一种具有多种生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制备方法与流程

1.本发明属于食品开发技术领域，具体涉及一种具有多种生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制备方法。


背景技术：

2.活性肽是介于氨基酸与蛋白质之间的分子聚合物，它小至由两个氨基酸组成，大至由数百个氨基酸通过肽键连接而成，具有十分重要的生物学意义。主要体现在其吸收机制优于氨基酸和具有氨基酸不可比拟的生理功能两个方面，其生理功能主要有类吗啡样活性、激素和调节激素的作用，对生物体内的酶具有调节和抑制功能，改善和提高矿物质运输和吸收，抗菌和病毒，提高免疫力，抗氧化，清除自由基抗衰老以及抗高血压和高血脂等。
3.肽是蛋白质与氨基酸的中间物质，由数个氨基酸结合而成。分子大小介于蛋白质与氨基酸之间。比氨基酸分子大的肽在人体内被吸收的速度反而比氨基酸更快，原因就在于：寡聚肽是数个氨基酸分子集中起来被整体吸收，而氨基酸需要一个一个地被吸收，寡聚肽能比氨基酸更迅速地被人体吸收。
4.大豆多肽指大豆蛋白质经蛋白酶作用，再经特殊处理后得到的蛋白质分解物。大豆多肽本身由许多分子链长度不等的低分子小肽混合组成。通常由3～6个氦基酸组成相对分子量低于1000的低肽混合物，肽类相对分子量主要在300da～700da范围内。分子量段在50～2000之间的称为小肽、寡肽、低聚肽，一般普遍认为分子量在1000的小分子肽最好，这个分子量的大豆肽即能保证很好地被人体吸收，又可以保证肽的功能性与活性。研究发现大豆蛋白的酶解产物具有许多生理功能，如在人体内大豆多肽比大豆蛋白更易被消化吸收，抗原性较低；具有促进人体内脂肪代谢，肌红细胞的复原，降胆固醇的功能，抑制血压升高，增强免疫功能和抗自由基损伤(延缓衰老)。
5.大豆活性多肽的多种营养特性、生理活性以及保健功能，使得其具有广阔的开发空间和市场潜力。但国内大豆活性多肽应用仍处于初级开发应用阶段，蛋白质酶解机理与过程控制缺乏系统深入研究，水解度与酶解产物特性关系尚未明确，使得水解工艺控制缺乏一定理论指导，分离纯化过程工艺还不成熟，有待于找到一种较合适的分离方法来提纯大豆多肽。
6.目前主要通过酶解技术可以获得大豆活性肽，但酶解后的大豆肽的转化率不仅低，且分子量小于1000da的占比少，使大豆活性肽难以实现工业化利用，同时提高了大豆活性肽的生产成本。因此为了使大豆活性肽更好的应用到实际生产中，需要开发一种具有多种生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制备方法。


技术实现要素：

7.针对现有技术的上述问题，本发明提供了一种具有多种生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制备方法。本发明使用超声波处理湿法磷酸化的大豆分离蛋白，通过把糖苷类化合物缀合在蛋白酶上提高蛋白酶的酶活及稳定性；在行星球磨机的运作下，增加大豆分离蛋
白与蛋白酶的碰撞与接触的机会，加速酶促反应进程，提高大豆寡聚肽的得率。
8.本发明为了实现上述目的采用的技术方案是：
9.一种具有多种生物活性的大豆寡聚活性肽粉的制备方法，包括以下步骤：
10.(1)超声波处理湿法磷酸化的大豆分离蛋白：按照1：5-15的重量比例将大豆分离蛋白添加进ph为7-10的磷酸钠缓冲溶液中制备得到湿法磷酸水溶液，然后用超声波处理器处理湿法磷酸水溶液，得到湿法磷酸化的大豆分离蛋白溶液；
11.(2)蛋白酶改性处理：将糖苷类化合物分别与中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶通过湿热美拉德反应改性，制备得到糖苷类化合物-蛋白酶缀合物，具体方法为：糖苷类化合物分别与四种蛋白酶按重量比1：10-40混合，混合物在室温下磁力搅拌10-60min，然后在30-60℃的水浴中磁力搅拌12-48h；
12.(3)大豆分离蛋白的酶解：将步骤(2)制得的四种糖苷类复合物-蛋白酶缀合物依次加入步骤(1)制得的大豆分离蛋白溶液中，然后放入立式生产行星式球磨机的球磨罐中进行酶解，制得酶解液；
13.(4)大豆寡聚活性肽粉的分离：将步骤(3)得到的酶解液首先经过陶瓷膜进行初级过滤，然后把经过初级过滤的清液利用超滤膜进行超滤分级，最后把超滤分级得到的清液利用纳滤设备进行纳滤浓缩，得到的浓缩液即为大豆寡聚活性肽浓缩液；
14.(5)喷雾干燥制备大豆寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(4)制备的大豆寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，经过喷雾干燥后可得大豆寡聚活性肽粉。
15.优选的，步骤(1)中所述的超声波处理器超声功率100-1200w，脉冲持续时间：1-10秒开启，1-10秒关闭，超声时间为10-40min，超声处理过程的温度控制在25-70℃。
16.优选的，步骤(2)中所述的糖苷类化合物为葡萄糖乙酸酯、葡萄糖丁酸酯、葡萄糖丙酸酯的至少一种。
17.优选的，步骤(3)中所述的酶解反应条件为：ph为6-11，温度为35-60℃，每种酶的添加量为0.01-0.5％，酶解时间为1-6h。
18.优选的，步骤(3)中所述的立式生产行星式球磨机以100-800转/分的恒定研磨速度旋转，球磨机旋转方向每1-10min改变一次。
19.优选的，步骤(4)中所述的陶瓷膜的孔径为小于0.2μm，超滤膜的可通过的分子量为不大于1000da,，纳滤膜的可通过的分子量为不大于150da，大豆寡聚活性肽粉浓缩液的固含物含量大于等于10％。
20.优选的，步骤(5)中所述的喷雾干燥条件为：干燥温度120-200℃，喷雾压力1-8mpa。
21.优选的，步骤(1)中所述的超声波处理器为dy-1200c，20khz，最大功率为1200w，生产厂家为中国上海德阳亿邦仪器有限公司。
22.优选的，步骤(3)中所述的立式生产行星式球磨机为净信高能行星式球磨机jx-2/4/5g。
23.本发明有益的技术效果在于：
24.(1)本发明使用超声处理湿法磷酸化的大豆分离蛋白，超声处理导致蛋白的二级结构改变从而诱导三级结构的改变，进而对蛋白的功能特性造成影响。超声处理后，湿法磷酸中的大豆分离蛋白聚集体尺寸减小，且蛋白的发泡性、乳化性和抗氧化性能均有所提高。
在酶解处理前对大豆分离蛋白进行超声处理，不仅可以提高蛋白的溶解度，还可以使大豆分离蛋白的空间结构舒展开，为蛋白酶酶解提供更多的底物结合位点，可以使下一步酶解进行的更加彻底。
25.(2)本发明采用使用的葡萄糖乙酸酯、葡萄糖丁酸酯、葡萄糖丙酸酯类化合物通过湿热美拉德反应缀合在蛋白酶上，使蛋白酶的结构发生改变，提高蛋白酶的酶活及稳定性，从而改变蛋白酶的酶促反应进程。本方法具有使大豆分离蛋白被酶解的更加彻底，大豆寡聚肽的得率高的显著优点。
26.(3)本发明使用的行星球磨机能用干、湿两种方法粉碎并混和粒度不同、材料各异的产品，效率高、效能大、研磨产品最小粒度可至0.1微米(即1.0
×
10-4
mm)甚至纳米级。酶解反应在行星球磨机中进行可以使大豆分离蛋白在酶解的过程中剪切成更小的粒度，不仅可以增加大豆分离蛋白的溶解，还可以使酶促反应进程进行的更加彻底，而且在行星球磨机的运作下，可以增加大豆分离蛋白与蛋白酶的碰撞与接触的机会，极大的加速了酶促反应进程。可以大大降低实际生产过程酶解所消耗的时间与生产成本。
具体实施方式
27.下面结合实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
28.实施例1：
29.(1)超声波处理湿法磷酸化的大豆分离蛋白：按照1：5比例将大豆分离蛋白添加进ph为7为磷酸钠缓冲溶液中制备得到湿法磷酸水溶液，然后用超声波处理器处理湿法磷酸水溶液，得到湿法磷酸化的大豆分离蛋白溶液，具体方法为：超声波处理器超声功率100w，脉冲持续时间：1秒开启，1秒关闭，超声时间为10min，超声处理过程的温度控制在70℃。
30.(2)蛋白酶改性处理：葡萄糖乙酸酯(包括各个位点的单乙酸酯以及各个位点组合的二乙酸酯)分别与中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶通过湿热美拉德反应改性，具体方法为：将葡萄糖乙酸酯分别与四种蛋白酶按重量比1：10混合，混合物在室温下磁力搅拌10min，然后在60℃的水浴中磁力搅拌12h。
31.(3)大豆分离蛋白的酶解：将步骤(2)制得的四种葡萄糖乙酸酯-蛋白酶缀合物依次加入步骤(1)制得的大豆分离蛋白溶液中，然后放入立式生产行星式球磨机的球磨罐中进行酶解，立式生产行星式球磨机以100转/分的恒定研磨速度旋转，球磨机旋转方向每1min改变一次，得到酶解液。酶解反应条件为：ph为6，温度为60℃，每种酶的添加量为0.01％，酶解时间为1h。
32.(4)大豆寡聚活性肽粉的分离：将(3)步骤得到的酶解液首先经过孔径小于0.2μm的陶瓷膜进行初级过滤，然后把经过初级过滤的清液利用可通过分子量不大于1000da的超滤膜进行超滤分级，最后把超滤分级得到的清液利用可通过分子量不大于150da纳滤设备进行纳滤浓缩，得到的浓缩液即为大豆寡聚活性肽浓缩液。得到的大豆寡聚活性肽浓缩液固含物含量大于等于10％。
33.(5)喷雾干燥制备大豆寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(4)制备的大豆寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，经过喷雾干燥后可得大豆寡聚活性肽粉，干燥温度为120
℃，喷雾压力为8mpa。
34.实施例2
35.(1)超声波处理湿法磷酸化的大豆分离蛋白：按照1：10比例将大豆分离蛋白添加进ph 8为磷酸钠缓冲溶液中制备得到湿法磷酸水溶液，然后用超声波处理器处理湿法磷酸水溶液，得到湿法磷酸化的大豆分离蛋白溶液，具体方法为：超声波处理器超声功率800w，脉冲持续时间：5秒开启，5秒关闭，超声时间为25min，超声处理过程的温度控制在45℃。
36.(2)蛋白酶改性处理：葡萄糖丁酸酯(包括各个位点的单丁酸酯以及各个位点组合的二丁酸酯)分别与中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶通过湿热美拉德反应改性，具体方法为：将葡萄糖丁酸酯分别与四种蛋白酶按重量比1：25，混合物在室温下磁力搅拌30min，然后45℃的水浴中磁力搅拌24h。
37.(3)大豆分离蛋白的酶解：将步骤(2)制得的四种葡萄糖丁酸酯-蛋白酶缀合物依次加入步骤(1)制得的大豆分离蛋白溶液中，然后放入立式生产行星式球磨机的球磨罐中进行酶解，立式生产行星式球磨机以500转/分的恒定研磨速度旋转，球磨机旋转方向每5min改变一次，得到酶解液。酶解反应条件为：ph为8，温度为45℃，每种酶的添加量为0.2％，酶解时间为3h。
38.(4)大豆寡聚活性肽粉的分离：将(3)步骤得到的酶解液首先经过孔径小于0.2μm的陶瓷膜进行初级过滤，然后把经过初级过滤的清液利用可通过分子量不大于1000da的超滤膜进行超滤分级，最后把超滤分级得到的清液利用可通过分子量不大于150da纳滤设备进行纳滤浓缩，得到的浓缩液即为大豆寡聚活性肽浓缩液。得到的大豆寡聚活性肽浓缩液固含物含量大于等于10％。
39.(5)喷雾干燥制备大豆寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(4)制备的大豆寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，经过喷雾干燥后可得大豆寡聚活性肽粉，干燥温度为180℃，喷雾压力为5mpa。
40.实施例3
41.(1)超声波处理湿法磷酸化的大豆分离蛋白：按照1：15比例将大豆分离蛋白添加进ph10为磷酸钠缓冲溶液中制备得到湿法磷酸水溶液，然后用超声波处理器处理湿法磷酸水溶液，得到湿法磷酸化的大豆分离蛋白溶液，具体方法为：超声波处理器超声功率1200w，脉冲持续时间：10秒开启，10秒关闭，超声时间为40min，超声处理过程的温度控制在25℃。
42.(2)蛋白酶改性处理：葡萄糖丙酸酯(包括各个位点的单丙酸酯以及各个位点组合的二丙酸酯)分别与中性蛋白酶、胰蛋白酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶通过湿热美拉德反应改性，具体方法为：将葡萄糖丙酸酯分别与四种蛋白酶按重量比1：40混合，混合物在室温下磁力搅拌60min，然后在30℃的水浴中磁力搅拌48h。
43.(3)大豆分离蛋白的酶解：将步骤(2)制得的四种葡萄糖丙酸酯-蛋白酶缀合物依次加入步骤(1)制得的大豆分离蛋白溶液中，然后放入立式生产行星式球磨机的球磨罐中进行酶解，立式生产行星式球磨机以800转/分的恒定研磨速度旋转，球磨机旋转方向每10min改变一次，得到酶解液。酶解反应条件为：ph为11，温度为35℃，每种酶的添加量为0.5％，酶解时间为6h。
44.(4)大豆寡聚活性肽粉的分离：将(3)步骤得到的酶解液首先经过孔径小于0.2μm的陶瓷膜进行初级过滤，然后把经过初级过滤的清液利用可通过分子量不大于1000da的超
滤膜进行超滤分级，最后把超滤分级得到的清液利用可通过分子量不大于150da纳滤设备进行纳滤浓缩，得到的浓缩液即为大豆寡聚活性肽浓缩液。得到的大豆寡聚活性肽浓缩液固含物含量大于等于10％。
45.(5)喷雾干燥制备大豆寡聚活性肽粉末：使用喷雾干燥机对步骤(4)制备的大豆寡聚活性肽浓缩液进行喷雾干燥，经过喷雾干燥后可得大豆寡聚活性肽粉，干燥温度为200℃，喷雾压力为1mpa。
46.测试例：
47.测定了实施例制备的大豆寡聚活性肽的小分子肽含量、抗原活性剩余率、dpph自由基消除率、abts自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、抑制脂过氧化自由基清除率。
48.具体测定方法如下，测定结果如表1所示。
49.(1)
50.(2)抗原活性剩余率：采用竞争法酶联免疫分析(elisa)测定酶解产物的抗原性。操作步骤按试剂盒说明书进行。以抗原性剩余率表示酶解去除抗原效果。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(od值)，并通过标准曲线计算样品中抗原蛋白浓度。以抗原性剩余率表示酶解去除抗原效果。
51.(3)dpph自由基消除率：取1.00ml 1％的大豆寡聚活性肽水溶液，加入4.00ml的100μmol/l dpph乙醇溶液混匀，避光放置30min，以原溶剂调零，在517nm处测定吸光度记为ai；同法取1.00ml溶剂加入4.00mldpph溶液混匀，测定吸光度记为ac；取1.00ml水解物加入4.00ml的溶剂混匀，测定吸光度记为aj。dpph自由基消除率计算公式为：
52.自由基清除率(％)＝[1-(ai-aj)/ac]
×
100％。
[0053]
(4)abts自由基清除率：abts储备液配制：取1.72mg过硫酸钾和10mg abts溶于2.6ml、ph＝7.4pbs缓冲液中，在室温下避光静置12～16h后，用ph＝7.4pbs缓冲液稀释，使其在酶标仪734nm下吸光度值为0.7
±
0.02，得abts工作液(现用现配)。实验分为空白组、对照组和样品组三组。
[0054]
空白组ab：每孔加入200μlpbs缓冲液；
[0055]
对照组ac：每孔加20μlpbs和180μlabts工作液；
[0056]
实验组as：每孔加20μl样品溶液和180μlabts工作液；
[0057]
放置于振荡器振荡10s，室温条件下避光反应5min，用酶标仪测定其在734nm处的吸光度值，abts自由基清除率计算公式为：
[0058]
abts自由基清除率(％)＝(ac-as)/(ac-ab)
×
100％
[0059]
(5)羟基自由基(
.
oh)清除率：采用d-脱氧核糖-fe体系法。吸取0.1ml1％的大豆寡聚活性肽水溶液，移入试管中，加0.1ml1.04mmol/l edta溶液、0.1ml1 mmol/l fecl3溶液、0.1ml2 mmol/l vc溶液、0.1ml10 mmol/l h2o2溶液、0.1ml60 mmol/l dr溶液和0.4ml ph 7.5kh2po
4-naoh缓冲溶液。37℃水浴1h，加1ml 25％hcl溶液终止反应，加1ml 1％硫代巴比妥酸(tba)溶液，100℃水浴15min，冷却后有沉淀，加入1ml正丁醇萃取颜色，然后于532nm波长处测定吸光值。以空白作参比，按下式计算。
[0060]
羟基自由基清除率(％)＝[(a0－(a1－a2)/a0]
×
100％
[0061]
式中：a0－不加样品的空白吸光度；
[0062]
a1－加入样品和2-脱氧-d-核糖的吸光度；
[0063]
a2－样品在体系中吸光度(不加dr)
[0064]
(6)超氧阴离子自由基(o2-)清除率的测定：采用改良的邻苯三酚自氧化法。
[0065]ⅰ、预热：将ph 8.2的tris-hcl-edta缓冲液和45mmol/l的邻苯三酚溶液于25℃水浴中预热20min。
[0066]ⅱ、邻苯三酚自氧化速率的测定：取ph 8.2的tris-hcl-edta缓冲液4.5ml于试管中，再加入一定量的邻苯三酚溶液，迅速混匀于325nm波长下测a0，以10mmol/l盐酸作对照，反应4min，使
△
a/4(即a0)在0.272～0.288之间，记下所用邻苯三酚体积，以后每次加样都用此体积。
[0067]ⅲ、抗氧化活性的测定：取ph8.2的tris-hcl-edta缓冲液4.5m l，加入5％的样品溶液，加入量与上面确定的邻苯三酚溶液添加量相同，再加入等体积的邻苯三酚溶液迅速混匀，在325nm波长进行时间扫描，获得as。
[0068]ⅳ、计算
[0069][0070]
式中：v1：样液总体积/ml；
ꢀꢀ
v：加入样品体积/ml；
[0071]
n：样品稀释倍数；
ꢀꢀ
a0：邻苯三酚的自氧化速率；as：加肽后邻苯三酚的自氧化速率；m：样品质量/g；
[0072]
4.5：反应液总体积。
[0073]
(7)抑制脂过氧化自由基(roo
·
)清除率测定：采用亚油酸脂质过氧化体系法。取50μl 1％的大豆寡聚活性肽水溶液与974μl蒸馏水，26μl亚油酸，2m l无水乙醇，2ml50 mmol的p h7.0的磷酸缓冲液混合，40℃暗处反应12h。取上述混合物50μl加入0.8ml的蒸馏水、0.2ml8.1％sds、1.5ml20％ph3.5的醋酸溶液、1.5ml0.8％巴比妥酸。将上述反应液在100℃加热60min，冷却，在532nm处测定吸光度值。以空白作参比，按下式计算：aa％＝(a
0-as)/a0×
100％
[0074]
式中：aa－对脂过氧化自由基的抑制率
[0075]
a0－抗氧化剂空白样的吸光度
[0076]as
－加抗氧化剂样品的吸光度
[0077]
表1(单位：％)
[0078][0079]
由表1可以得出，实施例2最佳。制备的大豆寡聚活性肽的小分子肽含量占比、抗原活性剩余率、dpph自由基消除率、abts自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、抑制脂过氧化自由基清除率的效果最优。
[0080]
在实施例2的基础上，设置对照例：
[0081]
对比例1：湿法磷酸的超声波处理大豆分离蛋白，其他加工工艺与实施例2相同。
[0082]
对比例2：蛋白酶改性处理，其他加工工艺与实施例2相同。
[0083]
对比例3：省去糖苷类复合物，改用葡萄糖，其他加工工艺与实施例2相同。
[0084]
对比例4：省去行星式球磨机，改用磁力搅拌机，其他加工工艺与实施例2相同。
[0085]
测定了实施例制备的大豆寡聚活性肽的小分子肽含量、抗原活性剩余率、dpph自由基消除率、abts自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、抑制脂过氧化自由基清除率。
[0086]
具体测定方法与测试例相同，测定结果如表2所示。
[0087]
表2(单位：％)
[0088][0089]
由表2可以得出，实施例2最佳，其制备的大豆寡聚活性肽的小分子肽含量占比、抗原活性剩余率、dpph自由基消除率、abts自由基清除率、羟基自由基清除率、超氧阴离子自由基清除率、抑制脂过氧化自由基清除率都是最佳。
[0090]
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。