。图16b示出了在其中应用dwn1的腭侧处牙槽骨丢失减弱。图16c示出了，dwn1应用的腭侧显示了在釉牙骨质界的归一化牙龈(白色箭头)和在再吸收的牙槽骨(黑色箭头)上的新骨(红色箭头)。图16d示出了，dwn1处理示出归一化的天狼猩红染色的牙龈胶原排列，其中在牙齿与牙槽骨(b)的上皮(ep)附着下有sharpey纤维(sf)。*：p《0.05
31.图17示出了将hts数据应用于化学基因组学分析。药物靶点在单胺相关受体、转运蛋白和信号转导通路的化学空间内大部分重叠。
32.图18示出了msc表达的神经元单胺转运蛋白：囊泡单胺转运蛋白(vmat)；质膜单胺转运蛋白(pmat)、神经元外单胺转运蛋白(emt)、多巴胺转运蛋白(dat)、血清素转运蛋白(sert)和去甲肾上腺素转运蛋白(net)。
33.图19示出了，在bmp2补充的相似水平(100ng/ml)下，dwn1(泛单胺转运蛋白抑制剂)剂量依赖性地增加体外矿化。**：与对照(白色条)相比，p《0.01。
34.图20a-20c示出了npas2 ko小鼠的msc行为。图20a示出了，msc被暴露于成骨、软骨形成和脂肪形成分化培养基。npas2-/-msc表现出比wt msc增加的多能分化能力。图20b示出了自我更新活性在npas2-/-msc中增加。图20c示出了，干性标记物nanog和klf4的表达在npas2-/-msc中保持很高。
35.图21示出了增生性疤痕形成，其特征是过量的胶原的沉积(中)和凸起的疤痕(左)；致密的胶原纤维被masson三色染色强烈地染成蓝色。
36.图22示出了昼夜节律与伤口愈合之间的关系，改编自hoyle等人.《科学转化医学(sci transl med.)》,2017,其全文通过引用以其整体并入本文，他表明在夜间发生的人体烧伤伤口比白天发生的烧伤伤口需要更多的时间来愈合。伤口愈合需要成纤维细胞(fb)迁移。为了测试成纤维细胞迁移，hyde等人使用体外划痕模型，这是体外伤口愈合的常用方法。皮肤fb在板上培养，并且它们在晚上或白天时间擦伤板。如所示出的，在白天时间擦伤的fb比在夜间时间擦伤的fb迁移得更快。这表明更快的迁移意味着更好的愈合。
37.图23示出了npas2(一种时钟分子)在用植入物的伤口愈合中具有重要作用。通过手术将小型钛植入物放置在大鼠股骨上。在4周后，进行植入物周围组织的全基因组微阵列。npas2被发现是用植入物的伤口愈合作用中最重要的时钟分子。产生npas2敲除突变小鼠，并以与以前相同的方式进行植入手术(如mengatto等人，《公共科学图书馆
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综合(plosone)》，2011；morinaga等人，《生物材料(biomaterials)》，2019所述，其每一个都通过引用以其整体并入本文)。在野生型组中，植入物周围致密的胶原组织有益于骨整合。令人惊讶的是，npas2敲除小鼠没有形成致密的胶原纤维组织。发现，致密的胶原纤维是增生性疤痕形成的常见结构。假设npas2的抑制减少了“纤维化”的形成。
38.图24表明，小鼠中的npas敲除(ko)改善伤口愈合并最小化皮肤穿孔伤口愈合的小鼠模型中的疤痕形成，该模型改编自sasaki h等人，《解剖记录(anat rec)》(霍博肯
(hoboken)).2019，其通过引用以其整体并入本文。
39.图25示出了体外npas2抑制对皮肤成纤维细胞的影响。进行了被称为体外伤口愈合模型的划痕伤口愈合和胶原凝胶收缩测定。npas2敲除成纤维细胞示出了高细胞迁移和收缩能力。这些结果表明npas2 ko皮肤成纤维细胞改善了体外模型的伤口愈合。
40.图26示出了找到npas2抑制化合物的平台。首先，创建了具有报告基因的小鼠皮肤成纤维细胞，并且使用超过一千种fda批准的化合物开始高通量筛选(hts)。在筛选后，鉴定了10种下调npas2的命中化合物。一种命中化合物因其毒性而下调npas2。细胞活力测定与hts相结合，并且成功消除假阳性，并获得前5名命中化合物。
41.图27示出了dwn1在体外加速成纤维细胞迁移和凝胶收缩。使用先前描述的方法来测试dwn1的体外伤口愈合能力。
42.图28示出了dwn1改善了裂开伤口的愈合，并且疤痕形成最小。为了使用dwn1测试体内伤口愈合，创建了1.5x 10毫米的皮肤裂开模型，中间有缝合线，并设计了三组。该模型类似于皮肤伤口的临床情况。当仅缝合皮肤时，可见的伤口愈合是无效的。缝合线和用10％dmso的媒介物对照，在临床观察中，伤口愈合明显优于仅缝合线。假设媒介物的水分可以促进伤口愈合。在第三组中，与其他两个描述的组相比，10％dmso中的dwn1示出了最好的伤口愈合。
43.图29示出了dwn1改善了裂开伤口的愈合，并且疤痕形成最小。masson三色染色用于将胶原沉积物染成蓝色。不仅在肉芽组织中，而且还在外周伤口中发现了厚厚的蓝色胶原沉积。使用10％dmso的媒介物对照的组织学染色与对照相似。观察到厚厚的胶原沉积。相比之下，在10％dmso中的dwn1示出了非常小的胶原沉积区域。这些结果表明，dwn1改善了裂开伤口的愈合，并且疤痕形成最小。
44.图30示出了，细胞内的昼夜节律由各种时钟基因的转录-翻译反馈环路调节，所述各种时钟基因包含bmal1、clock和npas2(它们是基本的螺旋-环-螺旋)以及per或cry基因(它们是抑制基因)。(改编自《科学报告(sci rep)》8:11996,2018和morinaga等人，《生物材料》,2019，每篇文献均通过引用以其整体并入本文)。迄今为止，这些核心昼夜节律基因已经作为治疗靶点进行了研究。然而，bmal1或clock缺陷小鼠示出了异常表型或一些关键现象。另一方面，尚未报道npas2缺陷小鼠有任何关键表型。因此，npas2是更安全的分子靶点。
45.图31示出了利血平(res)的作用机制。res阻断主要在神经元中表达的囊泡单胺转运蛋白(vmat)。(改编自《内分泌学:成人和儿科(endocrinology:adult and pediatric)》2016,science direct，其通过引用以其整体并入本文)。阻断神经元vmat抑制突触囊泡中单胺类神经递质如去甲肾上腺素、多巴胺、血清素和组胺的摄取。单胺类神经递质与昼夜节律时钟之间的关系，单胺氧化酶a(其维持单胺类的平衡)的转录受时钟基因bmal1和npas2和per2调控。per2突变小鼠示出了降低的单胺氧化酶a活性，如hampp g.等人，《当前生物学(current biology)》2008所述，其通过引用以其整体并入本文。这示出了昼夜节律时钟调节神经递质。
46.图32a-32b示出了利血平(res)的假设机制，并且血清素可以上调成纤维细胞功能。(改编自wang c等人《公共科学图书馆
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综合》2013，其通过引用以其整体并入本文)。尽管尚未阐明利血平在皮肤中的作用机制，但假设，利血平抑制类似于vmat的神经元外单胺转运蛋白(emt)。当res阻断emt时，单胺如血清素会在细胞外环境中积累。sadiq等人在《国
际分子科学杂志(int j mol sci)》2018(其通过引用以其整体并入本文)的先前研究中已经表明，增加的血清素可以上调成纤维细胞功能。因此，理论上，通过利血平阻断emt加速成纤维细胞(fb)功能和伤口愈合。
47.图33a-33f示出了鼠背部皮肤的线性伤口/疤痕模型。图33a是在研究中使用的动物模型的示意图。左右两侧的垂直伤口(10x 1.5mm)是用双刃手术刀制作的。用5-0尼龙缝合线在伤口的中心进行一次结扎。图33b示出了使用伤口/疤痕的大体图像在术后直到术后第7天每天评分的视觉模拟量表(vas)。图33c示出了用尺子对伤口/疤痕的术后大体图像。尺子的单位是mm。图33d示出了术后第7天伤口/疤痕的中心(左)和侧面(右)的组织学图像。上面两个用苏木精-伊红(he)染色。下面两个用masson的三色(mt)染色。黄色虚线表示肉芽组织。比例尺为1000μm。图33e示出了使用he染色的切片评估的疤痕指数。图33f示出了使用mt染色的切片评估的纤维组织的面积％。*示出了p《0.05。
48.图34a-34c示出了候选化合物dwn1在体外对真皮成纤维细胞的npas2-抑制的选择和评价。图34a示出了在ucla的mssr中使用fda批准的化合物库的体外高通量药物筛选测定的散点图。阴性npas2 z评分的高绝对值表明npas2表达被高度下调(x轴)。高细胞活力z评分表明成纤维细胞具有高活力(y轴)。候选化合物(dwn1)是按照npas2 z评分的阴性产物的高绝对值和最高生存力的顺序选择的。图34b示出了，与对照相比，用dwn1(1μm或10μm)处理的真皮成纤维细胞中昼夜节律npas2表达的评价。图34c示出了用dwn1处理的鼠真皮成纤维细胞的细胞迁移的评估。*示出了p《0.05。
49.图35a-35b示出了胶原合成的dwn1对体外鼠真皮成纤维细胞的影响。图35a示出了在dwn1处理后第7天鼠真皮成纤维细胞上的天狼猩红染色。aa：l-抗坏血酸。od：光密度。ctrl：用不含aa的对照培养基处理的细胞。图35b示出了在dwn1处理后第3天和第7天1a1、1a2、3a1和14a1型胶原(col)的基因表达。*示出了p《0.05。
50.图36a-36e示出了dwn1对鼠背侧线性伤口/疤痕模型的影响。图36a示出了手术后第0天(d0)、第2天(d2)、第5天(d5)、第7天(d7)以及开始将dwn1局部施加到伤口后的大体图像。veh：媒介物。术后每24小时使用媒介物或dwn1 媒介物。图36b示出了施加有媒介物或媒介物 dwn1的伤口视觉模拟评分量表。图36c示出了术后第7天施加有媒介物或媒介物 dwn1的侧向伤口/疤痕的组织学图像。黄色虚线表示肉芽组织。左侧两个用he染色，并且右侧两个用mt染色。比例尺为1000μm。图36d示出了使用he染色的切片评估疤痕指数。图36e示出了使用mt染色的切片评估纤维组织的面积％。*示出了p《0.05。
51.图37a-37c示出了dwn1对鼠背侧线性伤口/疤痕模型的分子生物学效应。图37a示出了典型的激光捕获后显微解剖(lcm)图像。载玻片在lcm之前用苏木精和伊红短暂染色。g：肉芽组织，w：受伤的组织。图37b示出了col1a1、col1a2、col3a1)、col14a1、tgfβ1和acta2在肉芽组织(g)和受伤的组织(w)上的基因表达。gapdh用作内部对照。*示出了p《0.05。图37c示出了在术后第7天施加有媒介物或媒介物 dwn1的伤口的体内αsma的免疫组织化学染色。黄色虚线表示肉芽组织。比例尺是100μm。
具体实施方式
52.在以下详细说明中，陈述了许多具体细节以便提供对本发明的透彻理解。然而，本领域的技术人员将理解的是，可以在不存在这些具体细节的情况下实践本发明。在其他情
况下，并未详细描述众所周知的方法、程序和组分，以免模糊本发明。
53.牙槽骨丢失是人类和伴侣动物的牙周炎进展的标志。在健康人类受试者中，牙槽骨嵴的高度位于釉牙骨质界(cej)下方约2mm处。在牙周炎的病理发展期间牙槽骨嵴经受骨吸收。中度和重度牙周炎病症分别被定义为25％-50％的放射照相牙槽骨丢失和≥50％的牙根长度，即牙根尖到cej。由于牙槽骨丢失(其不会通过常规治疗再生)，拔牙通常是可能的临床选项。
54.可预测地使丢失的牙槽骨再生的治疗选项仍然是主要的临床需求。已经研究了成骨细胞增殖和分化的治疗性刺激以用于骨再生和重组生长因子的临床应用。生长因子疗法的生物学原理在于胚胎和发育过程。例如，骨形态发生蛋白(bmp)信号传导通路分子的小鼠敲除突变导致明显的骨骼缺陷，包含自发性骨折和受损的骨折修复。因为成人组织再生至少部分地经历反复的胚胎和发育过程，所以生长因子的应用被认为诱导牙周缺陷中骨再生以及诱导拔牙窝中骨形成(也被称为牙槽窝保存)所必需的信号传导通路。
55.目前的骨再生疗法利用肽生物制剂和生长因子，即(含有釉原蛋白(amelogenin)的猪牙釉质基质衍生产品)；(重组人bmp-2)；(重组人血小板衍生生长因子-bb)；成纤维细胞生长因子-碱性154(重组人成纤维细胞生长因子-2)；(特立帕肽(teriparatide)，重组人n-末端甲状旁腺激素)；rhgdf-5(重组人生长分化因子-5，bmp-14，i/ii期完成)。
56.在过去的几十年中，重组肽疗法在医疗/牙科实践中发挥了重要作用，并且超过60种肽药物在美国和其他主要市场获得批准。fda已经发布了重组肽产品的安全监测的具体指南，其必须包含对与过敏反应相关的不良事件的严格监测。如果针对共享内源性蛋白的序列的重组人肽产生抗体，则它们可能会导致严重的自身免疫反应。意想不到的安全问题是重组肽疗法面临的重大挑战。在2008年，由于过度炎症的风险，fda对bmp-2发出了黑匣子警告。额外的安全监测可能会增加药物开发的时间和成本。目前用于牙科再生疗法的重组肽产品的高成本以及潜在的副作用已成为向我们的患者提供牙科护理递送的重要阻碍因素。
57.昼夜节律(也被称为昼夜节律时钟)，被称为哺乳动物细胞中24小时节律的内源性自我维持和细胞自主振荡，负责广泛的生理稳态功能，并且这种节律的破坏参与慢性疾病，如心血管疾病、糖尿病、代谢和睡眠障碍、不孕症和受损的伤口愈合。先前的一项研究报告表明，人类烧伤损伤的数据库显示，在夜间(休息期)期间受伤的伤口比在白天(活动期)期间受伤的伤口愈合得更慢。这些结果表明昼夜节律在伤口愈合中的调节作用，尽管昼夜节律如何促进皮肤伤口愈合的机制仍不清楚。
58.据报道，昼夜节律时钟调节成年动物的生理组织再生。核心昼夜节律时钟(节律)由下丘脑中的视交叉上核(scn)在中央大脑中严格维持，该视交叉上核是昼夜节律起搏器。时钟分子：clock、npas2和bmal1转录因子诱导per和cry基因的表达，其蛋白质产物反过来又抑制clock、npas2和bmal1的转录活性。除了核心昼夜节律时钟(scn中的前馈/反馈系统)外，如骨、肝、皮肤和心脏的外周组织也维持着它们自己的昼夜节律时钟(例如，时钟分子的表达)。小鼠颅骨骨器官培养显示了昼夜节律周期中的骨矿物质沉积。对小鼠颅盖的微阵列分析揭示了在骨骼中存在外周昼夜节律，并且所有基因的接近30％的每日表达遵循24小时周期，被称为时钟控制基因(ccg)。外周昼夜节律时钟显示在皮肤伤口和骨折愈合中起调节
作用。
59.作为昼夜节律核心调节因子之一，神经元pas结构域蛋白2(npas2)是基本螺旋-环-螺旋(bhlh)-pas转录因子家族的成员，并且是昼夜节律运动输出周期kaput(clock)的旁系同源物。npas2或clock与大脑和肌肉arnt样蛋白-1(bmal1)二聚化，以调节另外两个昼夜节律基因簇周期(per)和隐花色素(cry)的基因转录。per和cry然后通过转录/翻译反馈回路系统抑制naps2、clock和bmal1的表达。先前的研究已经揭示，npas2表达发生在哺乳动物前脑和中央脑中，但不发生在scn中。然而，在外周组织(包含心脏、肝脏、脉管系统和皮肤)中报告了npas2的独特表达。
60.据报道，小鼠皮肤成纤维细胞表达npas2，这可能弥补了时钟表达的缺乏。通过微阵列分析，在衰老人类皮肤中显著上调的基因中鉴定出npas2。总之，发明人已经假设皮肤成纤维细胞中的npas2在稳态维持中起关键作用，因此npas2是皮肤伤口愈合期间的关键因素。如实例中所述，本研究的目的是使用npas2敲除小鼠来解决这一假设。
61.最近，肝脏中npas2的异位上调与纤维化形成有关。npas2是clock的直向同源分子，并且在没有clock的情况下，npas2替代了成纤维细胞的外周时钟功能。因此，在clock敲除小鼠的外周组织中的纤维化的形成可能是由取代npas2的病理机制促成的。最近已经报道，npas2敲除(ko)小鼠表现出快得多的皮肤伤口愈合，并且纤维化程度最低。
62.除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语都具有与本发明所属的领域中的普通技术人员通常所理解的相同的含义。进一步地，除非上下文另外需要，否则单数术语应包含复数，并且复数术语应包含单数。
63.本发明涉及靶向昼夜节律时钟分子的小分子化合物用于牙槽骨的再生疗法中的应用。昼夜节律同步调节许多分子、生理和生物过程。在神经精神疾病以及代谢疾病和癌症中报告了昼夜节律的失调。越来越多的报道表明昼夜节律时钟分子可以为治疗靶点；例如，用于恶性胸膜间皮瘤和阿尔茨海默病的bmal1。小分子调节昼夜节律系统的治疗潜力已经被认为是一种新的“时间疗法”方法。本发明还涉及基于小分子的时间疗法，用于对需要其的患者进行有效、安全和负担得起的牙齿组织再生，包含但不限于牙槽骨再生。
64.时间疗法的主要挑战之一是选择目标时钟分子。因为大多数(如果不是全部)细胞都具有昼夜节律时钟机制，因此治疗调节可能会导致广泛的副作用。例如，bmal1或clock的ko突变在外周骨组织中产生各种病理表型和过早衰老症状(肌肉减少症、白内障、器官萎缩)。相比之下，npas2 ko突变不会导致颌骨、椎骨和附肢骨的胚胎和发育病理学。scn中npas2的表达水平较低，并且对中枢昼夜节律具有很小的贡献。而是，增加的npas2表达出现在疾病状态下的外周组织中。当分别在体内和体外暴露于钛(ti)生物材料时，骨组织和msc中npas2的表达显著增加，如分别在mengatto cm等人，《公共科学图书馆
·
综合》2011；6(1):e15848和hassan n等人，《公共科学图书馆
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综合》2017；12(8):e0183359中所述，其每一个通过引用以其整体并入本文。外周组织中npas2的表达可能是通过由环境线索(包含创伤)刺激的“特设”碱基诱导的。加权基因共表达分析表明npas2不与其他昼夜节律时钟基因共调节，如hassan n等人，《公共科学图书馆
·
综合》2017；12(8):e0183359所述，其通过引用以其整体并入本文。npas2 ko msc维持其他核心时钟基因的正常表达，如morinaga k等人，《生物材料》2018；192:62-74所述，其通过引用以其整体并入本文。
65.本文提供了使用抑制时钟基因神经元pas结构域蛋白2(npas2)(也被称为npas2表
达抑制剂，npas2抑制剂)的表达的药剂用于伤口愈合，特别是用于改善和/或加速伤口的修复和治愈、用于在骨丢失部位再生牙槽骨、用于在伤口部位再生结缔组织和用于在开放性伤口部位减小伤口面积大小的治疗方法，所述方法包括向受试者的开放性伤口部位和/或骨丢失部位施用npas2表达抑制剂。所施用的抑制npas2的表达的治疗剂可以是化合物、合成的设计成用于靶向npas2基因的mrna的小干扰核糖核酸(sirna)或其组合。
66.本技术的发明人已经发现，npas2表达抑制剂再生已经经历伤口或慢性炎症的结缔组织，再生真皮(皮肤)伤口和牙周组织伤口，并促进骨丢失部位的牙槽骨再生。
67.在一个方面中，本发明提供了一种用于改善或加速受试者的伤口愈合的方法，所述方法包括向需要其的受试者的伤口施用抑制时钟基因的表达的药剂，其中时钟基因是神经元pas结构域蛋白2(npas2)。
68.在一个实施例中，施用是通过选自局部施用、经皮施用和/或皮下施用的途径。在另一个实施例中，伤口是真皮伤口。在一些实施例中，真皮伤口是牙周伤口。在某些实施例中，牙周伤口包括牙龈结缔组织退化或牙槽骨再吸收。在特定实施例中，抑制npas2的表达的药剂在细胞迁移测定中加速人皮肤成纤维细胞迁移。
69.在一些实施例中，作为npas2表达抑制剂的药剂选自去甲肾上腺素、多巴胺和血清素摄取抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、多巴胺拮抗剂或中枢神经系统(cns)兴奋剂。
70.在特定实施例中，抑制npas2的表达的药剂是肾上腺素能摄取抑制剂，其抑制单胺类神经递质去甲肾上腺(去甲肾上腺素)，多巴胺和血清素摄取到突触前储存囊泡中。在一个实施例中，去甲肾上腺素，多巴胺血清素摄取抑制剂是利血平(一种消耗儿茶酚胺的交感神经药物)，其具有以下化学结构：
[0071][0072]
利血平衍生自印度萝芙木(rauwolfia serpentine)和其他萝芙木属(rauwolfia)物种，并且可以通过合成来合成，如woodward r.b.等人，《美国化学学会杂志(j.am.chem.soc.)》.1956 78,2023；和《四面体(tetrahedron)》1958,2,1首先描述的，或通过替代合成来合成，例如如最近由storck,g.等人，《美国化学学会杂志》2005,127,16255-16262描述的，其通过引用以其整体并入。利血平不可逆地阻断h 耦合的囊泡单胺转运蛋白vmat1和vmat2。利血平对在神经元中表达的vmat2的阻断抑制了单胺神经递质去甲肾上腺素、多巴胺、血清素和组胺在神经元的突触前囊泡中的摄取并且减少了它们在神经元的突触前囊泡中的储存。利血平已经被用作抗高血压药、抗精神病药和镇静剂。
[0073]
在另外的实施例中，抑制npas2的表达的药剂是下列利血平衍生物和类似物之一：利血胺、苯甲酰基利血平、3-甲氧基苯甲酰基利血平、4-甲氧基苯甲酰基利血平、3,4-二甲氧基苯甲酰基利血平、3,5-二甲氧基苯甲酰基利血平、亚甲二氧基利血平、肉桂酰基利血
平、地舍平、利血平酸甲酯、昔洛舍平和吴茱萸碱。
[0074]
利血胺也获自印度萝芙木和其他萝芙木属物种，并且被用作抗高血压药物。利血胺的药理性能与利血平的药理性能相似，包含镇静和降血压作用。在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是利血胺，其具有以下化学结构：
[0075][0076]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是苯甲酰利血平具有以下化学结构：
[0077][0078]
在进一步的实施例中，抑制npas2表达的药剂是3-甲氧基苯甲酰基利血平，其具有以下化学结构：
[0079][0080]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是4-甲氧基苯甲酰基利血平，其具有以下化学结构：
[0081][0082]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是3,4-二甲氧基苯甲酰基利血平，其具有以下化学结构：
[0083][0084]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是3,5-二甲氧基苯甲酰基利血平，其具有以下化学结构：
[0085][0086]
在又一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是亚甲二氧基利血平，其具有以下化学结构：
[0087][0088]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是肉桂酰基利血平，其具有以下化学结
构：
[0089][0090]
地舍平，也是一种交感神经药物，即它抑制交感神经系统，并且具有抗高血压、镇静和抗精神病的性能；地舍平(其来源于萝芙木香菜(rauwolfia canescens l.)和夹竹桃科(apocyanaceae))也可以由利血平合成。在某些实施例中，抑制npas2的表达的药剂是地舍平，其具有以下化学结构：
[0091][0092]
在一些实施例中，抑制npas2的表达的药剂是利血平酸甲酯，其具有以下化学结构：
[0093][0094]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是昔洛舍平，其具有以下化学结构：
[0095][0096]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是吴茱萸碱，其具有以下化学结构：
[0097][0098]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是丁苯那嗪(tetrabenazine)，这是一种类似于利血平的药剂。丁苯那嗪可逆地抑制vmat2，其将多巴胺、血清素、去甲肾上腺素和组胺转运到突触囊泡中，导致单胺的摄取减少，以及单胺储存的耗尽；丁苯那嗪通过可逆地抑制单胺摄取到突触前神经元的囊泡中，可逆地消耗单胺，特别是多巴胺。丁苯那嗪曾被用作抗精神病药，并且现在用于各种多动障碍、与亨廷顿氏病相关的舞蹈病和运动障碍(如迟发性运动障碍，一种抗精神病药物的副作用)的对症治疗。丁苯那嗪具有以下化学结构：
[0099][0100]
在一些实施例中，抑制npas2的表达的药剂是丁苯那嗪对映异构体或二氢丁苯那嗪的八种立体异构体之一，它们也是vmat2抑制剂，其制备在yao,z.等人《欧洲药物化学杂志(eur j med chem.)》2011年5月；46(5):1841-8(其通过引用以其整体并入本文)中描述。
[0101]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是氘代丁苯那嗪，其是丁苯那嗪的同位素异构体，其中六个氢原子已经被氘原子替换。氘代丁苯那嗪具有以下化学结构：
[0102][0103]
氘代丁苯那嗪还抑制囊泡单胺转运蛋白2(vmat2)，并且用于治疗与亨廷顿氏病相关的舞蹈病和迟发性运动障碍。
[0104]
在另外的实施例中，作为抑制npas2的表达的药剂的氧化磷酸化抑制剂是氯丙嗪。氯丙嗪解除氧化磷酸化，但不会降低去甲肾上腺素和血清素水平。在结构上与利血平无关，氯丙嗪具有以下化学结构：
[0105][0106]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是氯丙嗪类似物溴丙嗪(溴丙嗪盐酸盐)，其具有以下化学结构：
[0107][0108]
与氯丙嗪相似的含1,4-噻嗪的药物，包含异丙嗪、三甲泼拉嗪(trimeprazine)、丙氯拉嗪、三氟拉嗪、左美丙嗪和硫丙拉嗪，具有以下各自的化学结构(1)-(6)：
[0109]
[0110][0111]
在一些实施例中，抑制npas2的表达的药剂是抗霉素a、尼氟酸、盐酸吗茚酮和盐酸美非沙胺(mefexamide hydrochloride)。
[0112]
在某些实施例中，npas2表达抑制剂是抗霉素a，其具有以下化学结构：
[0113][0114]
抗霉素a是由链霉菌属(streptomyces)细菌产生的。抗霉素a是一种氧化磷酸化的抑制剂，并且还通过抑制细胞色素c破坏电子传递链，从而导致atp生产停止。抗霉素a在渔业和水产养殖中被用作杀鱼剂(一种鱼中毒剂)，以通过杀死小型和更敏感的鱼类物种来提高鲶鱼产量。抗霉素a(也被称为抗霉素a1)用作抗真菌剂、杀虫剂和杀螨剂。
[0115]
在一个实施例中，npas2表达抑制剂是抗霉素a2，其具有以下化学结构：
[0116][0117]
在一些实施例中，抑制npas2的表达的药剂是抗霉素a的衍生物或类似物，如在us2005/0239873中所述(特别是2-甲氧基抗霉素a衍生物)；batra,pp等人，《生物化学杂志(j.biological chemistry)》，第246卷，第23期，12月10日发行，第7125-7130页，1971(特别是，抗霉素a二乙酸盐和三乙酸盐)，chevalier a等人，《有机快报(org.lett.)》2016,18,2395-2398(特别是酰化的抗霉素a衍生物)；abidi,s.l.,《色谱杂志(j.chromatogr.)》464(1989)453-458(特别是，抗霉素a的同系物或抗霉素a的甲基或丹磺酰基衍生物)和abidi,sl,《色谱杂志》447(1988)65-79(特别是，抗霉素a的亚组分，即a1a、a1b、a2a、a2b、a3a、a3b、a4a和a4b，以及抗霉素a1a、a1b、a2a、a2b、a3a、a3b、a4a和/或a4b的丹磺酰化或甲基化衍生物)，其每一个都通过引用以其整体并入本文。
[0118]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是抗霉素a3(也被称为抗稻瘟霉素(blastmycin)和芽生菌素(blastomycin))，其具有以下化学结构：
[0119][0120]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是抗霉素a4，其具有以下化学结构：
[0121][0122]
在一个实施例中，尼氟酸是npas2表达抑制剂；尼氟酸(其是一种环氧合酶-2抑制剂)具有以下化学结构：
[0123][0124]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是他尼氟酯(一种尼氟酸的前药)，其具有以下化学结构：
[0125][0126]
在一个实施例中，作为npas2表达抑制剂的药剂是盐酸吗茚酮，一种抗精神病药；盐酸吗茚酮是一种多巴胺d2/d5受体拮抗剂，并且具有以下化学结构：
[0127][0128]
在另一个实施例中，作为npas2表达抑制剂的药剂是匹喹酮(piquindone)(盐酸匹喹酮)，一种盐酸吗茚酮的刚性类似物，它是一种非典型抗精神病药物，其是可选择的d2受体拮抗剂并且具有以下化学结构：
[0129][0130]
在另一个实施例中，npas2表达抑制剂是盐酸美非沙胺(美非沙胺(mefexamide))，一种具有中枢神经系统刺激作用的心理治疗剂，其具有以下化学结构：
[0131][0132]
在多个实施例中，抑制npas2的表达的药剂选自硝酸益康唑、醋氯芬酸(aceclofenac)、普伐他汀、泰洛沙泊、单硝酸异山梨酯、ms-1500387、(s)-(-)-阿替洛尔、盐酸布替萘芬、盐酸醋克利定(aceclidine hydrochloride)、硫酸阿托品一水合物、三甲双酮、氯苯氨酸甘油酯(chlorphensin carbamate)、盐酸磺胺米隆(mafenide hydrochloride)、尼芬那宗(nifenazone)、盐酸阿替卡因、可可碱、硝呋齐特(nifuroxazide)、sam001246626、羟丙哌嗪(r,s)、柠檬酸二乙碳酰嗪(diethylcarbamazine citrate)、ms-1501214、甲磺酸多拉司琼、雌酮、泼尼松龙、盐酸柔红霉素、放线菌酮和莫能菌素钠盐。
[0133]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是醋氯芬酸，其是非甾体抗炎药(nsaid)药物，即双氯芬酸的类似物。醋氯芬酸具有抗炎和镇痛性能并且用于治疗类风湿性关节炎、骨关节炎、类风湿性关节炎和强直性脊柱炎。醋氯芬酸抑制环氧合酶(cox)。醋氯芬酸具有以下化学结构：
[0134][0135]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是普伐他汀，其是羟甲基戊二酰基coa(hmg-coa)还原酶抑制剂，并且用作降低血浆胆固醇和脂蛋白水平的抗胆甾醇剂。普伐他汀具有以下化学结构：
[0136][0137]
在一些实施例中，抑制npas2的表达的药剂是泰洛沙泊(tyloxapol)，其是烷基芳基聚醚醇型非离子液体聚合物。泰洛沙泊被用作用于液化和去除粘脓性分泌物的支气管肺研究中的非离子表面活性剂。泰洛沙泊还已经被证明会产生剂量依赖性的和时间依赖性的细胞毒性，从而诱导细胞凋亡。泰洛沙泊具有以下化学结构：
[0138][0139]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是单硝酸异山梨酯，其是异山梨醇的单硝酸盐形式，一种具有血管扩张活性的有机硝酸盐；单硝酸异山梨酯被用作冠状动脉血管扩张剂以治疗心绞痛和心力衰竭，并且也已经被用于治疗弥漫性食管痉挛。单硝酸异山梨酯具有以下化学结构：
[0140]
[0141]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是ms-1500387，也被称为巯基嘌呤、6-巯基嘌呤、6-mp和spectrum1500387，其是嘌呤抗代谢物，具体来说，一种硫嘌呤衍生物抗代谢物，其既是抗肿瘤剂，即用于治疗白血病(如急性淋巴细胞白血病和慢性淋巴细胞白血病)的抗癌剂，并且也是用于治疗自身免疫性疾病(如溃疡性结肠炎)的免疫抑制剂。巯基嘌呤具有以下化学结构：
[0142][0143]
在某些实施例中，抑制npas2的表达的药剂是(s)-(-)-阿替洛尔，阿替洛尔的(s)-对映异构体，也被称为艾沙替洛尔(esatenolol)和(s)-阿替洛尔。(s)-(-)-阿替洛尔β-肾上腺素能拮抗剂，并且被用作β阻滞剂药物以治疗高血压、心绞痛和提高心脏病发作后的生存率。(s)-(-)-阿替洛尔具有以下化学结构：
[0144][0145]
在另一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是盐酸布替萘芬，其是布替萘芬的盐酸盐形式，一种合成的苄胺；盐酸布替萘芬是一种抗真菌化合物。盐酸布替萘芬通过抑制角鲨烯环氧酶(一种真菌细胞膜所需甾醇形成所需的酶)干扰麦角甾醇(一种真菌细胞膜的重要组成部分)的生物合成。盐酸布替萘芬具有以下化学结构：
[0146][0147]
在另外的实施例中，抑制npas2的表达的药剂是盐酸醋克利定，也被称为其是非选择性毒蕈碱乙酰胆碱受体部分激动剂。盐酸醋克利定用于治疗窄角型青光眼。盐酸醋克利定具有以下化学结构：
[0148][0149]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是硫酸阿托品一水合物，其是阿托品的硫酸盐，一种从z植物颠茄(atropa belladona l.)、曼陀罗(datura stramonium l.)和茄科的其他植物中分离出来的天然存在的生物碱。阿托品作为毒蕈碱胆碱能受体的交感的、竞争性拮抗剂起作用。硫酸阿托品一水合物是一种胆碱能受体拮抗剂。硫酸阿托品一水合物也可以充当抗痉挛剂，但对中枢神经系统(cns)没有表现出任何可检测的影响。具有以下化学结构的硫酸阿托品一水合物：
[0150][0151]
在一些实施例中，抑制npas2的表达的药剂是三甲双酮，其是一种抗惊厥化合物，用于治疗使用了效果不佳的其他药物的患者的癫痫病症；三甲双酮具有以下化学结构：
[0152][0153]
在多个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是氯苯氨酸甘油酯，一种用于治疗肌肉痉挛的中枢作用骨骼肌松弛剂；氯苯氨酸甘油酯具有以下化学结构:
[0154][0155]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是盐酸磺胺米隆，其具有以下化学结构：
[0156]
[0157]
盐酸磺胺米隆是一种磺胺类药物，其抑制酶碳酸酐酶；盐酸磺胺米隆被用作局部抗生素，特别是在烧伤疗法中。
[0158]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是盐酸阿替卡因，其具有以下化学结构：
[0159][0160]
盐酸阿替卡因，阿替卡因的盐酸盐形式，是酰胺类局部麻醉剂，其用于小手术的疼痛的缓解，通常与肾上腺素(一种血管收缩剂)结合使用。
[0161]
在一个实施例中，npas2表达抑制剂是尼芬那宗，其具有以下化学结构：
[0162][0163]
尼芬那宗是一种非甾体抗炎药，其也具有镇痛、解热和血小板抑制的治疗作用。
[0164]
在另一个实施例中，npas2表达抑制剂是可可碱，其具有以下化学结构：
[0165][0166]
可可碱(3,7-二甲基黄嘌呤)是来自可可植物的嘌呤生物碱；可可碱是腺苷受体拮抗剂，并且被用作支气管扩张剂和血管扩张剂。可可碱也已经被用作利尿剂和心脏刺激剂。
[0167]
在另外的实施例中，npas2表达抑制剂是结构上和药理学上与可可碱相似的化合物。在一个实施例中，可可碱相关化合物是茶碱，其具有以下化学结构：
[0168][0169]
在另一个实施例中，可可碱相关化合物是咖啡因，其具有以下化学结构：
[0170][0171]
在一个实施例中，npas2表达抑制剂是硝呋齐特，一种抗生素，其被用作肠道抗菌剂以治疗人类腹泻和结肠炎；硝呋齐特具有以下化学结构：
[0172][0173]
在一些实施例中，npas2表达抑制剂是sam001246626，也被称为盐酸阿托莫西汀，其具有以下化学结构：
[0174][0175]
盐酸阿托莫西汀是一种去甲肾上腺素再摄取抑制剂，其抑制突触前去甲肾上腺素转运蛋白，引起突触间隙中去甲肾上腺素的突触前重吸收的抑制和13}去甲肾上腺素活性的延长；盐酸阿托莫西汀用于治疗注意缺陷多动障碍(adhd)。
[0176]
在一个实施例中，npas2表达抑制剂是羟丙哌嗪(r,s)，也被称为羟丙哌嗪(dropropizine)或羟丙哌嗪(dipropizine)，其是咳嗽抑制剂；羟丙哌嗪具有以下化学结构:
[0177][0178]
在另一个实施例中，npas2表达抑制剂是柠檬酸二乙碳酰嗪，一种用于治疗丝虫病的驱虫药物；柠檬酸二乙碳酰嗪具有以下化学结构：
[0179][0180]
在另外的实施例中，npas2表达抑制剂是ms-1501214，也被称为马来酸依那普利(enalapril maleate)，其是依那普利的马来酸盐形式。马来酸依那普利是一种血管紧张素
转换酶(ace)抑制剂，并且用于治疗高血压、充血性心力衰竭、糖尿病肾病，并且具有以下化学结构：
[0181][0182]
在一个实施例中，npas2表达抑制剂是甲磺酸多拉司琼(dolasetron mesilate)，也被称为甲磺酸多拉司琼(dolasetron mesilate)、多拉司琼(甲磺酸水合物)和多拉司琼。甲磺酸多拉司琼是一种具有止吐活性的选择性血清素5-ht3受体拮抗剂，并且用于治疗化疗后的恶心和呕吐。甲磺酸多拉司琼水合物具有以下化学结构：
[0183][0184]
在另一个实施例中，npas2表达抑制剂是雌酮(estrone)，也被称为雌酮(oestrone)，其是合成制备的或天然存在的甾体雌激素，特别是雌激素受体er-α和er-β的激动剂。雌酮具有以下化学结构：
[0185][0186]
在另外的实施例中，npas2表达抑制剂是泼尼松龙，其是具有抗炎和免疫调节特性
的合成糖皮质激素；泼尼松龙充当皮质类固醇激素受体激动剂。泼尼松龙具有以下化学结构：
[0187][0188]
在一个实施例中，npas2表达抑制剂是盐酸柔红霉素，也被称为柔红霉素(daunorubicin)和柔红霉素(daunomycin)，是具有抗肿瘤活性的蒽环类抗生素的盐酸盐，其用于治疗白血病、淋巴瘤和其他癌症。盐酸柔红霉素具有以下化学结构：
[0189][0190]
在一些实施例中，npas2表达抑制剂是放线菌酮(cycloheximide)，其是一种由灰色链霉菌产生的抗生素和抗生素杀真菌剂。放线菌酮具有以下化学结构：
[0191][0192]
在另一个实施例中，npas2表达抑制剂是莫能菌素钠盐，也被称为莫能菌素钠，是由肉桂地链霉菌(streptomyces cinnamonensis)产生的抗原虫剂。莫能菌素钠具有以下化学结构：
[0193][0194]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂是氧化磷酸化抑制剂。在一个特定实施例中，氧化磷酸化抑制剂是抗霉素a，其具有以下化学结构：
[0195][0196]
在另一个实施例中，药剂是选自由以下组成的群组的npas2下调化合物：细胞骨架/ecm抑制剂、激素激动剂、一氧化氮抑制剂、细胞内ca 释放剂、激酶/磷酸酶抑制剂和激酶抑制剂。在一个实施例中，细胞骨架/ecm抑制剂是布雷菲德菌素a、秋水仙碱、鬼臼毒素或5175348。在另一个实施例中，激素激动剂是ac-93253碘化物，一氧化氮抑制剂是氯化二亚苯基碘鎓，细胞内ca 释放剂是毒胡萝卜素(thapsigargin)，激酶/磷酸酶抑制剂是pd-166285水合物，并且激酶抑制剂是pd-173952。
[0197]
在一个特定实施例中，经皮施用是将包封药剂的可变形纳米级囊泡应用于伤口。在一个实施例中，经皮施用是将经皮递送系统应用于伤口，该经皮递送系统选自由以下组成的群组：涂覆有药剂的微针、其中并入有药剂的固体聚合物基质、包括储存药剂的储库和半透膜的经皮贴剂、包括溶解于其中的药剂的经皮凝胶、和包括溶解于其中的药剂的经皮喷雾剂以及包括溶解于其中的药剂的计量剂量经皮喷雾剂。
[0198]
在某些实施例中，药剂是合成的被设计成靶向npas2基因的mrna的小干扰核糖核酸(sirna)。在一些实施例中，sirna通过选自由以下组成的群组的途径施用：微针阵列、电穿孔、压力、机械按摩、阳离子脂质体、阳离子聚合物介导的递送系统、超声、缀合物递送系统，微气泡、脂质体气泡、超声敏感纳米气泡、碳纳米管、脂质基纳米载体、非脂质有机基纳米载体和无机纳米载体、金纳米颗粒和金纳米棒。在各种实施例中，sirna在核糖糖环、磷酸骨架、核碱基和核糖糖的2'位置被化学修饰，5'末端修饰或缀合。在一个实施例中，核糖糖环是鸟苷或尿苷并且2'位置修饰选自由2'-ome、2'-f、2'-o-甲氧基乙基(2'-moe)组成的群组。在另一个实施例中，磷酸骨架用二硫代磷酸酯、三唑二聚体、酰胺或硼烷磷酸酯修饰。在一些实施例中，核碱基和核糖糖修饰是5-氟-2
′‑
脱氧尿苷(fdu)、2
′‑
o-甲基二硫代磷酸酯(2
′
o-meps2)、亲脂性硼簇、3-n-[(1,12-二碳杂-闭式-十二硼烷-1-基)丙-3-基]胸苷(c2b10h11，cb)、胸苷和5-双(氨基乙基)-氨基乙基-2
′‑
脱氧尿苷。在一个特定实施例中，5'末端修饰或缀合是sirna的5'末端的棕榈酸(palmitic acid)缀合、与sirna的3'末端偶联的反向胸苷(idt)和在5'末端的棕榈酸(topalmitic acid)缀合、sirna与细胞可渗透肽
(cpp)的缀合、sirna与选自由苯基、羟基苯基、萘基和芘基衍生物组成的群组的芳族化合物的缀合；用脲/硫脲桥联的芳香化合物在3
′
突出区域的化学修饰；在有义链和反义链的3
′
端的聚乙二醇(peg)缀合；和sirna的胆固醇缀合。
[0199]
在另一个方面中，本发明提供了一种用于再生牙槽骨的方法，所述方法包括向需要其的受试者的骨丢失部位施用抑制npas2的表达的药剂。在一些实施例中，施用是通过选自局部施用、经皮施用和/或皮下施用的途径。在一个实施例中，伤口是真皮伤口。在另一个实施例中，真皮伤口是牙周伤口。在另外的实施例中，牙周伤口包括牙龈结缔组织退化或牙槽骨再吸收。
[0200]
在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂在细胞迁移测定中加速人皮肤成纤维细胞迁移。在一些实施例中，药剂选自去甲肾上腺素和血清素摄取抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、多巴胺拮抗剂或中枢神经系统(cns)兴奋剂。在各种实施例中，药剂是利血平。在一些实施例中，所述药剂是抗霉素a、尼氟酸、盐酸吗茚酮和盐酸美非沙胺。在某些实施例中，所述药剂选自硝酸益康唑、醋氯芬酸、普伐他汀、泰洛沙泊、单硝酸异山梨酯、ms-1500387、(s)-(-)-阿替洛尔、盐酸布替萘芬、盐酸醋克利定、硫酸阿托品一水合物、三甲双酮、氯苯氨酸甘油酯、盐酸磺胺米隆、尼芬那宗、盐酸阿替卡因、可可碱、硝呋齐特、sam001246626、羟丙哌嗪(r,s)、柠檬酸二乙碳酰嗪、ms-1501214、甲磺酸多拉司琼、雌酮、泼尼松龙、盐酸柔红霉素、放线菌酮和莫能菌素钠盐。在特定实施例中，药剂是选自由以下组成的群组的npas2下调化合物：细胞骨架/ecm抑制剂、激素激动剂、一氧化氮抑制剂、细胞内ca 释放剂、激酶/磷酸酶抑制剂和激酶抑制剂。在一个实施例中，细胞骨架/ecm抑制剂是布雷菲德菌素a、秋水仙碱、鬼臼毒素或5175348。在另一个实施例中，激素激动剂是ac-93253碘化物，一氧化氮抑制剂是氯化二亚苯基碘鎓，细胞内ca 释放剂是毒胡萝卜素，激酶/磷酸酶抑制剂是pd-166285水合物，并且激酶抑制剂是pd-173952。
[0201]
在特定实施例中，经皮施用是通过包封药剂的可变形纳米级囊泡。在某些实施例中，经皮施用是将经皮递送系统应用于伤口，该经皮递送系统选自由以下组成的群组：涂覆有药剂的微针、其中并入有药剂的固体聚合物基质、包括储存药剂的储库和半透膜的经皮贴剂、包括溶解于其中的药剂的经皮凝胶、和包括溶解于其中的药剂的经皮喷雾剂以及包括溶解于其中的药剂的计量剂量经皮喷雾剂。
[0202]
在各种实施例中，药剂是合成的被设计成靶向npas2基因的mrna的小干扰核糖核酸(sirna)。在一个实施例中，sirna通过选自由以下组成的群组的途径施用：微针阵列、电穿孔、压力、机械按摩、阳离子脂质体、阳离子聚合物介导的递送系统、超声、缀合物递送系统，微气泡、脂质体气泡、超声敏感纳米气泡、碳纳米管、脂质基纳米载体、非脂质有机基纳米载体和无机纳米载体、金纳米颗粒和金纳米棒。在另一个实施例中，sirna在核糖糖环、磷酸骨架、核碱基和核糖糖的2'位置被化学修饰，5'末端修饰或缀合。在一些实施例中，核糖糖环是鸟苷或尿苷并且2'位置修饰选自由2'-ome、2'-f、2'-o-甲氧基乙基(2'-moe)组成的群组。在一个实施例中，磷酸骨架用二硫代磷酸酯、三唑二聚体、酰胺或硼烷磷酸酯修饰。在另一个实施例中，核碱基和核糖糖修饰是5-氟-2
′‑
脱氧尿苷(fdu)、2
′‑
o-甲基二硫代磷酸酯(2
′
o-meps2)、亲脂性硼簇、3-n-[(1,12-二碳杂-闭式-十二硼烷-1-基)丙-3-基]胸苷(c2b10h11，cb)、胸苷和5-双(氨基乙基)-氨基乙基-2
′‑
脱氧尿苷。在一个实施例中，5'末端修饰或缀合是sirna的5'末端的棕榈酸缀合、与sirna的3'末端偶联的反向胸苷(idt)和在
5'末端的棕榈酸缀合、sirna与细胞可渗透肽(cpp)的缀合、sirna与选自由苯基、羟基苯基、萘基和芘基衍生物组成的群组的芳族化合物的缀合；用脲/硫脲桥联的芳香化合物在3
′
突出区域的化学修饰；在有义链和反义链的3
′
端的聚乙二醇(peg)缀合；和sirna的胆固醇缀合。
[0203]
在某些实施例中，经皮施用是通过包封药剂的可变形纳米级囊泡。在一些实施例中，经皮施用是将经皮递送系统应用于伤口，该经皮递送系统选自由以下组成的群组：涂覆有药剂的微针、其中并入有药剂的固体聚合物基质、包括储存药剂的储库和半透膜的经皮贴剂、包括溶解于其中的药剂的经皮凝胶、和包括溶解于其中的药剂的经皮喷雾剂以及包括溶解于其中的药剂的计量剂量经皮喷雾剂。
[0204]
在另外的方面中，本发明提供了一种用于在需要其的受试者的伤口部位处再生结缔组织的方法，所述方法包括向伤口施用治疗有效量的npas2表达抑制剂。在特定实施例中，施用是通过选自局部施用、经皮施用和/或皮下施用的途径。在一个实施例中，伤口是真皮伤口。在另一个实施例中，真皮伤口是牙周伤口。在某些实施例中，牙周伤口包括牙龈结缔组织退化或牙槽骨再吸收。在各种实施例中，抑制npas2的表达的药剂在细胞迁移测定中加速人皮肤成纤维细胞迁移。在某些实施例中，药剂选自去甲肾上腺素和血清素摄取抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、多巴胺拮抗剂或中枢神经系统(cns)兴奋剂。在特定实施例中，该药剂是利血平。在一些实施例中，所述药剂是抗霉素a、尼氟酸、盐酸吗茚酮和盐酸美非沙胺。在一个实施例中，所述药剂选自硝酸益康唑、醋氯芬酸、普伐他汀、泰洛沙泊、单硝酸异山梨酯、ms-1500387、(s)-(-)-阿替洛尔、盐酸布替萘芬、盐酸醋克利定、硫酸阿托品一水合物、三甲双酮、氯苯氨酸甘油酯、盐酸磺胺米隆、尼芬那宗、盐酸阿替卡因、可可碱、硝呋齐特、sam001246626、羟丙哌嗪(r,s)、柠檬酸二乙碳酰嗪、ms-1501214、甲磺酸多拉司琼、雌酮、泼尼松龙、盐酸柔红霉素、放线菌酮和莫能菌素钠盐。在另一个实施例中，药剂是选自由以下组成的群组的npas2下调化合物：细胞骨架/ecm抑制剂、激素激动剂、一氧化氮抑制剂、细胞内ca 释放剂、激酶/磷酸酶抑制剂和激酶抑制剂。在一个实施例中，细胞骨架/ecm抑制剂是布雷菲德菌素a、秋水仙碱、鬼臼毒素或5175348。在另一个实施例中，激素激动剂是ac-93253碘化物，一氧化氮抑制剂是氯化二亚苯基碘鎓，细胞内ca 释放剂是毒胡萝卜素，激酶/磷酸酶抑制剂是pd-166285水合物，并且激酶抑制剂是pd-173952。在一个特定实施例中，经皮施用是将包封药剂的可变形纳米级囊泡施用于伤口。在一个实施例中，经皮施用是将经皮递送系统应用于伤口，该经皮递送系统选自由以下组成的群组：涂覆有药剂的微针、其中并入有药剂的固体聚合物基质、包括储存药剂的储库和半透膜的经皮贴剂、包括溶解于其中的药剂的经皮凝胶、和包括溶解于其中的药剂的经皮喷雾剂以及包括溶解于其中的药剂的计量剂量经皮喷雾剂。
[0205]
在另一个实施例中，药剂是合成的被设计成靶向npas2基因的mrna的小干扰核糖核酸(sirna)。在进一步的实施例中，sirna通过选自由以下组成的群组的途径施用：微针阵列、电穿孔、压力、机械按摩、阳离子脂质体、阳离子聚合物介导的递送系统、超声、缀合物递送系统，微气泡、脂质体气泡、超声敏感纳米气泡、碳纳米管、脂质基纳米载体、非脂质有机基纳米载体和无机纳米载体、金纳米颗粒和金纳米棒。在一个实施例中，sirna在核糖糖环、磷酸骨架、核碱基和核糖糖的2'位置被化学修饰，5'末端修饰或缀合。在另一个实施例中，核糖糖环是鸟苷或尿苷并且2'位置修饰选自由2'-ome、2'-f、2'-o-甲氧基乙基(2'-moe)组
成的群组。在一个实施例中，磷酸骨架用二硫代磷酸酯、三唑二聚体、酰胺或硼烷磷酸酯修饰。在另一个实施例中，核碱基和核糖糖修饰是5-氟-2
′‑
脱氧尿苷(fdu)、2
′‑
o-甲基二硫代磷酸酯(2
′
o-meps2)、亲脂性硼簇、3-n-[(1,12-二碳杂-闭式-十二硼烷-1-基)丙-3-基]胸苷(c2b10h11，cb)、胸苷和5-双(氨基乙基)-氨基乙基-2
′‑
脱氧尿苷。在另一个实施例中，5'末端修饰或缀合是sirna的5'末端的棕榈酸缀合、与sirna的3'末端偶联的反向胸苷(idt)和在5'末端的棕榈酸缀合、sirna与细胞可渗透肽(cpp)的缀合、sirna与选自由苯基、羟基苯基、萘基和芘基衍生物组成的群组的芳族化合物的缀合；用脲/硫脲桥联的芳香化合物在3
′
突出区域的化学修饰；在有义链和反义链的3
′
端的聚乙二醇(peg)缀合；和sirna的胆固醇缀合。
[0206]
在特定实施例中，结缔组织是胶原、真皮样胶原纤维或骨中的一种或多种。在一个实施例中，伤口部位是骨丢失的部位。在另一个实施例中，骨丢失是牙周炎诱导的牙槽骨再吸收的部位。在另外的实施例中，伤口部位是牙龈结缔组织退化的部位。
[0207]
在另一个方面中，本发明提供了一种用于减小伤口面积大小的方法，所述方法包括向受试者的开放性伤口部位局部施用抑制npas2的表达的药剂。在某些实施例中，施用是通过选自局部施用、经皮施用和/或皮下施用的途径。在一个实施例中，伤口是真皮伤口。在另一个实施例中，真皮伤口是牙周伤口。在又一个实施例中，牙周伤口包括牙龈结缔组织退化或牙槽骨再吸收。在一个实施例中，抑制npas2的表达的药剂在细胞迁移测定中加速人皮肤成纤维细胞迁移。在特定实施例中，所述药剂选自去甲肾上腺素和血清素摄取抑制剂、氧化磷酸化抑制剂、环氧合酶-2抑制剂、多巴胺拮抗剂或中枢神经系统(cns)兴奋剂。在另一个具体实施例中，该药剂是利血平。在一个实施例中，药剂是抗霉素a、尼氟酸、盐酸吗茚酮和盐酸美非沙胺。在另一个实施例中，所述药剂选自硝酸益康唑、醋氯芬酸、普伐他汀、泰洛沙泊、单硝酸异山梨酯、ms-1500387、(s)-(-)-阿替洛尔、盐酸布替萘芬、盐酸醋克利定、硫酸阿托品一水合物、三甲双酮、氯苯氨酸甘油酯、盐酸磺胺米隆、尼芬那宗、盐酸阿替卡因、可可碱、硝呋齐特、sam001246626、羟丙哌嗪(r,s)、柠檬酸二乙碳酰嗪、ms-1501214、甲磺酸多拉司琼、雌酮、泼尼松龙、盐酸柔红霉素、放线菌酮和莫能菌素钠盐。在又一个实施例中，所述药剂是选自由以下组成的群组的npas2下调化合物：细胞骨架/ecm抑制剂、激素激动剂、一氧化氮抑制剂、细胞内ca 释放剂、激酶/磷酸酶抑制剂和激酶抑制剂。在另一个实施例中，细胞骨架/ecm抑制剂是布雷菲德菌素a、秋水仙碱、鬼臼毒素或5175348。在某些实施例中，激素激动剂是ac-93253碘化物，一氧化氮抑制剂是二苯碘铵氯化物，细胞内ca 释放剂是毒胡萝卜素，激酶/磷酸酶抑制剂是pd-166285水合物，并且激酶抑制剂是pd-173952。在各种实施例中，经皮施用是将包封药剂的可变形纳米级囊泡施用于伤口。在特定实施例中，经皮施用是将经皮递送系统应用于伤口，该经皮递送系统选自由以下组成的群组：涂覆有药剂的微针、其中并入有药剂的固体聚合物基质、包括储存药剂的储库和半透膜的经皮贴剂、包括溶解于其中的药剂的经皮凝胶、和包括溶解于其中的药剂的经皮喷雾剂以及包括溶解于其中的药剂的计量剂量经皮喷雾剂。在另一个实施例中，药剂是合成的被设计成靶向npas2基因的mrna的小干扰核糖核酸(sirna)。在特定实施例中，sirna通过选自由以下组成的群组的途径施用：微针阵列、电穿孔、压力、机械按摩、阳离子脂质体、阳离子聚合物介导的递送系统、超声、缀合物递送系统，微气泡、脂质体气泡、超声敏感纳米气泡、碳纳米管、脂质基纳米载体、非脂质有机基纳米载体和无机纳米载体、金纳米颗粒和金纳米棒。在
一个实施例中，sirna是在核糖糖环、磷酸骨架、核碱基和核糖糖的2'位置被化学修饰，5'末端修饰或缀合。在另一个实施例中，核糖糖环是鸟苷或尿苷并且2'位置修饰选自由2'-ome、2'-f、2'-o-甲氧基乙基(2'-moe)组成的群组。在另外的实施例中，磷酸骨架用二硫代磷酸酯、三唑二聚体、酰胺或硼烷磷酸酯修饰。在另一个实施例中，其中核碱基和核糖糖修饰是5-氟-2
′‑
脱氧尿苷(fdu)、2
′‑
o-甲基二硫代磷酸酯(2
′
o-meps2)、亲脂性硼簇、3-n-[(1,12-二碳杂-闭式-十二硼烷-1-基)丙-3-基]胸苷(c2b10h11，cb)、胸苷和5-双(氨基乙基)-氨基乙基-2
′‑
脱氧尿苷。在某些实施例中，5'末端修饰或缀合是sirna的5'末端的棕榈酸缀合、与sirna的3'末端偶联的反向胸苷(idt)和在5'末端的棕榈酸缀合、sirna与细胞可渗透肽(cpp)的缀合、sirna与选自由苯基、羟基苯基、萘基和芘基衍生物组成的群组的芳族化合物的缀合；用脲/硫脲桥联的芳香化合物在3
′
突出区域的化学修饰；在有义链和反义链的3
′
端的聚乙二醇(peg)缀合；和sirna的胆固醇缀合。
[0208]
在另一个实施例中，开放性伤口部位包括选自胶原、真皮样胶原纤维或骨中的一种或多种的结缔组织。在另外的实施例中，开放性伤口部位是骨丢失的部位。在一个实施例中，骨丢失是牙周炎诱导的牙槽骨再吸收的部位。在一些实施例中，开放性伤口部位是牙龈结缔组织退化的部位。
[0209]
在一个实施例中，将抑制npas2的表达的药剂和/或作为npas2下调化合物的药剂配制成用于局部施用、经皮施用和/或皮下施用的药物组合物。在特定实施例中，药物组合物包括治疗有效量的抑制时钟基因npas2的表达的药剂，如本文所述。在某些实施例中，药物组合物包括治疗有效量的抑制时钟基因npas2的表达的药剂，该药剂有效地在骨丢失部位再生牙槽骨、在伤口部位再生结缔组织和/或减小需要其的受试者的伤口部位，特别是开放性伤口部位的伤口面积大小。在一个实施例中，药物组合物包括至少一种抑制时钟基因npas2的表达的药剂。在另一个实施例中，药物组合物包括抑制时钟基因npas2的表达的药剂的组合。
[0210]
外周昼夜节律时钟基因和伤口愈合
[0211]
结缔组织的功能和表型在皮肤和口腔组织中有所不同。真皮成纤维细胞、口腔成纤维细胞和骨形成成骨细胞是维持位点特异性功能和表型的结缔组织细胞，有助于健康的体内平衡。广义上的伤口通过改变其表型来影响结缔组织细胞，从而导致疤痕形成或功能的丧失。发明人在本文中描述了外周昼夜节律时钟在伤口愈合期间发挥了以前未被认识的作用。
[0212]
据报道，昼夜节律时钟基因调节成年动物的生理组织再生。核心昼夜节律时钟被严格维持在下丘脑的视交叉上核(scn)中，其是昼夜节律起搏器。时钟分子：昼夜节律运动输出周期kaput(clock)、神经元pas结构域2(npas2)和芳烃受体核转运蛋白样(arntl,bmal1)转录因子诱导周期(per)和隐花色素(cry)基因的表达，其蛋白质产物反过来又抑制clock、npas2和bmal1的转录活性。昼夜节律负责广泛的生理稳态功能，并且这种节律的破坏与慢性疾病和受损的组织修复有关。
[0213]
除了scn中的核心昼夜节律时钟外，如成纤维细胞和成骨细胞的外周组织具有可以自主发挥作用的外周时钟，如matsui ms，《皮肤中的生物节律(biological rhythms in the skin)》《国际分子科学杂志》2016；17(6)所述，其通过引用以其整体并入本文。先前的一项研究报告表明，人类烧伤损伤的数据库显示，在夜间(休息期)期间受伤的伤口比在白
天(活动期)期间受伤的伤口愈合得更慢，如hoyle np等人，《在伤口愈合期间，昼夜节律肌动蛋白动力学驱动有节律性成纤维细胞动员(circadian actin dynamics drive rhythmic fibroblast mobilization during wound healing)》《科学转化医学》2017；9(415)所述，其通过引用以其整体并入本文。这些结果表明昼夜节律在伤口愈合中的调节作用，尽管昼夜节律如何促进皮肤伤口愈合的机制仍不清楚。
[0214]
据报道，小鼠皮肤成纤维细胞表达npas2，这可能补偿clock表达的缺乏，如landgraf d等人，《npas2补偿外周昼夜节律振荡器中的clock的丢失(npas2 compensates for loss of clock in peripheral circadian oscillators)》《公共科学图书馆
·
遗传学(plos genet.)》2016；12(2):e1005882所述，其通过引用以其整体并入本文。通过微阵列分析在老化的人类皮肤中显著上调的基因中鉴定了npas2，如glass d等人，《基因表达随皮肤、脂肪组织、血液和大脑的年龄而变化(gene expression changes with age in skin,adipose tissue,blood and brain)》，《基因组生物学(genome biol.)》2013；14(7):r75，其通过引用以其整体并入本文。最近，已经观察到npas2在促进增强的皮肤伤口愈合中发挥作用，如sasaki h等人，《神经元pas结构域2(npas2)-缺陷成纤维细胞加速皮肤伤口愈合和真皮胶原重建(neuronal pas domain 2(npas2)-deficient fibroblasts accelerate skin wound healing and dermal collagen reconstruction)》《解剖记录》(霍博肯)2019所述，其通过引用以其整体并入本文。
[0215]
npas2-/-小鼠表现出比其他组更快的皮肤伤口闭合(图1a和1b)。npas2-/-成纤维细胞的细胞增殖、细胞迁移和细胞收缩大于wt成纤维细胞的细胞增殖、细胞迁移和细胞收缩(p《0.01)(图3a、3b、3c和3d)。在体外的npas2 ko成纤维细胞中发现了xii和xiv型faict胶原和真皮样胶原纤维形成的增加的表达。在肉芽组织区域中的胶原纤维结构在npas2-/-小鼠中被更好地重建。这些数据表明，昼夜节律，特别是npas2，可以调节皮肤伤口愈合。这些观察结果为探索治疗发展的新机会提供了依据。
[0216]
如上文和整个公开中所采用的，除非另有说明，否则以下术语和缩略语应被理解为具有以下含义。
[0217]
在本公开中，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指代物，并且除非上下文另有明确指示，提及特定数值至少包含所述特定值。因此，例如，提及“化合物”即提及本领域的技术人员已知的一种或多种此类化合物和其等效物等等。如本文所用，术语“多个”意指多于一个。当表达值的范围时，另一个实施例包含从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，应当理解，特定值形成另一个实施例。所有范围都是包含性的且可组合的。
[0218]
如本文所用，术语“组分”、“组合物”、“化合物的组成”、“化合物”、“药物”、“药理活性剂”、“药剂(agent)”、“活性剂”、“治疗剂”、“疗法”、“治疗”或“药剂(medicament)”在本文中可互换使用，以指代当施用于受试者(人或动物)时，通过局部和/或全身作用诱导期望的药理学和/或生理学效果的一种或多种化合物或物质的组合物。
[0219]
如本文所用，术语“治疗(treatment、treating)”或“疗法(therapy)”(以及其不同形式)哺乳动物、特别是人的疾病状态在本文中可互换使用，并且指的是(a)预防疾病状态在哺乳动物中发生，即预防疾病状态，特别是当此类哺乳动物易患该疾病状态但尚未诊断为患有该疾病状态时；(b)抑制疾病状态，即阻止其发展，和/或治愈疾病状态；和/或(c)缓
解疾病状态，即引起疾病状态的消退。如本文所用的术语“治疗”包含减轻或减少病症、疾病或障碍的至少一种不利或负面作用或症状。
[0220]
在一个实施例中，“预防”尤其是指延迟症状的发作、预防疾病复发、减少复发事件的次数或频率、增加有症状的事件之间的时延或其组合。在一个实施例中，“抑制(suppressing或inhibiting)”尤其是指降低症状的严重程度、降低急性发作的严重程度、减少症状次数、减少疾病相关症状的发病率、减少症状的时延、改善症状、减少次级症状、减少次级感染、延长患者生存期或其组合。
[0221]
如本文所用，术语“施用(administering、administer或administration)”是指将一种或多种化合物或组合物非经肠、经肠或局部递送到受试者。在一个实施例中，局部施用组合物。在另一实施例中，组合物经全身性施用。可以对细胞或组织培养物或对活的生物体(例如人类)实现施用。非经肠施用的说明性实例包含但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下的、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内和胸骨内注射和输注。经肠施用的说明性实例包含但不限于经口、吸入、鼻内、舌下和经直肠施用。局部施用的说明性实例包含但不限于经皮和阴道施用。在特定实施例中，药剂或组合物非经肠施用，任选地通过向受试者静脉内施用或经口施用。
[0222]
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换使用，并且是指向其提供治疗的动物，例如人，所述治疗包含用如本文所述的抑制npas2的表达的药剂和/或根据本发明的药物组合物预防性治疗和抑制疾病状态和继发性感染。如本文所用，术语“受试者”是指人和非人动物。术语“非人动物”和“非人哺乳动物”在本文中可互换使用并且包含所有脊椎动物，例如，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、犬、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、马等哺乳动物和如爬行动物、两栖动物、鸡和火鸡等非哺乳动物。
[0223]
根据本发明的方法中的任一种且在一个实施例中，本文所述的受试者为人类。在另一个实施例中，受试者为非人类。在一个实施例中，受试者为脊椎动物。在另一个实施例中，受试者为哺乳动物。在另一个实施例中，受试者为灵长类动物，其在一个实施例中为非人类灵长类动物。在另一个实施例中，受试者为鼠类，其在一个实施例中为小鼠并且在另一个实施例中为大鼠。在另一实施例中，受试者为犬科动物、猫科动物、牛科动物、马科动物、山羊科动物、绵羊科动物、猪科动物、猴科动物、熊科动物、狐狸科动物或狼科动物。在一个实施例中，受试者为鸡或鱼。
[0224]
在一个实施例中，本发明的组合物包括药学上可接受的组合物。在一个实施例中，所述组合物包括抑制时钟基因的表达的药剂，其中时钟基因是神经元pas结构域蛋白2(npas2)。在一个特定实施例中，抑制npas2的表达的药剂是如本文所述的抑制npas2的表达的任何一种药剂。在一些实施例中，“药学上可接受的组合物”和“药物组合物”被配制成用于局部施用、经皮施用和/或皮下施用。在一个实施例中，“药学上可接受的组合物”和“药物组合物”包括药学上可接受的载体或赋形剂。
[0225]
在一个实施例中，短语“药学上可接受的”在本文中用以指在合理医学判断范围内，适用于与人类和动物的组织接触而无过量毒性、刺激、过敏反应或其他问题或并发症，与合理效益/风险比相称的那些化合物、物质、组合物和/或剂型。
[0226]
如本文所用，“药学上可接受的载体”或“赋形剂”包含生理相容的溶剂、分散介质、
包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。在一个实施例中，药学上可接受的载体适合于局部施用、经皮施用和/或皮下施用。局部制剂包含凝胶、软膏、乳膏、洗剂、滴剂等。
[0227]
在一个实施例中，药学上可接受的载体适合于肠胃外施用。
[0228]
可替代地，载体可以适合于静脉内、腹膜内、肌内、舌下或口服施用。药学上可接受的载体包含无菌水溶液或分散体以及用于临时制备无菌注射溶液或分散体的无菌粉末。这类介质和药剂对于药学上活性物质的用途是本领域中众所周知的。除非任何常规的介质或药剂与活性化合物(即抑制npas2的表达的药剂)不相容，否则考虑其在本文所述的药物组合物中的用途。补充的活性化合物也可以被并入组合物中。
[0229]
治疗性药物组合物通常在制造和储存的条件下是无菌且稳定的。该组合物可以被配制成溶液、微乳液、脂质体或其他适合高药物浓度的有序结构。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。例如，可以通过使用包衣如卵磷脂、通过在分散体的情况下保持所需的粒度和通过使用表面活性剂来保持适当的流动性。在许多情况下，将优选的是在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇或氯化钠。可以通过在组合物中包含延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸盐和明胶)来实现可注射组合物的延长的吸收。
[0230]
此外，如本文所述的抑制npas2的表达的药剂可以以时间释放制剂的形式施用，例如以包含缓释聚合物的组合物的形式施用。抑制npas2的表达的药剂可以与将保护其避免快速释放的载体一起制备，如控释制剂，包含植入物和微囊化递送系统。可以使用可生物降解的生物相容性聚合物，如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(plg)。用于制备此类制剂的许多方法已获得专利或为本领域技术人员通常已知。
[0231]
无菌可注射溶液可以通过如下来制备：根据需要，将所需量的活性化合物(如本文所述的抑制npas2的表达的药剂)并入具有上文列举的成分中的一种或组合的适当溶剂中，然后过滤灭菌。通常，分散体是通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备的，该媒介物含有碱性分散介质和来自以上列举的那些的所需其他成分。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备的方法包含真空干燥和冷冻干燥，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外所需成分的粉末。在一些实施例中，如本文所述的抑制npas2的表达的药剂可以与一种或多种提高其溶解度的另外的化合物一起配制。
[0232]
在一个实施例中，以治疗有效量施用本发明的组合物。在一个实施例中，“治疗有效量”旨在包含单独的本发明的药剂或化合物的量，或要求保护的药剂或化合物的组合的量，或本发明的药剂或化合物与有效充当时钟基因、神经元pas结构域蛋白2(npas2)的表达的抑制剂(suppressor、inhibitor)或下调剂、有效地改善或加速受试者的伤口愈合、在受试者的骨丢失部位再生牙槽骨、在受试者的伤口部位再生结缔组织和/或减小受试者的开放伤口部位的伤口面积大小(所述药剂或化合物被施用或已经被施用至伤口部位)的其他活性成分的组合的量。在一个实施例中，本发明的抑制时钟基因npas2的表达的药剂的“治疗有效量”是足以向施用所述组合物的受试者提供有益效果的药剂的量。
[0233]
给出以下实例是为了更全面地说明本发明的示例性实施例。然而，所述实例决不应该被解释为限制本发明的广泛范围。
[0234]
实例
[0235]
实例1
[0236]
npas2-缺乏成纤维细胞加速皮肤伤口愈合和真皮胶原重建
[0237]
材料与方法
[0238]
动物伦理声明
[0239]
在本实验中使用c57bl/6j背景的npas2敲除(ko)小鼠(b6.129s6-npas2tm1slm/j，杰克逊实验室(jackson laboratory)，缅因州巴尔港(bar harbor,me))。npas2杂合突变体(npas2 /-)小鼠由冷冻保存的精子样品产生，并在ucla建立了活跃的繁殖菌落。npas2-/-和npas2 /-小鼠都被用作
[0240]
实验组，并且c57bl/6j野生型(wt)小鼠被用作对照组。所有使用动物的实验方案均经过ucla动物研究委员会(arc#2003-009)的审查和批准，并遵循《实验室动物人道护理和使用公共卫生服务政策(public health service policy for the humane care and use of laboratory animals)》和《ucla动物护理和使用培训手册(ucla animal care and use training manual)》指南。所有动物都可以自由获取食物和水，并且在ucla的实验动物医学部以12小时的光照/黑暗周期被保持在常规的房屋中。
[0241]
小鼠背侧皮肤全层切除伤口模型
[0242]
将体重约25g的9至14周龄小鼠(wt：四只雄性和四只雌性，npas2 /-：七只雄性和npas2-/-：七只雄性)用于背部皮肤全层伤口实验。在吸入异氟醚的情况下麻醉后，通过用5mm真皮活检穿孔器(integra，integra life sciences，新泽西州普莱恩斯伯勒(plainsboro，nj))刺穿穿过肉膜层(panniculus carnosus layer)的全层皮肤伤口，在背侧皮肤的右侧和左侧上同时产生相同的皮肤伤口。这些手术在上午11点与下午1点之间进行。在第0、2、4、6和12天获得伤口愈合过程期间的标准化照片。在每个时间点测量皮肤伤口面积(nih imagej ver.1.51)。通过kruskal-wallis试验和dunn后试验比较每天的伤口面积。这些小鼠在第7天(在每组中n＝4)和第14天(wt：四只小鼠，npas2 /-：三只小鼠和npas2-/-：三只小鼠)被处死以用于组织学分析。将含有伤口区域的背侧皮肤解剖为1平方厘米，并立即用10％中性缓冲福尔马林固定。切片用苏木精和伊红(he)染色以用于组织学评估。
[0243]
真皮成纤维细胞培养
[0244]
使用外植体方法培养来自三种基因型中每一种的小鼠背部皮肤的原代成纤维细胞。将细胞在加湿培养箱中在37℃、5％co2下在含有10％胎牛血清和100u青霉素/0.1mg/ml链霉素的杜尔贝科改良的eagle培养基(dmem)中培养。它们的基因型通过针对wt和突变npas2基因等位基因的聚合酶链反应(pcr)来确定。
[0245]
wst-1细胞增殖测定
[0246]
使用wst-1试剂(罗氏应用科学(roche applied science)，印第安纳州印第安纳波利斯(indianapolis,in))进行细胞增殖测定。将总共2,000个细胞接种到96孔读数板中，并在预定的时间点(第1、3、5和7天)培养。在每个时间点，将培养基更换为含有培养基的10％wst-1试剂并温育3小时(每个时间点n＝4)。使用读板器(syhnergy h1读板器，伯腾(biotek)，佛蒙特州威努斯基(winooski，vt))在分光光度计中在450nm处读取吸收值，并通过双向方差分析(anova)进行比较，然后在每个时间点进行tukey检验。
[0247]
皮肤成纤维细胞中的昼夜节律基因表达
[0248]
使用taqman mgb探针(赛默飞世尔科技有限公司(thermo fisher scientific inc.)，马萨诸塞州沃尔瑟姆(waltham,ma))通过定量实时pcr(rt-pcr)来确定皮肤成纤维细胞中八个核心昼夜节律基因的稳态mrna表达水平。成纤维细胞在24孔板中培养，通过向培养基中加入100nm地塞米松并温育2小时，以80％至90％的汇合度同步，然后用dmem洗涤(nagoshi等人，2004)。使用rneasy试剂盒(凯杰(qiagen)，加利福尼亚瓦伦西亚(valencia，ca))每6小时提取总rna，从同步后0-48小时(每个时间点n＝4)开始，并且它们的质量和数量由nanodrop(赛默飞世尔科技有限公司)确认。rt-pcr使用市售的如下引物/探针混合物(赛默飞世尔科技有限公司)进行：npas2(mm01239312_m1)、bmal1(＝arntl:mm00500223_m1)、clock(mm00455950_m1)、per1(mm0050 1813_m1)、per2(mm00478099_m1)、per3(mm00478120_m1)、cry1(mm00514392_m1)和cry2(mm01331539_m1)。gapdh用作内部对照。此外，确定了lacz报告基因的表达。首先通过双向anova进行统计分析。对双向anova和每个时间点的基因表达具有显著交互作用p值(p《0.05)的组进一步进行tukey检验。
[0249]
体外伤口愈合划痕板测定
[0250]
将成纤维细胞接种到6孔板中并如上同步。在2小时后，用20μl塑料移液管创建划痕线，并用培养基清洗所述划痕线(每组n＝5)。从0到24小时，每小时通过延时显微摄影来捕获这些划痕区域。在12小时和24小时计数迁移到划痕区域中的细胞的数量，并通过单向anova与事后holm检验进行比较。
[0251]
浮动胶原凝胶收缩测定
[0252]
浮动胶原凝胶收缩测定是按照先前建立的方案进行的，并进行了一些修改(ngo等人，2006)。将含有成纤维细胞(50,000个细胞)的500μl的胶原凝胶混合物(胶原i型，康宁(corning)，弗吉尼亚州马纳萨斯(manassas,va))的等分试样施加于24孔板(在每组中n＝5)并在室温下放置20分钟。将固化的凝胶转移到100mm直径的培养皿中并培养(37℃，5％co2，在加湿培养箱中)。凝胶图像在第0、6、12、24、48和72小时由扫描仪扫描。测量每个时间点的胶原凝胶面积(nih imagej ver.1.51)并通过双向anova进行比较，然后在每个时间点进行tukey检验。
[0253]
单细胞收缩评估
[0254]
使用荧光标记的弹性可收缩表面(flecs)(forcyte biotechnologies inc.，加利福尼亚州洛杉矶(los angeles,ca))(koziol-white等人,2016)测量单细胞收缩。具有柔软的硅酮弹性体薄膜底部的flecs板用荧光纤维蛋白原以均匀的“x”形状(70μm对角线
×
10μm厚)进行微图案化。将约30,000个细胞接种到24孔flecs板的孔中。将板在室温下放置40分钟并在培养箱(37℃，5％co2)中放置30分钟用于细胞附着。在温育初始细胞附着到x形图案后，通过用培养基洗涤去除漂浮的细胞，并将板温育另外的8小时。用hoechst 33,342(1:10,000)进行核染色。使用带有罗丹明滤光片的荧光显微镜来捕获x形图案上的荧光纤维蛋白原的图像。对于单细胞收缩评估，选择与附着在x形状的中心的单个核相关的微模式，并通过与无细胞模式进行比较将其分类为无收缩组或收缩组。在每个基因型(n＝5)之间比较每个捕获图像(含有约1,000个x形图案)的收缩模式的比率。统计分析通过单向anova和事后holm检验进行。
[0255]
肌动蛋白、整合素和胶原亚基的基因表达
[0256]
从同步后24至48小时，每6小时从成纤维细胞中提取总rna样品，如上所述。rna样
品用于通过基于taqman的qrt-pcr来评估肌动蛋白亚基—β-肌动蛋白(actb:mm02619580_g1)和α-平滑肌肌动蛋白(α-sma,acta2:mm00725412_s1)(图3g)；整合素亚基—整合素αv(itgav:mm00434486_m1)、整合素β3(itgb3:mm00443980_m1)和整合素β5(itgb5:mm00439825_m1)(图3h)；和胶原亚基—i型(col1a1:mm00801666_g1和col1a2:mm00483888_m1)、iii型(col3a1:mm00802300_m1)、xii型(col12a1:mm01148576_m1)和xiv型(col14a1:mm008052 69_m1)(图4a)的基因表达。在每个时间点通过双向anova和tukey检验进行统计分析。
[0257]
通过天狼猩红染色的体外胶原合成评估
[0258]
将成纤维细胞接种到24孔板中，并在补充有抗坏血酸(50μg/ml)的培养基中以80％
–
90％的汇合度培养1、3和7天。然后用10％中性缓冲福尔马林固定细胞并用天狼猩红(polyscience，伊利诺伊州奈尔斯(niles,il))染色以用于使胶原可视化。使用读板器(syhnergy h1读板器)在分光光度计中在550nm处读取吸收值，并通过单向anova与事后holm检验进行比较。
[0259]
通过天狼猩红染色和共聚焦激光扫描显微镜在皮肤伤口愈合区域的胶原纤维结构
[0260]
用于术后第7天和14天的背侧皮肤全层伤口实验的组织切片在伤口愈合期间针对胶原纤维用天狼猩红染色。使用共聚焦激光扫描显微镜来评估肉芽组织(gt)区域、伤口闭合区域(wca)和完整皮肤区域(isa)中的胶原纤维结构。评估了作为原始伤口宽度(a)的肉膜的边缘之间的距离和作为gt(b)的宽度测量的皮肤穿孔区域处成熟胶原的边缘之间的距离。伤口闭合的比率由(a-b)/a计算并通过kruskal-wallis检验与dunn的事后检验进行比较。
[0261]
结果
[0262]
npas2-/-小鼠的全层背侧皮肤伤口闭合加速
[0263]
术后第2天至第12天，全层背侧皮肤伤口持续收缩，并且在所有基因型中到第12天均识别到疤痕形成(图1a)。npas2-/-小鼠中第12天的相对伤口面积明显小于其他两种基因型(p《0.01)(图1b)。在组织学观察中，在术后7天观察到gt区域中的角化过度、残留凝块和免疫应答。此外，到第14天，带有毛囊的真皮结缔组织的边缘向伤口的中心移动。伤口区域处的上皮层似乎与完整的皮肤上皮相似，并且在所有样品中免疫应答都下降(图1c)。在本研究中，小鼠背侧皮肤全层切除伤口在中午(上午11点至下午1点)产生。据报道，在人类的夜间或休息期间发生的皮肤烧伤伤口显示出受损的愈合，如hoyle等人，2017，《在伤口愈合期间，昼夜节律肌动蛋白动力学驱动节律性成纤维细胞动员》《科学转化医学》9:eaal2774，其通过引用以其整体并入本文。夜间活动的小鼠的白天相当于人类的夜晚。如果伤口发生在小鼠的黑暗/活跃期，则wt与npas2 ko小鼠之间伤口愈合的差异可能会更加明显。
[0264]
npas2 ko突变对皮肤成纤维细胞的增殖和昼夜节律基因表达的影响
[0265]
通过pcr来确定每个成纤维细胞样品的基因型。小鼠npas2等位基因的外显子2被lacz表达报告盒(lacz/neo)取代。由于外显子2编码bhlh序列，因此产生的npas2分子缺乏dna结合功能。比wt的扩增pcr产物大的扩增pcr产物识别npas2-/-成纤维细胞，并且突变体和wt pcr产物均识别npas2 /-成纤维细胞。
[0266]
wst-1测定表明，npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞均比wt成纤维细胞增殖更快(p《
0.01)(图2b)。
[0267]
npas2的昼夜节律表达在npas2 /-成纤维细胞中降低，而在npas2-/-成纤维细胞中未检测到。然而，除per2表达外，没有观察到npas2 ko突变对其他昼夜节律基因的表达模式的影响(图2c)。报告基因(lacz表达)仅在npas2 ko小鼠中检测到。x
[0268]
通过划痕试验和浮动加速npas2-/-皮肤成纤维细胞的体外伤口愈合
[0269]
在体外进行了伤口愈合划痕试验、浮动胶原凝胶收缩测定和使用flecs的单细胞力评估。在24小时期间迁移的npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞的数量高于wt的数量(视频：https://players.brightcove.net/656326989001/default_default/index.html？videoid＝6013197672001)，其具有统计学意义(p《0.05)(图3a、3b)。然而，在npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞的细胞迁移率之间没有显著差异(图3a、3b)。浮动胶原凝胶收缩测定表明，npas2-/-成纤维细胞比wt和npas2 /-成纤维细胞收缩得更快(p《0.01)(图3c、3d)。
[0270]
α-sma和整合素的单细胞收缩和表达
[0271]
使用flecs对单细胞收缩的评估(图3e)显示，收缩的npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞的比率高于wt成纤维细胞的比率(p《0.01)(图3f)。通过rtpcr评估已知与细胞迁移相关的β-肌动蛋白(actb)和已知为上调肌成纤维细胞收缩活性的因子的α-sma(acta2)的基因表达水平(图3g)。两个肌动蛋白亚基的表达随着时间的推移而下降。然而，在三种基因型之间没有显著差异。整合素αv(itgav)、整合素β3(itgb3)和整合素β5(itgb5)的表达在真皮成纤维细胞中没有表现出任何昼夜节律。npas2 ko突变不影响检查的整合素亚基的稳态水平(图3h)。
[0272]
npas2-/-成纤维细胞在体外增加真皮样胶原合成
[0273]
在该实验中研究了i型(col1a1、col1a2)、iii型(col3a1)、xii型(col12a1)和xiv型(col14a1)的胶原亚基的基因表达水平(图4a)。总的来说，在这些胶原mrna中没有观察到昼夜节律模式。npas2-/-成纤维细胞中的col1a1和col1a2比wt和npas2 /-成纤维细胞中的表达更高；然而，交互作用p值仅对col1a2显著。对于col3a1表达没有观察到差异。在npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞中存在col12a1表达的增加。引人注目的是，与wt成纤维细胞相比，在npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞中发现col14a1的显著升高的表达。用抗坏血酸补充剂培养的成纤维细胞的天狼猩红染色显示出强烈的阳性反应，表明胶原纤维在npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞中形成和积累(图4b)；在第7天，它们在550nm处的吸光度明显高于wt成纤维细胞(p《0.01)(图4c)。
[0274]
在npas2-/-小鼠的皮肤伤口愈合期间的真皮样胶原纤维重建
[0275]
通过共聚焦激光扫描显微镜检查来检查具有天狼猩红染色的全层皮肤伤口区域的组织切片(图5a)。在isa中的胶原纤维结构不存在明显差异；然而，在npas2 /-和npas2-/-样品中gt区域和wca中的胶原纤维似乎比wt中的更厚。特别是，npas2-/-样品中gt的胶原纤维看起来更有组织，部分地类似于完整的皮肤胶原结构。伤口闭合的组织学测量是用天狼猩红染色的切片进行的(图5b)。npas2 /-和npas2-/-样品的伤口闭合的比率大于wt的伤口闭合的比率，尽管仅在第14天的wt和npas2-/-样品之间达到了统计学显著性(p《0.01)(图5c)。
[0276]
讨论
[0277]
哺乳动物皮肤是由上皮层(表皮)和下层结缔组织(真皮)组成的大型屏障组织。这
项研究提出了昼夜节律时钟在真皮成纤维细胞中对皮肤伤口愈合的新作用，这可能使真皮结缔组织胶原重建成为可能。一旦受伤，皮肤上皮细胞就会积极增殖并在伤口上迁移，导致屏障层的迅速建立。相比之下，真皮成纤维细胞的增殖和向伤口区域中的迁移较慢。此外，伤口成纤维细胞不会保持真皮成纤维细胞表型，而是获得新的表型，部分地导致gt和疤痕的形成。本研究证明了，在npas2 /-和npas2-/-小鼠中，可能通过比wt小鼠更快的伤口闭合和/或更小的疤痕形成，加速良好建立的皮肤全层伤口模型的愈合(图1)，如kowalska等人，2013，《nono将昼夜节律时钟与细胞周期相结合(nono couples the circadian clock to the cell cycle)》《美国国家科学院院刊(proc natl acad sci u s a)》110:1592
–
1599(其通过引用以其整体并入本)所述。因此，本研究着重于npas2 ko突变对真皮成纤维细胞行为的作用，作为机制研究。
[0278]
npas2是编码基本hlh转录因子的核心昼夜节律基因，并且在皮肤成纤维细胞中高度表达。npas2已被假定为补偿clock的作用，其在成纤维细胞中的表达速率相对较低(图2c)。在视网膜细胞的情况下，clock基因的敲低降低了npas2的mrna和蛋白质水平，而npas2的敲低不影响clock的mrna或蛋白质水平。本文的数据证实了先前的观察结果，即npas2 ko突变没有显著地影响核心昼夜节律基因的表达(图2c)。因此，npas2 ko突变的影响可能是由除昼夜节律的破坏以外的机制介导的。scn中npas2的表达在小鼠的黑暗/活跃期达到峰值。预计小鼠的伤口应答将显示出每日节律。然而，在本研究中并探讨这个问题。
[0279]
含有成纤维细胞的三维胶原凝胶已经被用于模拟组织重塑、伤口收缩和纤维化。体外成纤维细胞包埋的凝胶收缩的主要机制是由于成纤维细胞运动力。细胞牵引力被应用至基质ecm，这有助于胶原凝胶收缩。通过npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞证明了加速的胶原凝胶收缩(图3c、3d)，表明增加的成纤维细胞运动力。据报道，沉默人类结直肠癌细胞中的npas2表达会加速细胞迁移。本研究还显示通过npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞在体外划痕试验中加速迁移(视频：
[0280]
https://players.brightcove.net/656326989001/default_default/index.html？videoid＝6013197672001；图3a、3b)。众所周知，通过磷酸化激活细胞外信号调节激酶(erk)和磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶b(pi3k/akt)来调节细胞迁移、胶原凝胶收缩和皮肤伤口愈合。在成纤维细胞向肌成纤维细胞的表型转化中提示这些信号传导通路的激活，如α-sma的增加的表达。在本研究中，通过npas2 ko突变未提示成纤维细胞的表型转换(图3g)，因此排除了肌成纤维细胞样表型参与调节的胶原凝胶收缩和成纤维细胞迁移。然而，重要的是表征npas2 ko突变对erk/akt/fak通路中的磷酸化的影响。
[0281]
在迁移期间，成纤维细胞通过整合素分子粘附至细胞外基质(ecm)并产生单细胞牵引力。使用了最近开发的单细胞收缩测定，该测定需要细胞粘附到印刷有纤连蛋白的flecs，如koziol-white等人，2016，《pi3k的抑制以ρ激酶依赖性方式促进人类小气道的扩张(inhibition of pi3k promotes dilation of human small airways in a rho kinase-dependent manner)》《英国药理学杂志(br j pharmacol)》173:2726
–
2738；pushkarsky等人,2018，《用于高通量单细胞力细胞仪的弹性体传感器表面(elastomeric sensor surfaces for high-throughput single-cell force cytometry)》，自然生物医学工程《nat biomed eng》2:124
–
137所述，其每一个都通过引用以其整体并入本文。flecs测定表明，小鼠真皮成纤维细胞通过npas2 ko突变增加了细胞收缩行为(图3f)。已经假定
伤口诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化在组织收缩和纤维化形成中起病理作用。另外，介导细胞与纤连蛋白粘附的α和β整合素的增加的表达被认为对细胞收缩性驱动的伤口纤维化形成至关重要。例如，已经假定整合素αvβ3的显著升高的表达导致特发性肺纤维化。在本研究中，通过在真皮成纤维细胞中的npas2 ko突变并未改变肌成纤维细胞标记物α-sma以及整合素亚基αv、β3和β5的稳态表达(图3g、3h)。因此，通过npas2 ko突变的增加的成纤维细胞收缩性可能不会导致病理性伤口收缩或纤维化形成的异常伤口愈合表型。
[0282]
结缔组织ecm分子，特别是facit类胶原，已被证明通过整合素介导的细胞粘附影响细胞迁移和细胞收缩。facit类胶原已经被假定用于装饰胶原纤维的表面。外部暴露的n-末端球状结构域，如xii型和xiv型胶原的nc3结构域，已被证明在成纤维细胞介导的胶原凝胶收缩中是必需的。因此，发明人推测，npas2 ko成纤维细胞中xii型和xiv型胶原的增加的表达可能影响迁移和凝胶收缩行为。
[0283]
据报道，npas2表达的下调与细胞周期进程和dna修复能力有关，尽管存在关于npas2调节对细胞增殖的影响的相互矛盾的报道。本研究表明npas2 ko突变增加了成纤维细胞增殖(图2b)，这可能混淆了细胞迁移测定。当评估延时显微镜时(视频：https://players.brightcove.net/656326989001/default_default/index.html？videoid＝6013197672001)，在所有基因型的划痕区域内均未观察到增殖细胞，这表明npas2对细胞增殖和迁移的影响是通过除了细胞增殖以外的机制发生的。
[0284]
先前，据报道，钛基生物材料增加了骨髓间充质基质细胞(bmsc)的npas2表达，同时增加了ii、ix和x型软骨胶原的表达，表明npas2可能介导生物材料诱导的bmsc分化。因此，机械解剖的第一步是通过真皮相关的胶原检查皮肤成纤维细胞的分化。皮肤真皮胶原ecm主要由形成原纤维的i型和iii型胶原组成，它们形成厚的胶原纤维。已经在发育中的皮肤中发现facit xii和xiv型胶原。xii和xiv型胶原被假定为装饰胶原纤维的表面并调节具有组织特异性功能的生理ecm组织。相比之下，伤口成纤维细胞在gt中大量合成具有不同性能的胶原ecm。本研究揭示了通过npas2 ko成纤维细胞对facit xii和xiv型胶原的显著上调(图4a)。由天狼猩红染色描绘的体外胶原纤维形成在npas2 /-和npas2-/-成纤维细胞的培养物中显示出厚的胶原纤维(图4b、4c)。稳健地增加的facit表达可能有助于皮肤伤口中真皮样胶原纤维的重组。事实上，npas2-/-小鼠表现出含有成熟真皮样胶原结构的wca增加(图5a)。此外，npas2-/-小鼠的gt显示出较厚的胶原纤维，部分地类似于真皮样胶原纤维结构。总之，本发明人提出，具有降低的npas2表达的成纤维细胞可以分化为真皮成纤维细胞，而不是肌成纤维细胞或gt成纤维细胞，并且npas2抑制的成纤维细胞可以诱导它们更好地重建(如果不是部分再生的话)真皮胶原结构的能力。
[0285]
本实例证明了外周皮肤成纤维细胞中的npas2抑制改变了细胞行为，并且通过体外加速的细胞增殖、细胞迁移和细胞收缩力来描述。此外，npas2抑制导致增加的真皮facit胶原合成和厚胶原纤维的形成。这些成纤维细胞表型似乎有助于更好的皮肤伤口愈合和真皮胶原结构的潜在重建。在本研究的范围内，昼夜节律时钟分子(如npas2)在真皮伤口愈合中的机制可能促进皮肤特异性细胞分化。根据这些结果，发明人提出npas2可能是用于改善皮肤伤口愈合的有吸引力的治疗靶标。
[0286]
实例2
[0287]
使用高通量筛选来筛选抑制npas2表达的小分子化合物
[0288]
在实例1中，携带已经开发和验证的npas2-lacz报告基因的小鼠真皮成纤维细胞证实lacz的检测与npas2表达一致，如sasaki h等人，《神经元pas结构域2(npas2)-缺陷成纤维细胞加速皮肤伤口愈合和真皮胶原重建》《解剖记录》(霍博肯)2019所述，其通过引用以其整体并入本文。
[0289]
ucla学术实验室建立了靶向npas2的再生时间疗法的研究平台：(1)小化合物的高通量筛选(hts)；(2)体外生物学验证；(3)小鼠牙周炎模型中的体内试验。该研究平台成功地鉴定出具有再生活性的化合物利血平，以及抑制npas2的额外化合物。
[0290]
发明人发现hts在鉴定降低靶基因表达的化合物方面是较少有效的。由于细胞毒性导致细胞死亡或生长抑制，许多抑制npas2的化合物被证明是假阳性。
[0291]
对hts协议进行了改进，以更好地鉴定npas2抑制剂。携带npas2-lacz报告基因的小鼠msc，如hassan n等人，《公共科学图书馆
·
综合》2017；12(8):e0183359(其通过引用以其整体并入本文)所述，使用sv40被永生化以便适应大规模hts。永生化和初级msc的lacz报告基因的表达是一致的(数据未示出)。该细胞系统用于筛选fda批准的药物库(1120种化合物)。还通过钙黄绿素am hoechst 33342染色对同一文库的细胞活力进行筛选。使用oristm pro细胞迁移测定板的细胞迁移测定，如joy me等人，《公共科学图书馆
·
综合》2014；9(2):e88350(其通过引用以其整体并入本文)所述，用于使用人皮肤成纤维细胞的高通量迁移测定
[0292]
组合的z评分用于鉴定命中化合物(表1)。鉴定了少数抑制npas2的化合物(表1)。npas2表达抑制剂化合物的最高命中是dwn1，即利血平。(npas2抑制z评分：-2.57；和细胞迁移z评分：4.19)。
[0293]
dwn1与先前来自lopac库的鉴定的dwnc化合物相同。选择dwn1化合物(利血平)以用于连续稀释分析。有效浓度(ec)在0.5-10μm的范围内测定，并且抑制浓度(ic)》12.5μm(图10)。dwn1用于下文所述的初步体外和体内研究。鉴定了抑制npas2的额外化合物(表2)。
[0294]
表1：通过fda药物库的hts鉴定的抑制npas2表达的小分子化合物。med是一种药用化合物。
[0295][0296]
表2：额外的npas2表达抑制剂
[0297][0298]
实例3
[0299]
体外表型研究
[0300]
选择利血平并针对成骨分化表征其对骨髓基质细胞(bmsc)的作用。利血平剂量依赖性地加速体外矿化(图7a)。晚期成骨分化标记物：骨钙素(ocn)的表达在第21天显著增加，而骨桥蛋白(opn)受到轻微影响(图7b)。
[0301]
为了评估涉及npas2的作用机制，将利血平应用于wt、npas2 /-和npas2-/-小鼠bmsc并评估体外成骨分化。在wt以及npas2 /-bmsc中可重复地观察到利血平的作用。然而，它并没有调节npas2-/-bmsc，这表明利血平在支持bmsc的成骨分化中的作用模式(moa)是抑制npas2。
[0302]
实例4
[0303]
体内皮肤伤口愈合研究
and collagen sponge alone)》《牙周病杂志(j periodontal)》2014；85(4):525-35所述，其通过引用以其整体并入本文。由于拔牙窝的上半部通常不被新骨填充，因此拔牙窝的上半部由再生剂如bmp-2诱导的“骨形成”被认为是重新骨形成或骨再生，因此，npas2 ko小鼠的整个拔牙窝的骨填充可以被解释为前所未有的骨再生活动。npas2 ko小鼠的骨髓来源的间充质基质/干细胞(msc，也被称为bmsc)在暴露于成骨培养基时也表现出稳健的体外矿化(图6d)和增加的bmp-2表达(图6e)，表明昼夜节律(特别是npas2)可以调节骨再生。npas2 ko msc也显示出bmp受体的增加的表达(数据未示出)。这些观察结果已经为探索治疗发展的新机会提供了依据。
[0314]
本发明人假设治疗性抑制npas2增加了维持结缔组织(如真皮成纤维细胞和牙槽骨再生)的未修饰功能和表型的能力，从而抑制npas2提高结缔组织再生和牙槽骨再生的能力。
[0315]
实例8
[0316]
npas2抑制化合物对小鼠结扎诱导的牙周炎模型中的牙槽骨再生的疗效
[0317]
将实例2的选定的最高命中化合物dwn1(利血平)经修饰后应用于良好建立的结扎诱导的牙周炎模型。在第14天建立牙周炎后，从模拟非侵入性牙周炎治疗：刮治和牙根平整(srp)的小鼠磨牙去除结扎线(图12a-12d)。dwn1在abr llc专有的跨上皮可变形纳米级囊泡(dnv)中配制(57)并且每周一次局部施用至腭牙龈组织(图12e)。实验组展示了归一化的牙龈上皮(图12f、12h)。牙槽骨再生通过microct在dwn1处理的腭侧而不是在未处理的颊侧显示(图12g)。在dwn1组中，不仅牙槽骨而且牙周胶原与sharpey纤维似乎都被重建(图12h)。强烈地表明dwn1(利血平)的体内再生功效。
[0318]
实例9
[0319]
筛选npas2下调化合物
[0320]
源自npas2-/-小鼠的股骨bmsc先前以lacz的表达为特征，如hassan,n.等人(2017)，《具有复杂表面的钛生物材料在骨髓间充质基质细胞中诱导异常的外周昼夜节律(titanium biomaterials with complex surfaces induced aberrant peripheral circadian rhythms in bone marrow mesenchymal stromal cells)》《公共科学图书馆
·
综合》12,e0183359,其通过引用以其整体并入本文，其用于lopac1280的高通量筛选(图13a)。针对z评分》2.5或《-2.5分析的筛选的输出数据导致总共24个命中：7种npas2-上调化合物和16种npas2-下调化合物(图13b)。验证研究鉴定了总共14种化合物(图13c)，它们经受化学遗传学分析。发现npas2上调化合物减少细胞内camp或刺激α2肾上腺素能受体。相比之下，npas2下调化合物刺激或积累camp，或诱导camp应答元件结合(creb)激活(表3)。
[0321]
表3：npas2下调化合物
[0322][0323][0324]
*在lopac筛选中针对阴性对照的活性
[0325]
实例10
[0326]
通过高通量筛选(hts)鉴定调节npas2表达的小分子化合物
[0327]
使用multidrop combi系统将培养基分配到384孔板中，并使用自动化biomek fx系统应用来自所选文库的化合物。将永生化的npas2-lacz msc(每孔1,500个细胞)分配到每个孔中，并在37℃下温育36小时(npas2的峰值表达时间)。然后，将msc与lacz检测剂(β-glo、promega、madison、wt)一起温育，并通过发光法测定β-半乳糖苷酶活性。将在cdd vault算法(collaborative drug discovery vault，加利福尼亚州伯林盖姆(burlingame，ca))上分析光度计数据，以用于将抑制剂初始鉴定为z评分《-2.5。然后将初级msc与初始命中化合物一起温育并用钙黄绿素am/hoechst 33342染色，用于高通量旋转圆盘共聚焦显微镜(imageexpress
confocal
,molecular devices，加利福尼亚州圣何塞(san jose,ca))。活力将通过细胞的数量和大小来确定。命中化合物将由npas2 z-评分(《-2.5)和细胞活力z评分(》-2.5)来确定。
[0328]
验证
[0329]
将命中化合物分配到一式三份的384孔板上，并且将添加具有npas2-lacz报告基因的初级msc。在温育36小时后，将测定β-半乳糖苷酶活性。通过学生t检验，对于p《0.01，经验证的化合物必须在统计学上显示出比未处理的对照更少的npas2-lacz表达。
[0330]
ec和ic的滴定
[0331]
经验证的命中化合物将在一式三份的384孔板的20个孔中从100μm滴定至0.2nm，并且将分配初级npas2-lacz msc(每孔1,500个细胞)。在温育36小时后，将测定细胞计数和
β-半乳糖苷酶活性。具有显著npas2-lacz下调和细胞计数减少的化合物浓度的范围将分别为ec范围和ic范围。将鉴定具有ec
50
≥10x ic
50
的最小治疗指数的最终命中化合物。
[0332]
作为生物学变量的性别
[0333]
在孤立的骨骼细胞的昼夜节律时钟行为中没有观察到性别差异，如okubo n等人，《公共科学图书馆
·
综合》2013；8(11):e78306所述，其通过引用以其整体并入本文。建议使用单性别msc用于hts(脊椎动物)。
[0334]
预期的结果
[0335]
从约40,000种化合物中，预计将鉴定出40种(或0.1％)下调npas2的命中化合物，并将验证约100种化合物。命中化合物将通过ec和ic指数进一步消除。预计将进一步分析20名候选者。
[0336]
潜在的问题和替代的计划
[0337]
对于hts，建议使用永生化的msc。等位基因组pcr将在5代后进行，以确保稳定性。尽管不太可能，但可能会发生基因转移或其他突变。如果需要，将使用来自npas2-lacz小鼠的新一批初级msc。
[0338]
实例11
[0339]
建立npas2抑制化合物在体外加速成骨分化的功效
[0340]
alp表达测定和体外矿化测定
[0341]
野生型雄性和雌性小鼠msc将在37℃下在5％co2下用补充有10％fbs和1％抗生素的dmem培养。在达到半汇合后，培养基将被含有命中化合物之一(在0.1％dmso中的0.1、1和10μm)的成骨培养基(100nm地塞米松；10mmβ-甘油磷酸盐；50μm抗坏血酸)替换。必须注意的是，暴露于地塞米松会使msc同步。在培养的第7天，将使用市售的试剂盒(例如abcam ab83369)测量细胞裂解物中的酶促alp活性。比色数据将被转换为alp酶活性(每个化合物n＝3)。另外，在第21天，将按照标准方案(即，ared-q,sciencell research laboratories,加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca)或quantichrome钙测定试剂盒,bioassay systems，加利福尼亚州海沃德(heyward,ca))来评估体外矿化。将获得平均茜素红s浓度或ca 浓度(n＝3)。
[0342]
成骨分化相关的基因表达
[0343]
将对“候选”化合物进行体外成骨分化时间进程的表征。暴露于从上述实验中鉴定的“候选”化合物的最佳浓度的加速成骨分化的野生型msc将用于在3、7、14和21天的培养期分离总rna样品。将对runx2、osx、ocn、bmp2、bmpr2、col1a1、opn以及作为对照的gapdh执行实时pcr。
[0344]
对照
[0345]
将获得以0.1％dmso作为未处理对照的msc的alp、体外矿化和成骨基因表达的定量值。对于阳性对照，建议用bmp-2(100ng/ml)补充成骨培养基。
[0346]
数据分析
[0347]
包括未处理对照和阳性对照在内的所有测定数据将被列为最强的1。然后，将鉴定具有高于未处理的msc等级的组合等级的化合物。从这个列表中，“候选”化合物将被选择为最强的5个组合排名。预计可能表现出与bmp-2处理的阳性对照相同的活性的候选化合物。
[0348]
作为生物学变量的性别
[0349]
骨体积和结构是两性异形的，并且雄性msc比雌性msc形成更多矿化的结节。已经提出了雄性msc和雌性msc之间的内在分子差异。建议使用雄性msc和雌性msc(脊椎动物)。
[0350]
预期的结果
[0351]
预计将通过(1)骨转换标记物、alp表达和(2)体外矿化成功地评估命中化合物，以用于证明加速的成骨分化。排序方案应当鉴定候选化合物。预计大多数化合物将比未处理的对照产生统计学上更大的alp和体外矿化数据。排名靠前的化合物可以达到同等水平的bmp-2衍生的成骨分化。将包括那些在成骨分化相关基因表达方面具有高等级的化合物。“候选”化合物应通过成骨基因的协调的时间进程表达证明加速的体外成骨分化。将选择前10名“候选”化合物用于体内研究，以证明npas2抑制化合物对小鼠结扎诱导的牙周炎模型中的牙槽骨再生的疗效。
[0352]
潜在的问题和替代的计划
[0353]
有效剂量可能变化。如果来自经鉴定的通过hts调节npas2表达的小分子化合物的ec范围在建议的0.1至10μm的剂量范围之外，则这些化合物将在定制的浓度范围内进行测试，并且如果需要，将经受药物化学测试。应当注意，人和小鼠msc对bmp-2的反应不同。先前通过反馈系统控制算法开发了一种含有生理对中bmp-2的高度生理成骨分化混合物，如honda y等人，《科学报告》2013；3:3420所述，其通过引用以其整体并入本文。建议使用常规的bmp-2(100ng/ml)培养基用于阳性对照；然而，如果需要，可以使用替代的阳性对照混合物。
[0354]
实例12
[0355]
在小鼠结扎诱导的牙周炎模型中证明npas2抑制化合物对牙槽骨再生的功效
[0356]
使用或不使用重组生长因子的微创手术清创术已经显示出类似的小骨下袋的放射照相骨填充。内在环境被建议用来支持牙槽骨再生。假定的时间疗法可能不会诱导异位骨形成，但支持宿主的愈合环境。为了测试这一假设，前5种候选化合物将应用于改良的小鼠结扎诱导的牙周炎模型，并将确定体内牙槽骨再生的功效。
[0357]
dnv制剂
[0358]
将水溶性或脂溶性小化合物溶解在水性或脂质组分中。使用微流体，将水性组分和脂质组分混合以产生dnv，如pct/us2016062552中所述，其通过引用以其整体并入本文。dnv将以冷冻干燥粉末的形式提供。
[0359]
小鼠牙周炎
[0360]
将使用雄性和雌性小鼠。为了诱导牙周炎，将在上颌第二磨牙周围放置5.0丝线缝合线。在14天后，将去除缝合线，模拟非手术清创治疗：刮治和牙根平整(srp)。dnv中的候选化合物将在纯化和灭菌水中重构，并且局部应用于腭牙龈(如图12e所示)。
[0361]
数据分析
[0362]
在第28天，将收获小鼠上颌骨并进行microct(n＝20/组)和用钙黄绿素注射(n＝10/组)的骨形态测量分析以及脱钙组织学(h&e和天狼猩红染色：n＝10/组)。此外，骨转换标记物(tracp5b；ctx；p1np和alp)的血清水平将被确定。
[0363]
样品大小
[0364]
根据先前的microct数据(图12g)，为了达到0.8的功效，建议使用20的样品大小。
[0365]
作为生物学变量的性别
[0366]
牙周炎具有记录的性别二分法，其中在男性中患病率较高，这可能是由于先天免疫的性别差异等。在本实例中建议使用雄性和雌性小鼠来证明npas2抑制化合物在小鼠结扎诱导的牙周炎模型中对牙槽骨再生的功效。(脊椎动物)。
[0367]
预期的结果
[0368]
牙槽骨再生的主要结果将通过microct进行评估。将由组织形态计量学、组织学和血清标记物来提供支持性证据。牙龈/pdl结缔组织的重建的探索性结果将通过天狼猩红染色组织学的共聚焦激光扫描显微镜进行评估。预计前5种化合物将被鉴定以用于实例“阶段ii”中的测试。
[0369]
潜在的问题和替代的计划
[0370]
应当注意，候选化合物的药物制剂需要详细的优化。在阶段i(本文提出的实例)的范围内，建议对所有候选化合物使用dnv经口腔上皮药物制剂。最佳药物制剂将在实例13(阶段ii)中说明。
[0371]
实例13
[0372]
阶段ii
[0373]
在本实例中，计划确定(1)最终的药物制剂；(2)对犬的牙周炎的疗效；以及(3)牙周和牙槽骨再生的基于小化合物的计时疗法的安全性。
[0374]
计划一项大型动物(犬)研究，如kol a等人，《伴侣动物：转化科学家的新的好朋友(companion animals:translational scientist's new best friends)》《科学转化医学》2015；7(308):308ps21和arzi b等人，《人类和动物的颅颌面障碍和解决方案(craniomaxillofacial disorders and solutions in humans and animals)》《牙科研究杂志(j dent res.)》2018；97(4):364-70所述，其每一个通过引用以其整体并入本文。
[0375]
实例14
[0376]
npas2在颅面组织再生中的作用
[0377]
广泛的损伤和慢性炎症通常会导致伤口修复伴纤维化，其阻止组织再生。因此，假设抑制“伤口修复基因npas2”可能导致伤口愈合朝向组织再生。在npas2 ko小鼠的颅盖骨中产生的临界尺寸缺陷在存在低剂量bmp-2(325ng以下)的情况下随着骨和骨髓组织的稳健再生而被治愈(图14a、14b)。与颅骨缺损相似，拔牙窝中的骨形成经历了膜内骨化，而没有软骨前体组织；但拔牙后的骨再生仅限于牙槽骨窝的下半部分。目前，填充拔牙窝的上半部分的唯一其他方法是使用再生剂如bmp-2。npas2 ko小鼠在没有外源性施加的bmp或干细胞的情况下独特地展示了超过80％-100％的拔牙窝填充有新骨(图14c、14d)。
[0378]
实例15
[0379]
牙周炎造成的牙槽骨丢失在npas2 ko小鼠中再生
[0380]
牙周炎是由口腔微生物病原体的失调与不协调的口腔屏障免疫组合诱导的慢性炎症。上颌磨牙周围的结扎线放置显示可诱发小鼠的牙周炎，并且该模型已经被用于表征口腔微生物行为、牙龈屏障免疫反应和侵袭性牙槽骨吸收(图15a-15c)。在该小鼠模型中，发现影响的牙龈组织中的npas2表达水平逐渐升高(图15d)。目前的常规治疗是通过刮治和牙根平整(srp)从牙周袋中机械地去除牙菌斑和牙石。通过在第14天去除缝合线来模拟srp，并监测愈合2周(d28)。牙龈炎症消退(图15e)，但在wt小鼠中失去的牙槽骨高度(图15f)没有恢复(图15g)。当将该牙周炎模型应用于npas2 ko小鼠时，d14的牙槽骨丢失与wt
小鼠无法区分(图2f)。然而，在模拟的“srp”治疗后，在npas2 ko小鼠中牙槽骨高度显著恢复(图2g)。
[0381]
实例16
[0382]
抑制小鼠牙周炎中npas2再生牙槽骨的小化合物
[0383]
ucla分子筛选共享资源(ucla molecular screening shared resources)(mssr)是一项按服务收费的核心设施，以支持药物就绪化合物的高通量筛选(hts)。mssr是一个学术机构的独特设施，其在各种文库中存储了超过200,000种化合物，并且排列了crispr、cdna、shrna和sirna的全基因组集合(mssr.ucla.edu)。本发明人使用携带npas2-lacz报告系统的小鼠msc和成纤维细胞进行了多次hts。hts的双重目标是[1]通过化学基因组学分析阐明npas2调节的机制；和[2]说明抑制npas2的化合物是否能够再生牙槽骨。
[0384]
从fda批准的药物库(1120种化合物)和lopac库(1280种化合物)中，鉴定了调节npas2-lacz表达的化合物的列表。对于后一个目标，选择一种下调npas2-lacz表达的化合物(dwn1)并将其应用于小鼠牙周炎/治疗模型(图15e-15g)。dwn1被配制成用于局部应用至腭牙龈。在牙周炎诱导14天后，去除结扎线，并且每周一次将dwn1局部应用于腭牙龈(图16a)。在第28天时，仅在应用dwn1的腭侧观察到显著的牙槽骨再生(图16b、16c)。存在额外的意想不到的观察结果，即牙龈和牙周韧带胶原纤维被重组，并且sharpey纤维可能再生(图16d)。这些结果为追求口服再生时间疗法的可行选项的临床和转化开发提供了基础。
[0385]
实例17
[0386]
来自hts-化学基因组学的时间生物学假设
[0387]
hts数据的化学基因组学分析鉴定了一组靶向单胺相关转运蛋白和受体的药物(图17)。单胺类(即去甲肾上腺素、血清素、多巴胺、组胺)已经被广泛地表征为神经递质，并且已经开发了大量靶向该轴的药物。必须指出的是，它们的受体已经在非神经元细胞如msc中发现，并且单胺诱导的信号转导被假定为调节成骨细胞的生长和分化。此外，在非神经元细胞中也报道了单胺转运蛋白，并且发现所有单胺转运蛋白均由msc表达(图18)。
[0388]
事实上，dwn1是泛单胺转运蛋白之一的抑制剂，它下调npas2并表现出组织再生活性(图16a-16d)，表明单胺受体和转运蛋白的调节轴可以调节npas2的表达，从而导致再生能力的诱导。利用hts/化学基因组学数据，组织再生的时间生物学将在一项侧重于单胺途径轴和下游npas2表达的研究中得到阐明。这项研究应该建立牙周组织再生所提出的时间疗法的作用机制(moa)。
[0389]
实例18
[0390]
牙周组织再生的“时间疗法”[0391]
昼夜节律同步影响许多分子、生理和生物过程。在神经精神疾病以及代谢疾病和癌症中报告了昼夜节律的失调。越来越多的报道表明昼夜节律时钟分子可以是治疗靶；例如，用于恶性胸膜间皮瘤和阿尔茨海默病的bmal1。小分子调节昼夜节律系统的治疗潜力已经被提出作为“时间疗法”的新方法。该项目建议开发创新的基于小化合物的用于牙科组织再生的时间疗法。为此，将充分地探索单胺途径轴的化学空间以用于调节npas2表达。将使用以下方法：
[0392]
研究1.构建化学空间特异性hts化合物库并鉴定用于调节npas2的时间治疗化合物(由abr llc执行)
[0393]
基本原理和目标。初步hts鉴定了一组靶向单胺相关转运蛋白和受体的药物，这些药物影响了msc中npas2的表达。本研究的目的是使用定制的化合物库进行重点hts，该化合物库由单胺转运蛋白和单胺受体的化学空间中的选定小分子化合物组成。本研究建议[1]构建针对单胺途径的化学空间定制的重点化合物库；[2]完成hts；[3]验证npas2表达和msc成骨分化；[4]确定有效浓度(ec)和抑制浓度(ic)。
[0394]
abr llc在ucla加州纳米系统研究所(cnsi)具有孵化器空间，该研究所还设有ucla药物筛选核心设施mssr。abr llc拥有对mssr的完全访问权限，其中将定制化学空间特定库并将执行hts。abr llc将完成此项目的目标。
[0395]
实验1(化学空间特定库)。存在7个单胺转运蛋白(图18)。mssr具有总共51种靶向单胺转运蛋白的化合物，它们可作为抑制剂。另外，通过总共283种化合物靶向肾上腺素能受体、多巴胺受体、血清素受体、毒蕈碱/烟碱受体和h1受体。这些化合物是激动剂或拮抗剂。因此，在单胺化学空间特异性化合物库中将包含总共334种化合物。化合物库将在384孔板中构建，包含用于hts的仅媒介物对照孔。
[0396]
实验2(hts)。培养基将使用multidrop combi系统分配到384孔板中，并且来自化学空间特定库的化合物将使用自动化biomek fx系统施加。将永生化的npas2-lacz msc(每孔1,500个细胞)分配到每个孔中，并在37℃下温育36小时(npas2的峰值表达时间)。msc将用钙黄绿素am/hoechst 33342染色，用于高通量旋转圆盘共聚焦显微镜(imageexpress
confocal
,molecular devices,加利福尼亚州圣何塞)进行细胞活力测量，然后与lacz检测剂(beta-glo,promega,madison,wt)一起温育。β-半乳糖苷酶活性将通过发光法测定。数据将在cdd vault算法(collaborative drug discovery vault，加利福尼亚州伯林盖姆)上分析以用于npas2表达和细胞活力，以确定每次测量的z评分。基于上述初步数据，npas2 z-评分阈值将为》2.5且《-2.5，并且细胞活力z-评分阈值将在-1.0与 1.0之间。
[0397]
实验3(验证)。将有效调节npas2的化合物分配到一式三份的384孔板上，并将添加具有npas2-lacz报告基因的msc。在温育36小时后，将测定β-半乳糖苷酶活性。对于p《0.01，通过学生t检验，经验证的化合物必须比未处理的对照显示出统计学上调节的npas2-lacz表达。
[0398]
图10显示了滴定测定。将dwn1从100μm连续稀释至0.2nm，并应用于msc npas2-lacz。ec由lacz表达确定，并且ic由使用钙黄绿素am/hoechst 33342染色的细胞活力确定。
[0399]
实验4(ec和ic的滴定)。经验证的用于抑制npas2的命中化合物将在一式三份的384孔板的20个孔中从100μm滴定至0.2nm，并且将分配npas2-lacz msc(每孔1,500个细胞)。在温育36小时后，将确定细胞计数和β-半乳糖苷酶活性(图10)。具有显著npas2-lacz下调和细胞计数减少的化合物浓度的范围将分别为ec范围和ic范围。最终命中化合物将被鉴定为具有ec
50
≥10x ic
50
的最小治疗指数。该研究还将确定每种命中化合物的最佳浓度。
[0400]
实验5(成骨分化)。将最佳浓度的在0.1％dmso中的npas2抑制命中化合物添加到wt雄性和雌性小鼠msc的常规成骨培养物中。成骨分化程度将由alp活性(例如abcam ab83369)和体外矿化(即ared-q，sciencell research laboratories,加利福尼亚州卡尔斯巴德(carlsbad,ca))确定(图19)。此外，总rna样品将在3、7、14和21天的培养期制备。将对runx2、osx、ocn、bmp2、bmpr2、col1a1、opn以及作为对照的gapdh执行实时pcr。对照：以0.1％dmso作为未处理的对照，获得msc的alp、体外矿化和成骨基因表达的定量值。对于阳
性对照，将使用含有bmp2(100ng/ml)的成骨培养基。
[0401]
作为生物学变量的性别。在分离的骨骼细胞的昼夜节律时钟行为中没有观察到性别差异。建议对于实验1-4使用单性别msc。骨体积和结构是两性异形的，并且雄性msc比雌性msc形成更多矿化的结节。已经提出了雄性msc和雌性msc之间的内在分子差异。对于实验5将使用雄性msc和雌性msc。
[0402]
预期的结果。在本研究中基于新的化学空间特异性hts的化学基因组学分析应当进一步确定单胺相关途径在以高分辨率调节msc的npas2表达中的作用，这将导致对时间疗法的机制理解。最近研究了单胺转运蛋白在非神经元细胞中的功能。研究了去甲肾上腺素在血管周围脂肪组织(pvat)中的代谢。发现pvat脂肪细胞表达单胺转运蛋白：囊泡单胺转运蛋白(vmat1、vmat2)、质膜单胺转运蛋白(pmat)和去甲肾上腺素转运蛋白(net)。通过vmat、pmat和net的化学抑制剂在体外显著减少了荧光去甲肾上腺素类似物信号的细胞积聚。因此，预计靶向单胺转运蛋白的化合物可能会调节培养基中的单胺浓度，从而影响msc的单胺受体的功能。
[0403]
另外，单胺受体的拮抗剂和激动剂可以直接调节其功能并影响下游信号转导途径。血清素拮抗剂与减少的肝细胞再生有关，并且由血小板和炎症细胞分泌的血清素在皮肤伤口愈合中起重要作用。最近，血清素受体激动剂被证明可加速皮肤伤口愈合。本研究将确定激动剂和拮抗剂对npas2表达的影响。
[0404]
化学基因组学分析应当确定调节npas2表达的特定单胺途径。特别是，预计将获得降低npas2表达的化合物的列表。这些化合物有望增加成骨分化，如通过统计学上更高的alp和体外矿化以及成骨基因的协调时间进程表达评估的。排名靠前的化合物可以达到同等水平的bmp-2衍生的成骨分化。这些具有最低治疗ec/ic指数的命中化合物将在阶段ii项目中被鉴定用于时间疗法开发。
[0405]
潜在的问题和替代的计划。对于hts，建议使用永生化的msc。等位基因组pcr将在5次传代后进行，以确保稳定性。尽管不太可能，但可能会发生基因转移或其他突变。如果需要，将使用来自npas2-lacz小鼠的新一批初级msc。
[0406]
研究2.确定单胺受体和转运蛋白对人msc中npas2表达和成骨分化的调节作用(由ucla实验室执行)
[0407]
基本原理和目标。受结扎诱导的牙周炎影响的牙龈组织显示出npas2表达的进行性增加(图15d)。另外，发现msc表达以前认为对神经元细胞具有特异性的单胺转运蛋白(图18)。人msc的肾上腺素能受体的表达谱已显示出被培养环境敏感地调节。因此，进一步假设单胺受体和/或转运蛋白的表达的环境调节通过npas2表达影响msc的分化能力。本研究的目的是通过单胺相关分子的过度表达来表征人类msc的行为。[1]人类单胺受体和转运蛋白的开放阅读框(orf)表达质粒将在慢病毒载体中制备。[2]人类msc将被转导以过度表达每种单胺受体和转运蛋白。[3]将确定npas2表达和成骨分化。
[0408]
mpi的ucla实验室将执行研究2的所有拟议的项目。必须指出的是，研究1和研究2项目互补地解决了总体目标。
[0409]
实验1(orf表达质粒)。根据化学基因组学分析和文献综述，选择了7个单胺转运蛋白和17个单胺受体用于该项目(表4)。
[0410]
表4.单胺轴分子
[0411]
单胺转运蛋白人类基因vmat1slc18a1vmat2slc18a2emtslc22a3pmatslc29a4netslc6a2datslc6a3sertslc6a4
ꢀꢀ
单胺受体人类基因多巴胺受体d1drd1多巴胺受体d2drd2多巴胺受体d3drd3多巴胺受体d4drd45-ht1a受体htr1a5-ht1b受体htr1b5-ht2a受体htr2a5-ht2b受体htr2b5-ht2c受体htr2c5-ht3a受体htr3a5-ht7受体htr7组胺h1受体hrh1α2a肾上腺素能受体adra2aα2b肾上腺素能受体adra2bα2c肾上腺素能受体adra2cβ1肾上腺素能受体adrb1β2肾上腺素能受体adrb2
[0412]
从人类orf(50)的公共基因组规模慢病毒表达库，已经获得了orf表达载体的列表。使用常规的第3代慢病毒载体生产方案(51,52)，将构建人类单胺相关分子的表达载体。
[0413]
实验2(人类msc过表达单胺相关分子)。人类msc(imsc3，applied biological materials)将被慢病毒载体转导，该慢病毒载体携带抗生素(杀稻瘟菌素)抗性基因。将通过杀稻瘟菌素(5μg/μl：来自杀伤曲线)选择转导的细胞。存活的msc将在生长培养基中扩增，并确认转导基因的过表达。以下实验将使用转导的msc进行。
[0414]
实验3(npas2表达)。将使用rt-pcr(53)检查用每种单胺相关分子转导的msc的npas2的表达。因为npas2是核心昼夜节律基因，因此msc将通过毛喉素(forskolin)(10μm)同步2小时。同步后24小时至72小时，每4小时制备一次rna样品。
[0415]
实验3(成骨分化)。单胺相关分子转导的msc将经受成骨分化。体外成骨分化将通过alp酶活性和茜素红染色来监测以用于体外矿化。成骨分化相关基因的时间进程表达将通过qpcr进行监测。
[0416]
实验4(干细胞标记物表达)。具有npas2 ko突变的msc表现出增加的多能分化，同时保持高水平的干细胞标志物：未分化阶段的nanog和klf4(图20a-20c)。牙起源的msc被认为在牙周组织再生中发挥重要作用。因此，将确定单胺相关分子过表达对干细胞特性的影响。将确定间充质干细胞标记物nanog和klf4的时间进程增殖和表达。
[0417]
作为生物学变量的性别。已经提出了雄性msc和雌性msc之间的内在分子差异。然而，建议使用市售的克隆msc，该克隆msc将在没有来源信息的情况下提供。
[0418]
预期的结果。npas2表达的单胺相关增加预计会降低msc的成骨分化。相比之下，具有降低的npas2表达的msc预期表现类似于npas2 ko msc(图20a-20c)。研究2的主要目标是确定哪些单胺相关分子有效调节(增加或减少)npas2表达。血清素与昼夜节律系统之间的相互作用已经在scn和情绪障碍中报道。已显示多巴胺影响视网膜中npas2的昼夜节律表达。已经表明α-肾上腺素能受体的上调增加msc中的npas2表达。本文的初步数据表明泛单胺转运蛋白参与调节npas2表达(图10)。因此，很有可能鉴定出调节npas2表达的特定单胺相关分子。
[0419]
在本项目中对单胺相关分子的新鉴定应立即提示伤口和慢性炎症中再生能力降低的新分子机制，其中单胺相关分子的环境调节可能起病理作用，潜在地通过npas2的下游上调。因此，将建立所提议的时间疗法的moa。
[0420]
潜在的问题和替代的计划。npas2是核心时钟基因之一。其他时钟基因可能受到单胺相关分子的调节，这应该被表征。
[0421]
细胞培养物中的血清组分包含生理浓度的单胺。然而，它表明，单胺将被补充到培养基中。
[0422]
阶段i的结果将有效地鉴定单胺类化学空间特异性化合物，以抑制npas2，并在体外进行全面表征，并且阐明用于干细胞分化的npas2时间生物学。研究1(abr)和研究2(ucla)项目互补地解决了总体目标。mpi将定期交流他们的进展和结果，以有效地管理提议的项目。
[0423]
阶段ii和商业化计划可能包含：[1]适合于临床应用的候选小分子的最佳药物制剂；[2]对小鼠牙周炎模型中的牙槽骨再生的疗效评价；[3]使用犬科动物牙周炎的临床前疗效和安全性研究；[4]按照iso 10993-1进行fda应用的生物相容性/安全性评估。
[0424]
实例19
[0425]
用于手术疤痕预防的npas2的小分子抑制剂
[0426]
尽管付出了很多努力，但尚未成功地开发出使疤痕形成最小化的有效治疗剂。在全球范围内，每年仅因择期手术和外伤手术就有1亿患者
[0427]
产生疤痕。在40-70％的手术病例中，患者经历由过量胶原的沉积引起的增生性疤痕形成和凸起的疤痕，其中胶原包括致密的胶原纤维组织(“纤维化”)。(图21)。目前用于疤痕预防的标准治疗是持续的皮质类固醇注射、激光疗法、手术切除和/或放射。
[0428]
昼夜节律影响伤口愈合，如图22所示，用于烧伤伤口愈合和皮肤成纤维细胞迁移的体外划痕模型(如hoyle等人，《科学转化医学》2017所述，其通过引用以其整体并入本文)。
[0429]
全基因组的体内微阵列分析发现，npas2在植入了t形钛棒的大鼠股骨中被上调(图23左)并且与野生型(wt)和npas2 /-相比，npas2敲除(ko)(npas2-/-)小鼠在钛植入物
表面上没有形成致密的胶原纤维组织。(图23右)，如mengatto等人，《公共科学图书馆
·
综合》2011；morinaga等人,《生物材料》,2019所述，其每一篇通过引用以其整体并入本文。npas2 ko改善小鼠模型中的伤口愈合，如sasaki等人，《解剖记录》,2019所述，其通过引用以其整体并入本文。
[0430]
体外伤口愈合测定表明，npas2 ko皮肤成纤维细胞在体外模型中改善伤口愈合(图24-25和图3c)。
[0431]
上面的实例2描述了npas2抑制剂高通量筛选，其鉴定了十种下调npas2的化合物(如图13a和26所示)。
[0432]
如本文所述，神经元pas结构域2(npas2)的小分子抑制剂dwn1改善伤口愈合并使疤痕形成最小化。如图27所示，dwn1在体外加速(1)划痕伤口愈合测定中的成纤维细胞迁移和(2)胶原凝胶收缩。
[0433]
与仅缝合线伤口闭合和缝合线加上媒介物(10％dmso)的施用相比，dwn1当被施用于使用缝合线的伤口时改善了裂开伤口愈合，且疤痕形成最小，如图28所示。此外，与仅使用缝合线或缝合线和媒介物(10％dmso)的施用相比，向用缝合线闭合的伤口施用dwn1减少了伤口上或伤口周围的过度胶原沉积，如图29所示。
[0434]
npas2的小分子抑制剂有望加速伤口闭合并减少疤痕形成。npas2 ko不会导致胚胎和发育病理学。因此，npas计时疗法，即施用npas2抑制剂以抑制npas2和调节昼夜节律系统被提议作为治疗剂以减少胶原“纤维化”的形成，并减少伤口的疤痕形成。
[0435]
虽然存在除npas2外的用于时间疗法的目标时钟分子，如bmal1或clock，(图30)，但是npas2已被证明是安全的分子靶：bmal1或clock的ko突变在外周骨组织中产生了各种病理表型和过早衰老症状(肌肉减少症、白内障、器官萎缩)。然而，npas2 ko突变并未导致颌骨、椎骨和附肢骨的胚胎和发育病理学。scn中npas2表达的水平较低，并且对中枢昼夜节律具有很小的贡献。
[0436]
利血平阻断主要在神经内分泌细胞和神经元中表达的囊泡单胺转运蛋白(vmat)。(图31)通过利血平对神经元vmat的阻断抑制了单胺神经递质：去甲肾上腺素、多巴胺、血清素和组胺在神经元的突触囊泡中的摄取并减少其储存。单胺氧化酶a(maoa)启动子的转录通过时钟组分bmal1、npas2和per2来调节。小鼠中per2的突变导致maoa的活性降低。
[0437]
存在与vmat相似的神经元外单胺转运蛋白(emt)，并在各种细胞如软骨细胞和平滑肌细胞中表达(图30和32a)。与媒介物相比，当体外施用血清素时，划痕区的宽度被减小(图32b)，如sadiq等人,《国际分子科学杂志》2028所示，其通过引用以其整体并入本文。据推测，利血平阻断成纤维细胞中的emt，导致细胞外血清素积累，这加速成纤维细胞迁移。(图32a)。
[0438]
实例20
[0439]
手术疤痕愈合/预防的小鼠模型
[0440]
用双刃手术刀在小鼠的背部的左右两侧制作垂直伤口(10x 1.5mm)。用5-0尼龙缝合线在伤口的中心进行一次结扎。(图33a)术后每天使用伤口/疤痕的大体图像对视觉模拟评分(vas)进行评分，直至术后第7天(图33a)，并且使用尺子来测量伤口/疤痕的术后大体图像。(图33c)术后第7天使用苏木精-伊红(he)和masson三色(mt)对伤口进行组织学检查。(图33d)使用he染色的切片来评估疤痕指数。(图33e)使用mt染色的切片来评估纤维组织的
面积％。(图33f)
[0441]
选择了候选化合物dwn1，并且在体外评估了对真皮成纤维细胞的npas2-抑制。在ucla的mssr中，使用fda批准的化合物库制作了体外高通量药物筛选测定的散点图。(图34a)。阴性npas2 z评分的高绝对值表明npas2表达被高度下调(x轴)。高细胞活力z评分表明成纤维细胞具有高活力(y轴)。候选化合物(dwn1)是按照npas2 z评分的阴性产物的高绝对值和最高生存力的顺序选择的。评估了用dwn1(1μm或10μm)处理的鼠真皮成纤维细胞中的昼夜节律npas2表达，并与对照组进行比较。(图34b)对用dwn1处理的鼠真皮成纤维细胞的细胞迁移进行评估*p《0.05。(图34c)
[0442]
研究了两种不同浓度的dwn1(1μm或10μm)对体外鼠真皮成纤维细胞中的胶原合成的影响。将鼠真皮成纤维细胞接种到24孔板中，并且在补充有抗坏血酸(50μg/ml)的培养基中以80％
–
90％的汇合度培养1、3和7天。然后用10％中性缓冲福尔马林固定细胞并用天狼猩红(polyscience,伊利诺伊州奈尔斯)染色以使胶原可视化。aa：l-抗坏血酸。od：光密度。ctrl：用不含aa的对照培养基处理的细胞。与对照和50μg的aa相比，用抗坏血酸补充培养的成纤维细胞的天狼猩红染色显示出阳性反应的增加，表明在1μm或10μm dwn1处理后第7天，在成纤维细胞中的胶原纤维形成和积累。(图35a)在分光光度计中用读板器(syhnergy h1读板器)在550nm处读取吸收值，并且通过单向anova与事后holm测试进行比较。
[0443]
在1μm或10μm的dwn1处理或对照(媒介物)处理后，在肉芽组织和受伤的组织上评估col1a1、col1a2、col3a1和col14a1型胶原的基因表达。(图35b)gapdh用作内部对照。在施加有媒介物或媒介物 dwn1的伤口的术后第7天进行体内αsma的免疫组织化学染色。术后每24小时施加媒介物或dwn1 媒介物，并且在各自的治疗后的第3天和第7天进行评估。
[0444]
评估了dwn1对鼠背侧线性伤口/疤痕模型的影响。手术后第0天(d0)、第2天(d2)、第5天(d5)、第7天(d7)的大体图像，并且开始将dwn1局部应用于伤口。veh：媒介物。术后每24小时使用媒介物或dwn1 媒介物。(图36a)评估了施加有媒介物或媒介物 dwn1的伤口的视觉模拟评分(vsa)量表。(图36b)术后第7天施加有媒介物或媒介物 dwn1的侧向伤口/疤痕的组织学图像。(图36c)黄色虚线表示肉芽组织。左侧两个用he染色，并且右侧两个用mt染色。比例尺为1000μm。使用he染色的切片来评估疤痕指数。(图36d)使用mt染色的切片来评估纤维组织的面积％。*示出了p《0.05。(图36e)
[0445]
评估了dwn1对鼠背部线性伤口/疤痕模型的分子生物学效应。拍摄了典型的激光捕获后显微解剖(lcm)图像。(图37a)载玻片在lcm之前用苏木精和伊红短暂染色。g：肉芽组织，w：受伤的组织。评估了col1a1、col1a2、col3a1)、col14a1、tgfβ1和acta2在肉芽组织(g)和受伤的组织(w)上的基因表达。(图37b)gapdh用作内部对照。*示出了p《0.05。对施加有媒介物或媒介物 dwn1的伤口在术后第7天进行体内αsma的免疫组织化学染色。(图37c)黄色虚线表示肉芽组织。比例尺是100μm。
[0446]
本文中所引用的所有专利、专利申请案和科学出版物均以全文引用的方式并入本文中。
[0447]
虽然本文已经说明并描述了本发明的某些特征，但本领域的普通技术人员现在将想到许多修改、取代、变化和等效物。因此，应当理解，所附权利要求旨在覆盖如落入本发明的真实精神内的所有此类修改和改变。