一种用于检测新冠病毒的试剂盒及检测方法

1.本发明涉及生物检测领域，具体讲，涉及一种用于检测新冠病毒的试剂盒及检测方法。


背景技术：

2.新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，sars-cov-2)造成了全球范围内的疫情大传播，其强传染性和高致死率给全球疫情防控工作提出了巨大挑战，为有效控制疫情发展，开发准确高效的检测方法尤为重要。目前的检测方法包括病原学检测、分子生物学检测和免疫学检测。
3.病原学检测是指利用病毒分离培养方法或电镜观察等技术，直接对病原体本身进行的检测，能够在疾病爆发早期为确定病原体提供直接证据，是诊断病毒感染的传统方法之一。但与其他检测方法相比，病原学检测技术需要的实验环境苛刻、操作繁琐、耗时较长，无法满足疫情大规模暴发下的病毒检测需求。
4.免疫学检测法是针对血液中的病毒特异性抗原或抗体进行的检测，《新型冠状病毒肺炎诊疗方案(试行第八版)》将新冠病毒特异性抗体检测与核酸检测、病毒基因测序共同作为确诊证据。相较于核酸检测，免疫学检测不仅样本采集容易、检测操作简单、容易实现高通量，还能检测患者体内特异性抗体的变化情况，发现产生免疫力的人群，对疾病防治以及疫苗研发具有重要意义。目前免疫学检测方法主要包括侧流免疫层析技术、酶联免疫检测法(elisa)、化学发光免疫分析法等。侧流免疫层析技术结合了色谱分析和免疫反应原理，以胶体金、碳纳米颗粒等作为免疫标记的探针，对样本中的新冠病毒抗原蛋白进行快速检测。elisa是抗原抗体反应与酶科学相互结合的一种常见的免疫分析方法，利用抗原与抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测。化学发光免疫分析是一种新型的免疫分析技术，兼具免疫反应的特异性及化学发光分析的灵敏性。免疫学检测方法检测耗时短、准确性高、操作简便，但由于人体的免疫反应只有在肌体感染1周后才产生可被检测的抗体，因此免疫学检测存在检测窗口期，主要作为辅助诊断的手段。
5.分子生物学检测是针对新冠病毒感染机体后所复制产生的病毒rna进行检测，不同于免疫系统产生的igm、igg抗体，复制产生的病毒rna能更早被检测出来，因此当前新冠病毒最主要的诊断方法是病毒核酸检测，主要包括全基因组测序、实时荧光定量pcr(rt-pcr)、crispr、逆转录环介导等温扩增技术(rt-lamp)等，其中实时荧光定量pcr方法(rt-pcr)仍是检测新型冠状病毒的金标准。全基因组测序技术能够全面反映病原体的遗传信息，具有高度的准确性和敏感性，但该技术仪器设备昂贵、测序数据解读门槛高，难以应用于大规模临床检测。rt-pcr诊断耗时短、检测样本多、结果判定简便、检测成本低，是目前新冠病毒检测最常用的手段，但是该方法需要专业的实验室和操作人员，实验室条件不足或操作不当都可能会因气溶胶污染而造成假阳性。rt-lamp能够在等温条件下特异、高效、快速的扩增核酸模板，虽然该方法的引物设计较为复杂，但其检测结果灵敏度高，可视化能够实现检测结果的直观判断，具有十分广阔的发展潜力。
6.此外，新冠病毒是一种单股正链rna病毒，其基因组再复制过程中通过多种机制而发生变异，从而导致致病性高、更易传播的变异株产生，世界卫生组织(worldhealthorganization,who)根据这些变异株的传播力、致病力等不同将其分为voc和“关注变异株(variantofinterest,voi)”。与早期参考株相比，voi满足病毒表型发生变化，或氨基酸变异引起或潜在引起病毒表型发生变化。目前已有5种voi变异株被报道，其中delta新冠病毒变异株以已传播至全球96个国家/地区，具有传播力强、感染潜伏期段、致病性强、发病进程快等特点，逐渐取代其他voc成为危害最强的全球流行株。
7.针对新冠病毒变异性强的特点，开发能够检测多种变异型的新冠病毒检测方法是十分必要的。目前核酸检测方法主要是靶向新冠病毒的开放读码框ofr1区域和核壳蛋白区域设计引物和探针，不断突变的病毒可能会导致核酸检测失效。最近的一项研究通过对比31421株新冠病毒的基因组样本发现，新冠病毒的orf7b区具有最低的突变率，因此更适合作为靶点进行新冠病毒检测试剂的研发。
8.微流控芯片(microfluidics chip)技术是一项把生物、化学、医学分析过程的样品制备、反应、分离、检测等基本操作单元集成到一块微米尺度的芯片上，自动完成分析全过程的新型技术。针对复杂食品基质中病毒检测智能化程度低、检测分析目标物单一或较少的问题，采用微流控芯片方法，优化芯片制作和加工工艺，研制开发核酸提取-等温扩增-杂交集成系统，研究芯片与外围在线检测器和读数装置识别匹配技术，实现对病毒基因的快速高精度高灵敏度即时诊断(point-of-care testing,poct)，达到病毒检测流程的自动化和检测结果的信息化。微流控芯片检测具有集成化、自动化等特点，可同时对多个样本、多个靶标进行检测，实现高效、灵敏、准确、自动化的特点。检测系统小巧轻便，易于携带。并且芯片盘上各个通道之间完全隔离，可以有效避免交叉污染。
9.鉴于此，特提出本发明。


技术实现要素：

10.本发明的首要发明目的在于提供一种用于检测新冠病毒的试剂盒。
11.本发明的第二发明目的在于提供用于检测新冠病毒的方法。
12.为了完成本发明的发明目的，采用的技术方案为：
13.本发明提出一种用于检测新冠病毒的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有核酸扩增试剂，所述核酸扩增试剂中含有如seq id no:1～seq id no:4所示核苷酸序列的等温扩增引物；或，所述核酸扩增试剂中含有如seq id no:9～seq id no:12所示核苷酸序列的等温扩增引物。
14.可选的，seq id no:1、seq id no:2的浓度为0.1μm～0.4μm，优选为0.1μm；seq id no:3和seq id no:4的浓度为1.0μm～1.6μm，优选为1.2μm；
15.seq id no:9、seq id no:10的浓度为0.1μm～0.4μm，优选为0.1μm；seq id no:11和seq id no:12的浓度为1.0μm～1.6μm，优选为1.2μm。
16.可选的，所述试剂盒中还含有阴性对照品和阳性对照品，所述阳性对照品为新冠病毒orf7假病毒质粒，所述阴性对照品为去离子水。
17.可选的，所述试剂盒中还含有微流控芯片。
18.可选的，用于所述试剂盒的样品为待检测鼻拭子或咽拭子的提取物经过rna提取
试剂盒获得的核酸样本。
19.可选的，所述核酸扩增试剂中还含有荧光染料和包括逆转酶的核酸扩增酶热启动多目的等温扩增酶；
20.优选的，荧光染料的含量为50μl；
21.更优选的，包括逆转酶的核酸扩增酶热启动多目的等温扩增酶的含量为1.25ml。
22.可选的，所述试剂盒的等温扩增的温度为63℃～67℃，优选65℃；所述试剂盒的等温扩增的时间为40～80分钟，优选60分钟。
23.本发明还提出一种采上述的试剂盒检测新冠病毒的方法，通过等温扩增进行检测，所述等温扩增的温度为63℃～67℃，优选65℃；所述等温扩增的时间为40～80分钟，优选60分钟。
24.可选的，所述等温扩增的反应体系为：
25.包括逆转酶的核酸扩增酶热启动多目的等温扩增酶12.5μl；
26.模板2μl；
27.荧光染料0.5μl；
28.浓度为0.1μm的seq id no:1和seq id no:2各0.01μl或浓度为0.1μm的seq id no:9和seq id no:10各0.01μl；浓度为1.2μm的seq id no:3和seq id no:4各0.12μl或浓度为0.12μm的seq id no:11和seq id no:12各0.01μl；
29.去离子水补至20μl。
30.本发明至少具有以下有益的效果：
31.本发明提出一种能够快速实时现场检测的新冠病毒检测试剂。可提高检测效率，大大降低检测难度，为新冠病毒的防控提供有效的技术手段。
32.本发明的试剂盒可检测到最低10拷贝/μl的基因片段。
附图说明
33.图1为lamp等温扩增引物筛选实验结果图；
34.图2为lamp等温扩增反应温度优化的实验结果图；
35.图3为lamp等温扩增反应引物浓度优化的实验结果图；
36.图4为本发明实施例采用的微流控芯片的结构示意图；
37.图5为本发明实施例采用微流控芯片检测的实验结果；
38.图6为本发明实施例采用的微流控芯片检测最低检出量的实验结果。
具体实施方式
39.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
40.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
41.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
42.本发明实施例提出一种用于检测新冠病毒的试剂盒，含有核酸扩增试剂，核酸扩增试剂中含有如seq id no:1～seq id no:4所示核苷酸序列的等温扩增引物；或，核酸扩增试剂中含有如seq id no:9～seq id no:12所示核苷酸序列的等温扩增引物。本发明实施例通过大量筛选实验，获得上述等温扩增引物，具有扩增效率高、扩增特异性好、扩增所需循环数小等技术优势。
43.具体的，引物的序列如表1所示。
44.表1
[0045][0046][0047]
在本发明实施例中，引物的浓度对于lamp的扩增结果具有重要作用，过低的引物浓度无法有效扩增目的片段，而过高的引物浓度则会抑制产物的扩增，适当的引物浓度可以有效的提高扩增效率同时减少非特异性的扩增，因此对引物的用量进行了系统优化。具体为：seq id no:1、seq id no:2的浓度为0.1μm～0.4μm，优选为0.1μm～0.2μm，更优选0.1μm；seq id no:3和seq id no:4的浓度为1.0μm～1.6μm，优选为1.2μm～1.4μm，更优选为1.2μm。seq id no:9、seq id no:10的浓度为0.1μm～0.4μm，优选为0.1μm～0.2μm，更优选为0.1μm；seq id no:11和seq id no:12的浓度为1.0μm～1.6μm，优选为1.2μm～1.4μm，更优选为1.2μm。通过对引物浓度的进一步控制，可以获得最佳扩增效率，提高检测灵敏度，降低检测时间。
[0048]
在本发明实施例的试剂盒中还含有阴性对照品和阳性对照品，阳性对照品为新冠病毒orf7区假病毒质粒，例如将orf7区序列克隆到pcmv载体中的阳性质粒pcmv-orf7，阴性对照品为去离子水。
[0049]
在本发明实施例的试剂盒中还含有微流控芯片。微流控芯片检测具有集成化、自动化等特点，可同时对多个样本进行检测，实现高效、灵敏、准确、自动化的特点。
[0050]
在本发明实施例的试剂盒中，样品为鼻拭子或咽拭子的提取物，提取处理方式为用病毒核酸提取试剂盒提取核酸。
[0051]
在本发明实施例的试剂盒中，核酸扩增试剂中还含有荧光染料和核酸扩增酶(warmstart multi-purpose rt-lamp 2x master mix(with udg))；
[0052]
优选的，荧光染料的含量为50μl，可以进行100次反应。
[0053]
核酸扩增酶warmstart multi-purpose rt-lamp 2x master mix(with udg)的含
量为1.25ml。
[0054]
在本发明实施例的试剂盒中，试剂盒的等温扩增的温度为63℃～67℃，优选65℃；试剂盒的等温扩增的时间为40～80分钟，优选60分钟。
[0055]
本发明实施例还涉及一种采用上述的试剂盒检测新冠病毒的方法，通过等温扩增进行检测，等温扩增的温度为63℃～67℃，优选65℃；等温扩增的时间为40～80分钟，优选60分钟。
[0056]
等温扩增的反应体系为：
[0057]
核酸扩增酶warmstart multi-purpose rt-lamp 2x master mix(with udg)12.5μl；
[0058]
模板2μl；
[0059]
荧光染料0.5μl；
[0060]
浓度为0.1μm的seq id no:1和seq id no:2各0.01μl或浓度为0.1μm的seq id no:9和seq id no:10各0.01μl；浓度为1.2μm的seq id no:3和seq id no:4各0.12μl或浓度为0.12μm的seq id no:11和seq id no:12各0.01μl；
[0061]
去离子水补至20μl。
[0062]
下面对具体实施例方式进行进一步的解释和说明：
[0063]
实验材料和仪器的来源：
[0064]
实验仪器：ma2000plus微流控等温扩增核酸分析仪、8通道微流控芯片盘，购自上海速芯生物；
[0065]
实验材料：核酸扩增酶warmstart multi-purpose rt-lamp 2
×
master mix(with udg)、fluorescent dye(50
×
)购自neb(new england biolabs)，pcmv-orf7质粒购自中科迪生(天津)科技发展有限公司，包含预先包埋引物混合液的32通道微流控芯片盘购自上海速芯生物。其他试剂均为市售。
[0066]
实施例1
[0067]
用于检测新冠病毒的试剂盒，其组成如表2所示：
[0068]
表2
[0069][0070]
该试剂盒的使用方法为：
[0071]
1、样品处理：
[0072]
取2μl鼻拭子或咽拭子的核酸提取物与12.5μl核酸扩增酶、0.5μl荧光染料试剂混合，混匀后添加到微流控芯片加样区。同时取2μl阳性对照和阴性对照试剂与核酸扩增试剂及荧光染料混合，混匀后添加到芯片盘加样区，用封口膜对芯片盘进行封装，用刮板处理去
除气泡。
[0073]
2、检测：
[0074]
将封装好的芯片盘固定到微流控等温扩增核算分析仪上，设置反应程序为65℃、60分钟，按照样品添加顺序设置检测孔、阳性对照孔和阴性对照孔。设置完成后点击开始反应菜单进行检测，检测结束后进行分析。阳性对照孔有扩增、阴性对照孔没有扩增则检测结果有效。
[0075]
实验例1：引物筛选试验
[0076]
按照新冠病毒上突变率最低的orf7b区域设计等温扩增引物，设计引物如表3所示：
[0077]
表3
[0078][0079][0080]
使用普通taq酶对引物进行测试，反应体系如表4所示：
[0081]
表4
[0082]
成分体积(μl)takara ex taq(5u/μl)0.210
×
ex taq buffer(20mm mg
2
plus)2dntp(2.5mm each)1.6模板1引物1(10μm)1引物2(10μm)1h2o13.2
[0083]
反应程序：98℃10s，60℃15s，72℃40s，40cycle，72℃5min，4℃∞。其中，引物1和引物2代表一对上下游引物，包括每一对f3和b3引物或者fip和bip引物。
[0084]
得到的实验结果如图1所示。由图1可知，orf7-1和orf7-3引物组合能够克隆出清晰的lamp扩增条带，用于进行后续条件优化实验。
[0085]
实验例2：
[0086]
等温扩增实验温度条件的筛选
[0087]
设置4个梯度：60℃、63℃、65℃、67℃。根据实验例1所确定引物组合以及lamp反应体系配制反应液进行扩增，lamp等温扩增反应体系如表5所示，反应时间为60min。
[0088]
表5：lamp等温扩增反应体系
[0089]
成分体积warmstart multi-purpose rt-lamp 2x master mix(with udg)12.5μlfluorescent dye(50
×
)0.5μl模板2μlseq id no:3(40μm)0.8μlseq id no:4(40μm)0.8μlseq id no:1(10μm)0.4μlseq id no:2(10μm)0.4μl补h2o至20μl
[0090]
使用琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行鉴定，得到扩增结果如图2所示。由图2的琼脂糖凝胶电泳结果显示，65℃反应比较理想。
[0091]
实验例3：等温扩增实验引物浓度的筛选。
[0092]
设置4个引物浓度梯度，使其在反应体系中的终浓度依次为：seq id no:3、seq id no:4的浓度依次为1.0μm、1.2μm、1.4μm、1.6μm；seq id no:1、seq id no:2的浓度依次为0.1μm、0.2μm、0.3μm、0.4μm，反应温度65℃，时间60min，并配制成相应的反应液进行lamp扩增，扩增体系同表4。使用琼脂糖凝胶电泳对产物进行鉴定，得到实验结果如图3所示。
[0093]
如图3所示的扩增结果可知，琼脂糖结果显示seq id no:3、seq id no:4为1.2μm；seq id no:1、seq id no:2为0.1μm结果较理想。
[0094]
对seq id no:9～seq id no:12进行相同的筛选实验，seq id no:11、seq id no:12为1.2μm；seq id no:9、seq id no:10为0.1μm结果较理想。
[0095]
实验例4：
[0096]
将反应体系在微流控芯片上实现。芯片如图4所示，在a1和a2孔加入1μl预混的引物，包含终浓度为seq id no:3、seq id no:4为1.2μm、seq id no:1、seq id no:2为0.1μm。
[0097]
将引物包埋在反应区对芯片进行封装，a3、a4孔加入1μl去离子水。之后将阳性质粒和反应体系混合后添加到加样区，通过对标准质粒和阴性样本进行检测，得到实验结果如图5所示。
[0098]
由图5可知，标准质粒产生了阳性扩增，去离子水没有产生阳性扩增，说明新冠病毒orf7区等温扩增检测方法建立成功。
[0099]
实验例5：
[0100]
对ofr7区的标准质粒进行梯度稀释，用本发明所设计的基于微流控芯片的等温扩增检测方法进行检测。将阳性质粒分别稀释到终浓度107、106、105、104、103、102、101、100拷贝/l，与反应试剂混合后，添加到预先包埋有lamp检测引物的芯片盘上的a-g反应孔进行等温扩增反应，65℃反应60min后观察结果。
[0101]
实验结果如图6所示，确定可检测到最低10拷贝数/l的基因片段。
[0102]
本技术虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本技术构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本技术的保护范围应当以本技术权利要求所界定的范围为准。