非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用

1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。


背景技术：

2.聚合酶链反应(pcr)方法被认为是扩增靶基因的最经典方法(saiki，gelfand et al.1988)，亦是体外核酸序列扩增应用最为普遍的技术。然而pcr方法的主要问题是：实际操作中必须要用专门的程序温度控制系统，这使得应用成本极大提高。
3.lamp技术(notomi，okayama et al.2000)是可以对靶基因进行恒温条件下的扩增方法，其核心是利用针对靶基因上的六个区域设计四条特异性引物依靠一种高活性链置换dna聚合酶，使得链置换dna合成在不停地自我循环。该技术的其中一个局限是，因该方法高特异性和灵敏度等特点依赖于4条引物的性质，最佳引物的获得通常需要进行序列比对、在线引物设计、引物筛选及特异性试验，这一过程十分繁琐。
4.基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(closed dumbbell mediated isothermal amplification ofnucleic acids，cda)是国科宁波生命与健康产业研究院开发的替代日本lamp核酸扩增的方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在恒温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如pcr等)相比，cda反应在恒温水浴箱中便可完成，仪器设备要求低，较传统pcr和培养法操作简单许多，不需要专业人士也可准确完成。


技术实现要素：

5.本发明的目的是，提供一种非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用，是在前期开发的cda扩增技术上的进一步改进，主要优势在于，能够使目标片段大小降低至40bp左右，且不需要引入外源基因序列。
6.本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
7.非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，包括以下步骤：
8.1)提供一种核酸的步骤，该核酸5’至3’方向依次由f1c、r2、r1、f1、f2、r1c、r2c、f2c区组成，其中f1c区与f1区互补，r2与r2c区互补，r1与r1c区互补，f2与f2c区互补；r1与r2组成r区，f1与f2组成f区；
9.2)步骤1)提供的所述核酸的3’端的f2c区与f2区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸a；
10.3)使第二寡核苷酸的r区与所述核酸a的rc区退火，然后以所述第一寡核苷酸的r区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第二寡核苷酸包括r区与f2区；
11.4)所述核酸a的3’端的f1区与临近的f1c区退火，以核酸a为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。
12.参见图1，为本发明中上述合成核酸方法所对应的合成步骤图解。本发明中的所述
恒温是指整个反应过程在60-65℃的温度范围内进行合成。
13.本发明所述核酸反应中使用的聚合酶为bst dna聚合酶、bca(exo-)dna聚合酶、dna聚合酶i克列诺(klenow)片段、vent dna聚合酶、vent(exo-)dna聚合酶(缺少核酸外切酶活性的vent dna聚合酶)、deep vent dna聚合酶、deep vent(exo-)dna聚合酶(缺少核酸外切酶活性的deep vent dna聚合酶)、φ29phage dna聚合酶以及ms-2phage dna聚合酶等中的一种或几种。其中优选使用bst dna聚合酶或bst 2.0dna聚合酶。
14.本发明核酸反应中可以加入解链温度调节剂，所述解链温度调节剂优选为甜菜碱，进一步优选地，反应溶液中甜菜碱的浓度为0.2-3.0m。
15.本发明获得的核酸链能够自主配对无限延伸，该核酸链上3’端的f1区与临近的f1c区退火，引发核酸链不断的延伸反应。
16.作为优选实施方案，所述步骤1)中一种核酸的合成方法，包括以下步骤：
17.1-a)退火步骤，使第一寡核苷酸的f区与模板的fc区退火，其中所述模板3’至5’方向依次由fc区和r区组成；所述fc区包括f1c和f2c区，r区包括r1区和r2区，f区包括f1区和f2区；所述第一寡核苷酸从5’端到3’端依次为r1区、f1区、f2区；
18.1-b)以所述第一寡核苷酸的f2区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可与同一条链上的r1c区退火的r1区；
19.1-c)在恒温条件下，使第二寡核苷酸的r区与所述第一核酸的rc区退火，其中，所述第二寡核苷酸从5’端到3’端依次为f2区、r2区、r1区；所述r区包括r1区和r2区，rc区包括r1c区和r2c区；
20.1-d)以所述第二寡核苷酸的r1区作为合成起点，合成第二核酸；
21.1-e)在恒温条件下，使第三寡核苷酸的r1区与所述第二核酸的r1c区退火，其中所述第三寡核苷酸从5’端到3’端依次为f1c区、r2区、r1区；
22.1-f)以所述第三寡核苷酸的r1区作为合成起点，合成第三核酸，即获得所述步骤1)中提供的核酸；
23.其中，f区：具有与fc区互补的核苷酸序列的区；
24.f1区：具有与f1c区互补的核苷酸序列的区；
25.f2区：具有与f2c区互补的核苷酸序列的区；
26.r区：具有与rc区互补的核苷酸序列的区；
27.r1区：具有与r1c区互补的核苷酸序列的区；
28.r2区：具有与r2c区互补的核苷酸序列的区。
29.参见图2，为本发明中上述步骤1)中一种核酸的合成方法所对应的合成步骤图解，即图2中的第三核酸，从5’至3’方向依次由f1c、r2、r1、f1、f2、r1c、r2c、f2c区组成。
30.作为优选实施方案，所述步骤1-a)中的模板为rna，步骤1-b)中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。
31.作为优选实施方案，所述f区、r区的核酸片段均为20-60bp，所述f1区、f2区、r1区、r2区的核酸片段均为10-30bp。
32.本发明还提供一种合成核酸的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：
33.第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸从5’端到3’端依次为r1区、f1区、f2区；
34.第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸从5’端到3’端依次为f2区、r2区、r1区；
35.第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸从5’端到3’端依次为f1c区、r2区、r1区；
36.核酸合成催化酶；
37.核苷酸，其作为所述dna聚合酶的底物；
38.其中，f1区：具有与f1c区互补的核苷酸序列的区；
39.f2区：具有与f2c区互补的核苷酸序列的区；
40.r1区：具有与r1c区互补的核苷酸序列的区；
41.r2区：具有与r2c区互补的核苷酸序列的区。
42.作为优选实施方案，所述试剂盒还包括用于检测核酸合成反应产物的检测试剂，所述检测试剂为结合于dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，优选为sybr green i和eva green。
43.作为优选实施方案，所述试剂盒还包括能使酶反应处于合适ph值的缓冲液，退火或维持酶催化活性的必需盐，保护酶的介质。
44.本发明还提供所述试剂盒在合成核酸或检测样品中靶核苷酸序列中非诊断目的的应用。本发明适用于各种dna及rna，例如各种动植物细胞、细菌和病毒的dna及rna的检测。比如，用于非洲猪瘟病毒基因dna及；用于志贺氏菌的基因组dna检测等。
45.基于本发明的在恒温条件下合成核酸的方法，提供一种检测样品中靶核苷酸序列的方法，包括以靶核苷酸为模板，通过本发明的合成核酸的方法进行扩增，并观察是否生成扩增产物。
46.在上述扩增产物中加入包含与形成的非对称环结构互补的核苷酸序列的探针，可观察两者之间的杂交。还可将所述探针标记在颗粒上，并观察通过杂交而发生的聚集反应。所述的扩增方法可以在核酸检测试剂的存在下实施，并根据信号的变化来观察是否生成扩增产物。
47.本发明合成的核酸基本上由通过成茎环结构连接的互相互补的链组成。参见图3，为本发明合成方法形成的理想扩增核酸产物的示意图。
48.本发明合成核酸的方法采用核酸合成催化酶催化互补链反应，所述核酸合成催化酶可以为dna聚合酶或反转录酶等。其中，dna聚合酶可选用以下类型的酶。此外，本发明还可采用这些酶的各种突变体，它们都具有用于互补链合成的序列-依赖活性和链置换活性。
49.bst dna聚合酶
50.bst dna聚合酶(大片段)
51.bst 2.0dna聚合酶
52.bst warmstart 2.0dna聚合酶
53.bst 3.0dna聚合酶
54.bca(exo-)dna聚合酶
55.dna聚合酶i克列诺(klenow)片段
56.vent dna聚合酶
57.vent(exo-)dna聚合酶(缺少核酸外切酶活性的vent dna聚合酶)
58.deep vent dna聚合酶
59.deep vent(exo-)dna聚合酶(缺少核酸外切酶活性的deep vent dna聚合酶)
60.φ29phage dna聚合酶
61.ms-2phage dna聚合酶
62.omniamp dna聚合酶
63.这些酶中，bst dna聚合酶、bca(exo-)dna聚合酶、omniamp dna聚合酶是优选采用的酶，因为它们具有较好的热稳定性和高催化活性。在优选的实施方案中，本发明的反应可恒温实现，但由于解链温度的调节(tm)等，不可能总是能利用恒温条件来维持酶的稳定。因此，采用的酶需要较好的热稳定性。
64.本发明合成或扩增核酸所必需的各种试剂可被预先包装，并以试剂盒的形式提供。具体地，本发明所提供的试剂盒包含作为合成互补链合成的引物和用于置换反应的外引物所必需的各种寡核苷酸，用于互补链合成的底物dntp混合物，用于实现链置换型互补链合成的dna聚合酶，为酶反应提供合适条件的缓冲液，和用于检测合成反应产物所必需的介质。具体地，本发明优选的模式中，所提供的反应试剂已预先全部加入，进而仅通过加入样品就可启动该反应。通过利用可见光信号或荧光信号可在容器内检测反应产物的系统。反应后不必打开和关闭容器。这对于预防污染是非常有利的。
65.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
66.1，较lamp扩增技术目标片段最小为120bp，本发明方法的目标片段可仅为40bp左右，即可较容易的实现核酸恒温的扩增，且不需要引入外源基因序列。
67.2，本发明利用聚合酶催化链置换型的互补链合成而不需复杂的温度控制，有益于核酸的合成，较其他恒温扩增方法可以更特异的实现目标核酸合成。
附图说明
68.图1是本发明中合成核酸方法所对应的合成步骤图解。
69.图2是本发明提供的一种核酸的合成方法步骤图解。
70.图3是本发明合成方法形成的理想扩增产物的示意图。
71.图4是本发明实施例1中asfv靶核苷酸序列中对应的每个核苷酸序列区的位置关系。
72.图5是本发明实施例1中以asfv为模板以本发明单链核酸的合成方法获得的产物琼脂糖电泳结果的照片；其中，泳道1：dnamarker；泳道2：1fmolasfv dsdna扩增产物。
73.图6是本发明实施例2中限制酶消化产物的琼脂糖凝胶电泳结果的照片；其中，泳道1：分子量标记dna ladder；泳道2：实施例1的合成核酸用ecorv消化后的产物；泳道3：实施例1合成的核酸产物。
74.图7是本发明实施例3在引物的作用下，asfv靶核苷酸序列dna扩增过程中的实时荧光曲线图。
75.图8是本发明实施例4中在志贺氏菌靶核苷酸引物的作用下，含志贺氏菌靶核苷酸序列dna扩增过程中的实时荧光曲线图。
具体实施方式
76.下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，具体可参照《pcr技术实验指南》(第2版)一书中所列的
具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
77.实施例1对于非洲猪瘟病毒基因中片段的扩增
78.非洲猪瘟病毒(asfv)可引起一种热性、急性、高度接触性传染病—非洲猪瘟(asf)。该病传播快、致死率高，对养猪业危害极大，是最为严重的疫病，被世界动物卫生组织(oie)列为法定报告疫病，也被我国列为一类动物疫病。临床表现为高热、皮肤发绀、各脏器的出血和呼吸障碍等。可通过虫媒传播和体液传播，并长期保持活性。另外，被病毒污染的饲料、水源、器具，甚至是农场工作人员和服装，以及污染农场附近的空气都是潜在的传染源。asfv(genbank:ae014613)为模板尝试的。实验中用到的引物为asfv-tf(核苷酸序列如seq id no.1所示)、asfv-tr1(核苷酸序列如seq id no.2所示)和asfv-tr2(核苷酸序列如seq id no.3所示)。通过利用临近堆积现象将这些设计成退火成环的区。
79.通过所述引物asfv-tf、asfv-tr1和asfv-tr2，在靶核苷酸asfv两端合成f1c、r2、r1以及f2c区。通过这些引物合成本发明核酸的方法的反应溶液的组合如下面所示。
80.反应溶液组合如下，其余加入ddh2o至25μl
81.20mm tris-hcl ph8.8
82.10mm kcl
83.10mm(nh4)2so484.14mm mgso485.0.1％triton x-100
86.1m甜菜碱
87.1.25mm dntp
88.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
89.引物：
90.1600nm asfv-tf
91.1600nm asfv-tr1
92.1600nm asfv-tr2
93.asfv-tf：tttgaagctg-aggatgctccgattcagggc(seq id no.1所示)
94.asfv-tr1：gattcagggc-gaggaaacgtttgaagctg(seq id no.2所示)
95.asfv-tr2：ggagcatcct-gaggaaacgtttgaagctg(seq id no.3所示)
96.靶核酸:asfv dsdna(核苷酸序列如seq id no.4所示)。参见图4，为asfv dsdna靶核苷酸序列中对应的每个核苷酸序列区的位置关系。
97.seq id no.4：
98.gcaggatgctccgattcagggcgatatcacggcccagatgggg gcccatggtcagcttcaaacgtttcctcgc
99.混合物于63℃反应1小时，反应后，于80℃10分钟终止该反应，然后重新转到用冰预冷的水中。
100.反应的证实：将1μl常规核酸电泳上样缓冲液(takara dna ladder附赠)加到5μl上面终止反应后的反应液中，样品于90mv在gelred预染的(biotum)1％琼脂糖凝胶(tae溶解)电泳1小时。电泳后的凝胶以验证反应合成的核酸，结果参见图5，为以asfv为模板获得
的产物琼脂糖电泳结果的照片；其中，泳道1dna marker；泳道2：产物。结果显示：获得了宽分子量分布的核酸产物，即验证了本发明方法所得到的核酸可无限自组装退火延伸得到超大核酸分子。
101.实施例2通过限制酶的消化证实实施例1中的反应产物
102.为了验证本发明实施例1获得的核酸具有互补核苷酸序列以环状结构连接在单链内的结构形式，用限制酶消化产物。如果通过消化能生成理论上的片段，同时不存在高分子量处产生不清晰成片条带模式和未被电泳的带，就可推定实施例1的合成产物为具有互补序列交替地连接在单链内的核酸。
103.实施例1中反应终止后的反应液通过用乙醇的沉淀作用得以沉积和纯化，回收产生的沉淀并重新溶于超纯水中，用限制酶ecorv于37℃消化2小时，样品于90mv在gelred预染的(biotum)1％琼脂糖凝胶(tae溶解)电泳1小时。用dna ladder作为分子量标记。通过电泳后的凝胶以验证核酸。结果在图6中显示，结果表明：所获得的核酸产物由大片段可酶切为小片段，证明产物为针对目标核酸扩增所得，未出现非特异性扩增，证实了本发明方法的特异性，以及核酸产物为互补序列交替连接。
104.实施例3应用evagreen验证asfv基因扩增反应产物
105.evagreen同sybr green i类似，是一种结合于所有dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料，其对pcr等核酸扩增反应的抑制远小于后者。在游离状态下，evagreen发出微弱的荧光，但一旦与双链dna结合后，荧光大大增强。因此，evagreen的荧光信号强度与双链dna的数量相关，可以根据荧光信号检测出核酸扩增体系存在的双链dna数量。
106.通过引物asfv-tf(核苷酸序列如seq id no.1所示)、asfv-tr1(核苷酸序列如seq id no.2所示)和asfv-tr2(核苷酸序列如seq id no.3所示)，合成本发明核酸的方法的反应溶液的组合如下面所示。
107.反应溶液组合如下，其余加入ddh2o至25μl
108.20mm tris-hcl ph8.8
109.10mm kcl
110.10mm(nh4)2so4111.14mm mgso4112.0.1％triton x-100
113.1m甜菜碱
114.1.25mm dntp
115.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
116.1x evagreen(biotum)
117.引物：
118.1600nm asfv-tf
119.1600nm asfv-tr1
120.1600nm asfv-tr2
121.靶核酸:asfv dsdna(核苷酸序列如seq id no.4所示)。
122.设置圣湘sansure real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光
强度随反应时间变化的曲线如图7所示。将荧光检测应用于其中可实现实时监测的目的，通过实时扩增曲线可知：在反应25分钟后，荧光强度逐渐增强，说明合成的核酸产物不断延伸并形成交替连接的互补序列。
123.实施例4对于志贺氏菌靶基因扩增
124.志贺氏菌(shigella，sh)是革兰氏阴性细菌，1898年由日本细菌学家志贺洁首先发现。人对志贺氏(杆)菌的易感性很高，是它的唯一宿主，主要通过摄取(粪便-口的污染)食物感染，最常见的症状是腹泻(水腹泻)、发烧、恶心、呕吐、胃抽筋、肠胃气胀和便秘。快速、灵敏、高特异性核酸标志物检测技术研发将为志贺氏菌防控提供强有力的保障。故挑选志贺氏菌(shigella)应用本发明方法作为潜在应用对象。
125.反应溶液组合如下，其余加入ddh2o至25μl
126.20mm tris-hcl ph8.8
127.10mm kcl
128.10mm(nh
4)2
so4129.14mm mgso4130.0.1％triton x-100
131.1m甜菜碱
132.1.25mm dntp
133.8u bst dna聚合酶(new england biolabs)
134.1x evagreen(biotum)
135.引物：
136.1600nm sh-tf(序列如seq id no.5所示)
137.1600nm sh-tr1(序列如seq id no.6所示)
138.1600nm sh-tr2(序列如seq id no.7所示)
139.靶核酸为:sh dsdna(序列如seq id no.8所示)
140.sh-tf：agcagtctttccactgagtttttccagccatg
141.sh-tr1：ttccagccatgagcttcgacagcagtctttc
142.sh-tr2：aaaactcagtgagcttcgacagcagtctttc
143.设置圣湘sansure real time pcr反应温度恒定为63℃，反应时间为60min。荧光强度随反应时间变化的曲线如图8所示。扩增曲线说明本方法可适用食品安全的检测应用领域。
144.上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内可以有各种变化和更改，所作的任何变化和更改，均在本发明保护范围之内。