非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用

技术特征：
1.非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)提供一种核酸的步骤，该核酸5’至3’方向依次由f1c、r2、r1、f1、f2、r1c、r2c、f2c区组成，其中f1c区与f1区互补，r2与r2c区互补，r1与r1c区互补，f2与f2c区互补；r1与r2组成r区，f1与f2组成f区；2)步骤1)提供的所述核酸的3’端的f2c区与f2区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，将合成完后的核酸序列称为核酸a；3)使第二寡核苷酸的r区与所述核酸a的rc区退火，然后以所述第一寡核苷酸的r区作为合成起点，进行合成步骤；其中所述第二寡核苷酸包括r区与f2区；4)所述核酸a的3’端的f1区与临近的f1c区退火，以核酸a为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。2.根据权利要求1所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于，所述步骤1)中一种核酸的合成方法，包括以下步骤：1-a)退火步骤，使第一寡核苷酸的f区与模板的fc区退火，其中所述模板3’至5’方向依次由fc区和r区组成；所述fc区包括f1c和f2c区，r区包括r1区和r2区，f区包括f1区和f2区；所述第一寡核苷酸从5’端到3’端依次为r1区、f1区、f2区；1-b)以所述第一寡核苷酸的f2区作为合成起点，合成第一核酸；所述第一核酸具有与所述模板互补的核苷酸序列，所述第一核酸的5’末端具有可与同一条链上的r1c区退火的r1区；1-c)在恒温条件下，使第二寡核苷酸的r区与所述第一核酸的rc区退火，其中，所述第二寡核苷酸从5’端到3’端依次为f2区、r2区、r1区；所述r区包括r1区和r2区，rc区包括r1c区和r2c区；1-d)以所述第二寡核苷酸的r1区作为合成起点，合成第二核酸；1-e)在恒温条件下，使第三寡核苷酸的r1区与所述第二核酸的r1c区退火，其中所述第三寡核苷酸从5’端到3’端依次为f1c区、r2区、r1区；1-f)以所述第三寡核苷酸的r1区作为合成起点，合成第三核酸，即获得所述步骤1)中提供的核酸；其中，f区：具有与fc区互补的核苷酸序列的区；f1区：具有与f1c区互补的核苷酸序列的区；f2区：具有与f2c区互补的核苷酸序列的区；r区：具有与rc区互补的核苷酸序列的区；r1区：具有与r1c区互补的核苷酸序列的区；r2区：具有与r2c区互补的核苷酸序列的区。3.根据权利要求2所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述步骤1-a)中的模板为rna，步骤1-b)中的第一核酸通过具有反转录酶活性的酶来合成。4.根据权利要求1或2所述的恒温条件下合成核酸的方法，其特征在于：所述f区、r区的核酸片段均为20-60bp，所述f1区、f2区、r1区、r2区的核酸片段均为10-30bp。5.一种合成核酸的试剂盒，所述试剂盒包括以下组分：第一寡核苷酸，所述第一寡核苷酸从5’端到3’端依次为r1区、f1区、f2区；第二寡核苷酸，所述第二寡核苷酸从5’端到3’端依次为f2区、r2区、r1区；
第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸从5’端到3’端依次为f1c区、r2区、r1区；核酸合成催化酶；核苷酸，其作为所述dna聚合酶的底物；其中，f1区：具有与f1c区互补的核苷酸序列的区；f2区：具有与f2c区互补的核苷酸序列的区；r1区：具有与r1c区互补的核苷酸序列的区；r2区：具有与r2c区互补的核苷酸序列的区。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括用于检测核酸合成反应产物的检测试剂，所述检测试剂为结合于dsdna双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括能使酶反应处于合适ph值的缓冲液，退火或维持酶催化活性的必需盐，保护酶的介质。8.权利要求5-7任一项所述试剂盒在合成核酸或检测样品中靶核苷酸序列中非诊断目的的应用。

技术总结
本发明公开了非诊断目的的恒温条件下合成核酸的方法及试剂盒和应用。所述方法为：提供一种核酸的步骤，该核酸5’至3’方向依次由F1c、R2、R1、F1、F2、R1c、R2c、F2c区组成，其中F1c区与F1区互补，R2与R2c区互补，R1与R1c区互补，F2与F2c区互补；R1与R2组成R区，F1与F2组成F区；所述核酸的3’端的F2c区与F2区退火，以该核酸为模板合成其自身的互补链，称为核酸A；使用引物第一寡核苷酸与核酸A的Rc区退火，进行合成步骤；所述核酸A的3’端的F1区与临近的F1c区退火，以核酸A为模板合成其自身的互补链，并引发自动的核酸链延伸反应。利用本发明的核酸合成方法，目标片段可仅为40bp左右，且不需要引入外源基因序列。入外源基因序列。入外源基因序列。


技术研发人员：毛瑞 赵月 蔡挺 缪青
受保护的技术使用者：中国科学院大学宁波华美医院
技术研发日：2022.02.07
技术公布日：2022/4/12