一种耦合氮源、pH和温度诱导获得真菌毒素制品的液体发酵方法与流程

一种耦合氮源、ph和温度诱导获得真菌毒素制品的液体发酵方法
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种耦合氮源、ph和温度诱导真菌高产真菌毒素，进而获得真菌毒素制品的液体发酵方法。


背景技术：

2.粮食中真菌毒素污染是目前食品安全领域面临的一个突出问题，真菌毒素的检测是污染防控的重点环节之一。真菌毒素标准品的制备对保障量值的准确性、统一性和溯源性具有重要意义。然而由于原料消耗量大，真菌毒素原料的获取是目前限制高质量标准品研制的关键步骤之一。
3.目前，真菌毒素原料的获得主要有两种途径：一是从自然污染粮食中提取，但需克服污染粮食样品筛查困难(需大规模筛查，样品采集和检测耗时，费用支出高)，并且真菌毒素含量难以保证，存在“高投入，低产出，风险大”的问题；二是将产毒真菌在粮食基质上进行固体发酵培养后获取，固体发酵方法技术成本低，但用于真菌毒素获取时技术自身缺陷明显，特别是大规模发酵培养时热质传递受限，发酵过程参数不易控制，后续真菌毒素萃取需要消耗大量有机溶剂，费时费力，并且利用无污染粮食进行产毒真菌发酵也是一种浪费粮食的行为。
4.综上所述，现有的真菌毒素原料的获取方法存在着成本高、能耗高、制备难度大的技术问题。如何高效、绿色环保地获取真菌毒素代谢产物，并进行规模化制备，为真菌毒素标准品的研制提供可靠的原料，是亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

5.为此，本发明提供一种耦合氮源、ph和温度诱导真菌高产真菌毒素，进而获得真菌毒素制品的液体发酵方法。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明实施例提供一种耦合氮源、ph和温度诱导获得真菌毒素制品的液体发酵方法，所述方法包括：将产真菌毒素真菌菌种在诱导培养中培养获得真菌发酵培养液，从所述真菌发酵培养液获得真菌毒素溶液；
8.其中，所述诱导培养基中，各组分的浓度为蔗糖25-35g/l，磷酸二氢钾0.5-1.5g/l，硫酸镁0.2-0.8g/l，硫酸亚铁5-15mg/l，氯化钾0.2-0.8g/l，鸟嘌呤1-1.5g/l，胍丁胺0.1-2g/l；
9.诱导培养基中，各微量组分的含量为：柠檬酸2-3mg/l，硫酸锰20-30μg/l，硫酸锌2-3mg/l，硼酸20-30μg/l，硫酸铜1-1.5μg/l，钼酸钠20-30μg/l；
10.所述诱导培养基的ph值为3-5；
11.真菌发酵培养液的发酵条件为，发酵温度为24-28℃，培养至真菌孢子萌发，再将发酵温度降至16-22℃继续培养。
12.优选的，所述产真菌毒素真菌菌种先接种于马铃薯培养基，培养一定时间后，取真菌菌丝接种于羟甲基纤维素钠培养基，培养一段时间后，收集培养液过滤、离心，获得真菌孢子；
13.再将所述真菌孢子制备成真菌孢子悬浮液，再将真菌孢子接种于诱导培养基中进行发酵培养。
14.优选的，所述产真菌毒素真菌菌种在马铃薯培养基培养时间为3天，培养温度为28℃。
15.优选的，所述真菌菌丝在羟甲基纤维素钠培养基的培养时间为7天，培养温度为28℃。
16.优选的，所述真菌孢子发酵培养条件为：发酵温度为26℃，160rpm振荡培养48h至真菌孢子萌发，再将发酵温度降至19℃，继续培养至第10天，获得真菌发酵培养液。
17.优选的，所述真菌孢子悬浮液的浓度为1
×
107个/ml，所述真菌孢子悬浮液与培养基的接种体积比例为1：2500。
18.优选的，所述真菌发酵液经过纱布过滤后的滤液，再经喷雾干燥仪浓缩干燥，获得浓缩真菌毒素。
19.优选的，
20.所述产真菌毒素真菌菌种为禾谷镰刀菌复合群真菌、假禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌、藤仓镰刀菌复合群真菌、拟枝孢镰刀菌、三线镰刀菌、黄曲霉、杂色曲霉和寄生曲霉的一种或几种。
21.本发明具有如下优点：
22.本发明的耦合氮源、ph和温度诱导获得真菌毒素制品的液体发酵方法包含诱导产毒培养液配方的设计和温度控制程序，实现氮源(鸟嘌呤和胍丁胺)诱导协同ph(ph＝4)和温度调控，三者耦合共同促进真菌毒素的代谢生成，提高真菌毒素的产量。液体发酵成本低廉，诱导培养基原料每升成本不足10元。
23.本发明的耦合氮源、ph和温度诱导获得真菌毒素制品的液体发酵方法，可重复性强，液体发酵技术成熟度高，便于大规模生产；培养后，真菌毒素存在于培养液中，无需额外溶剂提取步骤，直接喷雾干燥浓缩即可，环保节约。该方法适用范围广，发酵方式简单，特别适合规模化应用。
24.本发明的耦合氮源、ph和温度诱导获得真菌毒素的液体发酵方法中，每升培养液真菌毒素产量大约为脱氧雪腐镰刀菌烯醇12mg，3-乙酰基-雪腐镰刀菌烯醇580mg、15乙酰基-雪腐镰刀菌烯醇160mg，雪腐镰刀菌烯醇20mg，乙酰基-雪腐镰刀菌烯醇100mg，t2毒素130mg、ht2毒素125mg、伏马毒素b1 800mg，伏马毒素b2 50mg，伏马毒素b3 20mg、玉米赤霉烯酮300mg，黄曲霉毒素b1 100mg，黄曲霉毒素b2 15mg，黄曲霉毒素g1 10mg，黄曲霉毒素g2 5mg。
附图说明
25.为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据
提供的附图引伸获得其它的实施附图。
26.本说明书所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
27.图1为本发明实施例提供的伏马毒素发酵培养液和最终浓缩液外观照片图。
28.图2为本发明实施例提供的真菌毒素制品与真菌毒素标准品高分辨质谱提取离子色谱图，其中，母离子精确分子量分别为：伏马毒素fb1(722.3956)、伏马毒素fb2/fb3(706.4008)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇don(297.3333)、3/15-乙酰基-脱氧雪腐镰刀菌烯醇3/15adon(339.1438)、t2(484.2541)、ht2(442.2435)，最大允许误差5ppm；a：真菌毒素混合标准品，b：伏马毒素制品；
29.图3为本发明实施例提供的真菌毒素制品高分辨质谱提取离子色谱图，c和d：脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物制品；
30.图4为本发明实施例提供的真菌毒素制品高分辨质谱提取离子色谱图，e：t2和ht2毒素制品；
31.图5为本发明实施例提供的不同氮源、ph值和培养温度下轮枝镰刀菌真菌发酵液中伏马毒素(fb1、fb2和fb3)含量比较柱状图；
32.图6为本发明实施例提供的不同氮源、ph值和培养温度下黄色镰刀菌真菌发酵液中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其衍生物(don、3/15adon)含量比较柱状图；
33.图7为本发明实施例提供的不同氮源、ph值和培养温度下拟枝孢镰刀菌真菌发酵液中t2和ht2含量比较柱状图。
具体实施方式
34.以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
35.本发明中，所采用的仪器有：全温立式振荡培养箱(天津莱玻特瑞仪器设备有限公司，中国)；台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，中国)；喷雾干燥仪(步琦公司，瑞士)；agilent6470b三重四极杆液质联用系统(安捷伦，美国)；四级杆静电场轨道阱高分辨质谱仪(赛默飞世尔科技有限公司，美国)。
36.实施例1、伏马毒素b1、b2和b3真菌毒素制品的制备
37.本实施例提供液体发酵制备伏马毒素b1、b2和b3真菌毒素制品的方法，其包括以下步骤：
38.步骤一、诱导培养基的制备
39.诱导培养基中各组分含量为：蔗糖120g，磷酸二氢钾4g，硫酸镁2g，硫酸亚铁40mg，氯化钾2g，鸟嘌呤4.8g，胍丁胺0.6g。依次称取以上原料组分加入到4.5l塑料容器内，加入4l蒸馏水，振荡至完全溶解(可超声30s辅助溶解)，加入200μl微量组分溶液，加入130μl浓盐酸，测定ph值并调节至ph为4.0。
40.其中，微量组分溶液组成：柠檬酸2.5mg/l，硫酸锰20μg/l，硫酸锌30mg/l，硼酸25μg/l，硫酸铜1.25μg/l，钼酸钠25μg/l。
41.将500ml配置诱导培养基分装至1l三角瓶中，无菌封口膜封口，121℃高压灭菌，灭菌时间30min，灭菌时间根据培养液总体积确定，每升诱导培养基按121℃，保温8min计算。大体积灭菌时，由于灭菌时间较长，灭菌后溶液会有一定程度褐变，这是由于美拉德反应导致，这种情况不影响使用。
42.步骤二、轮枝镰刀菌发酵培养
43.摇瓶发酵培养：将轮枝镰刀菌菌种接种于马铃薯培养基，28℃培养3天，将培养后的轮枝镰刀菌的菌丝接种于羟甲基纤维素钠培养基(cmc)培养基，培养7天，将培养后的轮枝镰刀菌的取菌丝培养液8层纱布过滤，收集培养液，滤液5000g，25℃，离心5min，收集轮枝镰刀菌孢子沉淀物，加入无菌水漂洗离心后，再次用无菌水，涡旋振荡重悬轮枝镰刀菌孢子，血球计数板测定悬浮液中轮枝镰刀菌孢子含量，无菌水调整真菌孢子浓度至1
×
107个/ml的轮枝镰刀菌孢子悬浮液。
44.将轮枝镰刀菌孢子悬浮液按照体积比例1：2500比例接种于配置好的诱导培养基(500ml诱导培养基接种0.2ml轮枝镰刀菌孢子悬浮液)，在温度为26℃条件下，160rpm振荡培养48h至轮枝镰刀菌孢子萌发，然后调整环境培养温度至19℃，继续培养至第10天，收集轮枝镰刀菌孢子发酵培养液。
45.步骤三、伏马毒素b1、b2和b3的浓缩
46.取20μl轮枝镰刀菌发酵培养液，加入10ml 50％乙腈，0.22μm滤膜过滤后，串联质谱测定伏马毒素b1、b2和b3真菌毒素含量分别为833mg/l、53.3mg/l和21.4mg/l。
47.将步骤二收集的轮枝镰刀菌孢子发酵培养液倒入50ml离心管中，25℃，10000g离心5min，将上清液用8层纱布过滤，收集轮枝镰刀菌发酵培养液的滤液，将滤液在喷雾干燥仪上进行浓缩除水。调节进风口温度至135℃，将喷雾干燥仪蠕动泵放入蒸馏水中，蠕动泵功率设置为35％(流速约为10ml/min)，调整空气流速至旋风收集器壁上液体出现(约10立方米/小时)，此时出风口温度保持在50℃。待仪器运行稳定后(10min)，蠕动泵管放入1l收集的滤液中，直至滤液浓缩完毕，获得浓缩的伏马毒素b1、b2和b3真菌毒素，如图1所示。
48.取下收集瓶，加入等体积乙腈溶液，摇匀后即为伏马毒素浓缩制品，若浓缩更大体积滤液，每增加1l滤液，增加1ml乙腈溶液进行溶解即可。取5μl浓缩液，用50％乙腈溶液逐级稀释100000倍后进行高分辨质谱分析，测得浓缩液中产物的精确分子量和保留时间与伏马毒素b1、b2和b3标准品完全一致，如图2所示。
49.实施例2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物制品的制备
50.本实施例提供液体发酵制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物真菌毒素制品的方法，其包括以下步骤：
51.步骤一、诱导培养基的制备
52.诱导培养基组成为：蔗糖35g/l，磷酸二氢钾1.5g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸亚铁5mg/l，氯化钾0.2g/l，鸟嘌呤1g/l，胍丁胺0.1g/l。并加入150μl微量组分溶液，加入浓盐酸，调节培养基的ph为4.0。
53.其中，诱导培养基中微量组分含量为：柠檬酸3.0mg/l，硫酸锰25μg/l，硫酸锌2mg/l，硼酸30μg/l，硫酸铜1.0μg/l，钼酸钠20μg/l。
54.将500ml配置诱导培养基分装至1l三角瓶中，无菌封口膜封口，121℃高压灭菌，灭菌时间30min，灭菌时间根据培养液总体积确定，每升诱导培养基按121℃，保温8min计算。
55.步骤二、黄色镰刀菌发酵培养
56.摇瓶发酵培养：将黄色镰刀菌菌株接种于马铃薯培养基，28℃培养3天，将培养后的黄色镰刀菌菌丝接种于羟甲基纤维素钠培养基(cmc)培养基，培养7天，将培养后的黄色镰刀菌的取菌丝培养液8层纱布过滤，收集培养液，滤液5000g，25℃，离心5min，收集黄色镰刀菌孢子沉淀物，加入无菌水漂洗离心后，再次用无菌水，涡旋振荡重悬黄色镰刀菌孢子，血球计数板测定悬浮液中黄色镰刀菌孢子含量，无菌水调整孢子浓度至1
×
107个/ml的黄色镰刀菌孢子悬浮液。
57.将黄色镰刀菌孢子悬浮液按照1：2500比例接种于配置好的真菌毒素诱导培养基(500ml诱导培养基接种0.2ml黄色镰刀菌孢子悬浮液)，在温度为26℃条件下，160rpm振荡培养48h至真菌孢子萌发，然后调整环境培养温度至19℃，继续培养至第10天，收集黄色镰刀菌孢子发酵培养液至塑料桶中。
58.步骤三、脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物的浓缩
59.取20μl发酵培养液，加入10ml 50％乙腈，0.22μm滤膜过滤后质谱测定脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物的含量。其中，接种15adon型黄色镰刀菌条件下，don产量4.26mg/l，15-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇产量162mg/l；接种3adon型黄色镰刀菌条件下，don浓度为12.8mg/l，3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇浓度为588mg/l。
60.将步骤二收集的真菌孢子发酵培养液倒入50ml离心管中，25℃，10000g离心5min，将上清液用8层纱布过滤，收集黄色镰刀菌孢子发酵培养液的滤液，将滤液在喷雾干燥仪上进行浓缩除水。调节进风口温度至135℃，将喷雾干燥仪蠕动泵放入蒸馏水中，蠕动泵功率设置为35％(流速约为10ml/min)，调整空气流速至旋风收集器壁上液体出现(约10立方米/小时)，此时，出风口温度保持在50℃。待仪器运行稳定后(10min)，蠕动泵管放入1l收集的滤液中，直至滤液浓缩完毕，获得浓缩的脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物。
61.取下收集瓶，加入等体积乙腈溶液，摇匀后即为脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物浓缩制品，若浓缩更大体积滤液，每增加1l滤液，增加1ml乙腈溶液进行溶解即可。取5μl浓缩液，用50％乙腈溶液逐级稀释100000倍后进行高分辨质谱分析，测得浓缩液中产物的精确分子量和保留时间与脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物标准品完全一致，如图3所示。
62.实施例3、t2、ht2制品的制备
63.本实施例提供液体发酵制备t2、ht2毒素制品的方法，其包括以下步骤：
64.步骤一、诱导培养基的制备
65.诱导培养基组成为：蔗糖25g/l，磷酸二氢钾0.5g/l，硫酸镁0.2g/l，硫酸亚铁5mg/l，氯化钾0.8g/l，鸟嘌呤1.5g/l，胍丁胺2g/l。并加入300μl微量组分溶液，加入浓盐酸，调节培养基的ph为4.0。
66.其中，微量组分含量为：柠檬酸2.0mg/l，硫酸锰3.0μg/l，硫酸锌20mg/l，硼酸20μg/l，硫酸铜1.0μg/l，钼酸钠20μg/l。
67.将500ml配置诱导培养基分装至1l三角瓶中，无菌封口膜封口，121℃高压灭菌，灭菌时间30min，灭菌时间根据培养液总体积确定，每升诱导培养基按121℃，保温8min计算。
68.步骤二、拟枝孢镰刀菌真菌培养
69.摇瓶发酵培养：将产毒菌菌株拟枝孢镰刀菌接种于马铃薯培养基，28℃培养3天，将培养后的拟枝孢镰刀菌菌丝接种于羟甲基纤维素钠培养基(cmc)培养基中，培养7天，将培养后的拟枝孢镰刀菌取菌丝培养液8层纱布过滤，收集培养液，滤液5000g，25℃，离心5min，收集拟枝孢镰刀菌孢子沉淀物，加入无菌水漂洗离心后，再次用无菌水，涡旋振荡重悬真菌孢子，血球计数板测定悬浮液中枝孢镰刀菌孢子含量，无菌水调整真菌孢子浓度至1
×
107个/ml的枝孢镰刀菌孢子悬浮液。
70.将拟枝孢镰刀菌孢子悬浮液按照1：2500比例接种于配置好的真菌毒素诱导培养基(500ml菌毒素诱导培养基接种0.2ml真菌孢子悬浮液)，在温度为26℃条件下，160rpm振荡培养48h至真菌孢子萌发，然后调整环境培养温度至19℃，继续培养至第10天，收集拟枝孢镰刀菌孢子发酵培养液。
71.步骤三、t2、ht2真菌毒素的浓缩
72.取20μl发酵培养液，加入10ml 50％乙腈，0.22μm滤膜过滤后质谱测定t2、ht2真菌毒素的含量分别为132mg/l和125mg/l。
73.将步骤二收集的拟枝孢镰刀菌孢子发酵培养液倒入50ml离心管中，25℃，10000g离心5min，将上清液用8层纱布过滤，收集拟枝孢镰刀菌真菌孢子发酵培养液的滤液，将滤液在喷雾干燥仪上进行浓缩除水。调节进风口温度至135℃，将喷雾干燥仪蠕动泵放入蒸馏水中，蠕动泵功率设置为35％(流速约为10ml/min)，调整空气流速至旋风收集器壁上液体出现(约10立方米/小时)，此时出风口温度保持在50℃。待仪器运行稳定后(10min)，蠕动泵管放入1l收集的滤液中，直至滤液浓缩完毕，获得浓缩的t2、ht2毒素。
74.取下收集瓶，加入等体积乙腈溶液，摇匀后即为t2、ht2毒素浓缩制品，若浓缩更大体积滤液，每增加1l滤液，增加1ml乙腈溶液进行溶解即可。取5μl浓缩液，用50％乙腈溶液逐级稀释100000倍后进行高分辨质谱分析，测得浓缩液中产物的精确分子量和保留时间与t2和ht2毒素标准品完全一致，如图4所示。
75.作为可变换的实施方式，实施例1-3中，诱导培养基的ph值可以为3-5。
76.实施例1-3中，发酵条件中，发酵温度范围为24-28℃，培养至真菌孢子萌发，再将发酵温度降至温度范围为16-22℃继续培养。
77.试验例1
78.不同培养条件对伏马毒素b1、b2和b3真菌毒素产量的影响，利用轮枝镰刀菌制备伏马毒素b1、b2和b3制品过程中，对比例中，诱导培养基中，氮源采用硝态氮，本发明诱导培养基中氮源采用鸟嘌呤和胍丁胺。其他条件相同。
79.比较对比例诱导培养基和本发明的诱导培养基培养轮枝镰刀菌，在不同ph值，以及在不同温度培养条件下，伏马毒素b1、b2和b3含量比较，如图5所示。
80.试验例2、
81.不同培养条件对脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物真菌毒素产量的影响，对比例的发酵培养黄色镰刀菌制备脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物制品过程中，诱导培养基的氮源采用硝态氮，本发明诱导培养基中氮源采用鸟嘌呤和胍丁胺。
82.将对比例的诱导培养基和本发明的诱导培养基在不同ph值培养过程中，不同培养温度条件下，培养脱氧黄色镰刀菌制备雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰基衍生物，脱氧雪腐镰刀
菌烯醇及其乙酰基衍生物含量比较，如图6所示。
83.试验例3
84.本试验例发酵培养拟枝孢镰刀菌制备t2、ht2毒素制品过程中，对比例的诱导培养基中，氮源采用硝态氮，本发明诱导培养基中采用鸟嘌呤和胍丁胺。
85.将对比例诱导培养基，本发明的培养基，在不同ph值，不同培养温度条件下，获得t2、ht2真菌毒素含量比较，如图7所示。
86.可适用于实施例1-3真菌毒素制品制备的真菌毒素种类，如表1所示，
87.表1本发明可适用的真菌毒素种类及其对应的产毒真菌。
[0088][0089]
注：禾谷镰刀菌复合群真菌、假禾谷镰刀菌、藤仓镰刀菌复合群、三线镰刀菌和黄曲霉等真菌为实验室从污染小麦和玉米种分离获得，并经its测序鉴定为该物种。黄色镰刀菌、拟枝孢镰刀菌、杂色曲霉和寄生曲霉购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。
[0090]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。