电穿孔装置和方法与流程

1.本发明涉及电穿孔。


背景技术：

2.文献us 2006/089674(walters等人)和文献wo 2018/200800(bowers等人)描述了电穿孔装置。
3.电穿孔是医学和分子生物学技术，用于向细胞施加电场以增加细胞膜的渗透性，从而允许以前不能渗透到细胞中的分子被引入。电穿孔可以应用到许多领域，并且可以在其对细胞膜的影响可逆和不可逆的地方应用。在典型的电穿孔过程中，会产生短而强的电脉冲以瞬时透化细胞膜。
4.可逆电穿孔可用于实现例如化学疗法的细胞内被动扩散，在可逆电穿孔中，电场低于某个电压阈值并允许细胞膜在治疗后修复。可逆电穿孔可涉及允许诸如药物或基因的分子进入通常不能渗透该物质的细胞或分子中，而不会仅由电场就诱导细胞死亡。对于细胞的电场阈值因细胞而异。在不可逆电穿孔中，电场将大于该电压阈值，这会在细胞膜中产生永久性纳米孔，破坏细胞稳态，且因此细胞会由于正常细胞功能的破坏造成的细胞凋亡和坏死结合而死亡。
5.本发明旨在提供一种电穿孔探测器驱动器和装置和方法，用于接近理论理想值地传送高压、超短电穿孔脉冲(优选微秒范围，并且在某些情况下低至纳秒范围)，其在应用于生物负载时具有快速开通和关断时间以及稳定的幅度。
6.另一目的在于避免驱动装置所需的大型物理尺寸。
7.另一目的在于在被治疗的细胞周围实现更有利的治疗环境。
8.参考文献
9.参考文献：b.l.ibey et al.,bipolar nanosecond electric pulses are less efficient at elecropermeabilization and killing cells than monopolar pulses.,biochem.biophys.res.commun.,vol.443,no.2,pp.568
□
73,jan.2014.10.1016/j.bbrc.2013.12.004.
10.参考文献：t,j,m,o
′
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技术实现要素：

11.我们描述了如权利要求1至29所述的电穿孔装置、如权利要求30至42所述的装置的操作方法、如权利要求43至70所述的电穿孔方法、如权利要求71至94所述的用于电穿孔的泡沫、如权利要求95至100所述的电穿孔装置、如权利要求101至103所述的装置的操作方法、以及如权利要求104和105所述的用于电穿孔的具有钙离子的溶液。
12.通常，电穿孔治疗采用50-100微秒(μsec)范围内的脉冲长度，脉冲单独使用(不可逆电穿孔)或与化学疗法(电化学疗法)结合使用，以诱导细胞死亡。最近，已经研发出更短微秒(《10微秒)的高频不可逆电穿孔和纳秒(《1微秒)脉冲，与单极脉冲相比，使用双极脉冲时观察到的细胞透化程度存在抵消效应。
13.在本发明中，我们提供了装置和方法来获得在被治疗细胞周围改进的环境。这些改进源于我们理解到，在短微秒范围内(《10微秒)，使用双极脉冲可能会产生抵消效应(细胞透化降低)，且这也部分地取决于细胞周围溶液的电导率。由短双极电脉冲(《10μs)产生的细胞透化(在细胞膜上产生孔)的效力受电导率的影响，其中较低的电导率将能够实现更有效的电脉冲诱导的细胞膜透化。细胞周围的电导率部分地受该区域中的流体体积和局部注射溶液(例如，局部麻醉剂或其他含离子溶液)的影响。待电穿孔的细胞周围的电导率增加将导致更高的电流，这对治疗有害，导致患者的细胞透化更差和疼痛感。在高电导环境中，电穿孔治疗可能会在治疗期间产生气体，从而导致具有严重声学表征的压力波(称为放电、火花或电弧)和机械组织损伤。电穿孔期间发生的细胞裂解和离子释放本身会导致组织电导率增加，从而导致高电流和潜在的机器故障以及脉冲传送不足。
14.在下文中，我们描述了改进的电穿孔装置，用于提供脉冲和提供用于改进被治疗细胞周围环境的物质，并且我们描述了改进的探测器头部，用于通过插入组织中的相同的针来以任何所需顺序既注射物质又施加电穿孔脉冲。
15.我们描述的电穿孔装置包括多个电穿孔探测器端子、用于提供升压电压的变压器、以及用于将脉冲传送至探测器端子以进行电穿孔的开关电路。开关电路优选地具有用于将高压和低压或接地电平链接到探测器端子的开关、以及控制器，控制器被配置为根据控制方案控制所述开关以将脉冲传送至探测器端子，并且在探测器端子中所述脉冲被传送至包含至少两个探测器电极端子的组，用于彼此隔开的探测器电极。
16.优选地，脉冲是双极性的，以用于一对电极。优选地，一对端子中的每个端子与其对应的探测器端子被顺序以一定电压幅度驱动和异相接地。
17.优选地，控制器被配置为向每个探测器电极端子施加小于0.5μs的斜坡上升(tr)持续时间直至在100v至3000v范围内的平稳(u)幅度持续1μs至5μs范围内的时间、以及施加小于0.5μs的从所述电压斜坡下降(tf)的持续时间。
18.可选地，幅度在700v至1600v的范围内，并且脉冲平稳持续时间在1μs至3μs的范围内，以及优选传送脉冲的通电开通时间在100μs至300μs的范围内。优选地，脉冲被即刻连续地传送。优选地，双极频率在100k hz至500khz的范围内。
19.优选地，控制器被配置为在电穿孔操作之后施加接近于零持续时间的平稳期并允许脉冲中的斜降下降式衰减，以及优选通过跨越带电电容器的电阻器的固定或可调值来设置衰减速率。
20.可选地，控制器被配置有限定待连接到端子的探测器端子的相对物理位置的映射数据，并且被配置为引导脉冲以跨越由探测器电极界定的空间施加电压。
21.优选地，控制器被配置为同时驱动具有相同电位的第一组端子和具有不同电位的相对的第二组端子，以用于跨越由第一和第二映射探测器位置限定的平面且在所述平面之间施加电荷。
22.可选地，第一组以高电位被驱动，且第二组接地。
23.优选地，控制器被配置为即刻颠倒跨越所述平面的方向，即，向第一组施加先前施加到第二组的电势，向第二组施加先前施加到第一组的电势，在这种情况下，第一组和第二组被重新限定，从而使得电荷在跨越所述空间的一个方向上被施加而后被即刻颠倒。
24.优选地，控制器被配置为在颠倒跨越所述平面的方向之后，驱动第三组和第四组，第三组和第四组也限定了所述平面，但是第三组和第四组之间的方向不同于第一组和第二组之间的方向。
25.优选地，所述方向近似正交。优选地，映射数据被用于通过四个探测器界定的至少一个四边形限定的平面。优选地，映射数据被用于多个四边形。
26.可选地，映射数据限定四边形，一些探测器用于限定不同的和相邻的四边形的边。
27.优选地，开关电路包括专用于每个端子的每个电压电平的开关。优选地，开关电路包括专用于作为脉冲施加到端子的高压电平的开关、以及专用于将端子接地的开关。
28.优选地，开关电路包括专用于每个开关的驱动电路。优选地，每个驱动电路能够由控制器单独寻址。可选地，每个驱动电路包括独立的浮动电源。优选地，所述开关包括fet和/或igbt。
29.优选地，控制器被配置为初始执行探测询问，以从探测存储器确定期望的驱动轮廓。优选地，由控制器执行探测器询问以设置用于探测器的优化参数。
30.优选地，控制器被配置为通过在频谱上向探测器电极施加ac信号来测量生物负载中的阻抗。优选地，频谱在1khz至100khz的范围内。优选地，在电穿孔驱动之前执行阻抗测量，并且控制器被配置为根据所测量的阻抗自动调节驱动参数，优选地实现跨越一对电极的电流小于500ma。
31.我们还描述了本文描述的任何示例的电穿孔装置和连接到所述探测器端子的多个探测器电极。
32.在一个示例中，探测器电极在包括至少一个电极针的探测器头部中，该电极针是中空的并且具有至少一个开口，用于在电穿孔之前和/或期间和/或之后使物质流入组织。优选地，控制器被配置为以还包括在用脉冲驱动针的方法中控制物质流向一个或多个针。
33.我们还描述了这种装置的操作方法，该方法包括以下步骤：将所述探测器电极插入生物负载中，并且所述装置将双极电压脉冲施加到电极以及用于电穿孔的负载中。
34.优选地，控制器以双极方式施加相对的探测器电极的脉冲。
35.优选地，脉冲平稳(u)持续时间(δt)在1μs到5μs、优选1μs到3μs的范围内。优选地，脉冲平稳电压幅度(u)在100v至3000v、优选700v至1600v的范围内。
36.优选地，所述探测器电极被脉冲化的主动治疗的通电开通时间的持续时间在100μs至300μs的范围内，并且基于一个周期两个连续脉冲的双极脉冲频率在100khz至500khz的范围内。
37.优选地，驱动电极以使探测器电极中的电流和生物负载小于500ma，以用于dna迁移到透化细胞中。
38.优选地，存在不可逆电穿孔，在不可逆电穿孔中，将高渗溶液注射到部位以辅助细胞消融过程，并且所述溶液可以包括钙。
39.优选地，以2mmol/l至250m mol/l范围内、优选50m mol/l至150mmol/l范围内的浓度肿瘤内注射钙离子(ca )。
40.优选地，包含浓度为2mmol/l至150mmol/l的钙离子(ca )的溶液被注射以用于通过电穿孔进行瞬时透化，电穿孔施加的脉冲电压为500v/cm和1500v/cm；脉冲平稳持续时间为1μs至3μs，脉冲数范围为1000至10,000。
41.在其他优选实施例中，以2mmol/l至250mmol/l范围内、优选2mmol/l至150mmol/l范围内的浓度肿瘤内注射钙离子(ca )。
42.在其他优选实施例中，包含浓度为2mmol/l至150mmol/l的钙离子(ca )的溶液被注射以用于通过电穿孔进行瞬时透化，电穿孔施加的脉冲电压为500v/cm和1500v/cm；脉冲平稳持续时间为1μs至3μs，脉冲数量范围为1000至10,000。
43.在一个示例中，在可逆电穿孔中将dna传送至细胞，步骤如下：
44.(a)将dna注射到部位，
45.(b)插入探测器电极，
46.(c)向电极驱动脉冲以渗透细胞，所述驱动是频率在100khz和500khz范围内的双极脉冲；脉冲平稳持续时间在1μs至5μs、优选1μs至3μs的范围内；电压幅度范围为100v至3000v；以及
47.(d)低频电极驱动，以在电泳阶段将dna或试剂吸入细胞中，低压脉冲小于5v，持续时间为10ms至100ms。
48.在一个示例中，将药物注射到部位并进行电穿孔以使药物迁移到细胞中以引起细胞消融，例如化疗剂。
49.在一个示例中，控制器在电极的脉冲驱动之后，以接近于零持续时间的脉冲释放存储的电荷，随后指数衰减。
50.在一个示例中，控制器测量至少一对电极之间的生物负载的阻抗，并自动设置脉冲电压幅度以避免在电穿孔期间过度的电流流动。
51.我们还描述了在受试者中进行电穿孔的方法，该方法包括以下步骤：将液体注射到待治疗细胞周围的目标环境中，以及电穿孔探测器将脉冲传送至部位。
52.对于许多使用示例而言，液体优选以泡沫的形式使用，具有液体和气体气泡。优选地，传送泡沫以实现比液体更高的阻抗并因此获得更低的电导率。优选地，泡沫包括起泡剂以帮助气体混合。泡沫中的气体可以包括空气和/或co2。优选地，气体与液体的体积比大约在1:2至1:10的范围内。优选地，发泡剂包括白蛋白和人血清白蛋白中的一种或多种。优选地，发泡剂浓度在重量比(w/w)5％至80％的范围内。优选地，发泡剂包括聚多卡醇或十四烷基硫酸钠(sts)。
53.优选地，液体包含活性剂治疗成分。优选地，所述成分包括选自钙、钾、博来霉素、顺铂、dna、rna中的一种或多种。优选地，治疗组合物包含钙离子、钾离子、博来霉素、顺铂、dna或rna中的一种或多种。
54.对于某些用途，液体优选具有一定浓度的离子，例如浓度为2mmol至250mmol、或更优选为2mmol至150mmol的钙或钾离子
55.优选地，电脉冲具有在0.05μs至5μs范围内的脉冲长度。
56.优选地，对于许多治疗，电脉冲是双极的。
57.优选地，在“开通”通电时间内按序列传送电脉冲，每个序列在1μs至1000μs范围内、重复多达1000次、频率范围为1khz至1000khz。
58.在一些示例中，所述治疗是电化学疗法，脉冲电压在500v/cm至1500v/cm的范围内，和/或脉冲持续时间在50微秒至100微秒的范围内，和/或脉冲频率在范围1hz至5000hz内，和/或脉冲数量在4至8范围内。
59.在一些实施例中，所述治疗是不可逆的电穿孔，脉冲电压在1500v/cm至3000v/cm的范围内，和/或脉冲持续时间在70至100微秒的范围内，和/或脉冲频率在0.5hz至10hz的范围内，和/或脉冲数量在90至200的范围内。
60.在一些实施例中，所述治疗是高频不可逆电穿孔，脉冲电压在2500v/cm至5000v/cm的范围内，和/或脉冲持续时间在1微秒至5微秒的范围内，和/或脉冲频率在100khz至500khz的范围内，和/或脉冲数量大于100。
61.在一些示例中，所述治疗是电穿孔和电解(e2)，脉冲电压在100v/cm至3000v/cm的范围内，和/或传送的电荷大于100μf，和/或脉冲呈指数衰减波。
62.我们还描述了一种方法，其中，所述治疗是dna或rna传送，脉冲电压在1v/cm至1000v/cm的范围内，和/或脉冲是单极方波。
63.在一个方面，优选为泡沫形式的液体将局部麻醉剂分散到待治疗的组织中。一方面，局部麻醉剂包括利多卡因(lignocaine，也称为“lidocaine”)。一方面，局部麻醉剂包括有或没有肾上腺素的比例为5至20mg/ml的利多卡因。一方面，局部麻醉剂包括甲哌卡因。一方面，局部麻醉剂包括比例为10至30mg/ml的甲哌卡因。
64.一方面，具有麻醉剂的液体优选为泡沫形式，其与所选择的分子结合施用，所述分子诸如为钙离子、钾离子、博来霉素、dna中的任何一种或多种。
65.我们还描述了一种泡沫，用于在电穿孔期间辅助细胞的透化或消融。
66.优选地，泡沫包含治疗成分。优选地，所述成分包括选自钙、钾、博来霉素、顺铂、dna、rna中的一种或多种。
67.优选地，泡沫具有一定浓度的离子。优选地，所述泡沫包含浓度为2mmol至150mmol的钙离子。
68.在一个优选实施例中，泡沫包括与所选择的分子结合的麻醉剂，所述分子诸如为钙离子、钾离子、博来霉素、dna中的任何一种或多种。
69.我们还描述了一种包括至少一个电极针的电穿孔探测器头部，该电极针是中空的并且具有至少一个开口，用于在电穿孔之前和/或期间和/或之后使物质流入组织。
70.优选地，存在多个针。所述针具有在0.1mm至1.8mm范围内的最大内部宽度尺寸和在0.25mm至2.5mm范围内的最大外部宽度尺寸，并且开口的最大宽度尺寸在0.05mm至1.5mm的范围内。
71.在一个示例中，存在多个针并且针的间隔在2mm至3cm的范围内。
72.各开口可以沿着针的长度以螺旋或交错的方式布置。各开口可以在至少一个针的面向另一针的一侧上具有更大的分布。
73.我们还描述了一种电穿孔装置，该装置包括与探测器头部连接的脉冲发生器，该探测器头部包括至少一个电极针，该电极针是中空的并且具有至少一个开口，用于在电穿孔之前和/或期间和/或之后使物质流入组织。
74.优选地，该装置包括控制器，该控制器适于根据期望的方法控制脉冲到针的传送以及控制物质到针的传送。
75.优选地，控制器被配置为依次引起将第一物质传送至至少一些针、使针脉冲、以及将第二物质传送至所述针。优选地，第一物质的电导率低于第二物质的电导率。在一个示例中，第一物质包括泡沫。在一个示例中，第一物质包括泡沫并且第二物质包括泡沫，并且第一物质泡沫具有比第二物质泡沫更大的气体浓度。
76.我们还描述了一种操作电穿孔装置的方法，包括通过针泵送物质以通过开口流出并且向针施加脉冲。该方法可以包括在施加脉冲之前和/或在施加脉冲之后通过针传送物质。
附图说明
77.将从以下对本发明的一些实施例的描述中更加清楚地理解本发明，仅通过参考附图以示例的方式给出这些实施例，其中：
78.图1是电穿孔装置的透视图；
79.图2是电穿孔装置的框图；
80.图3示出了带有变压器的高压发生器；
81.图4详细示出了脉冲开关和控制块；
82.图5示出了流经使用中的生物负载的电功率；
83.图6是阐明探测器的电气方面的示意图；
84.图7是控制器实现的脉冲发生器算法的流程图；
85.图8是由探测器在生物负载中施加电压的示意性空间代表图；
86.图9是由发生器传送的电穿孔脉冲的示意图，电穿孔脉冲的参数值见下表1；
87.图10是由cro捕获的样本脉冲的图像；
88.图11是示出电穿孔前后组织阻抗的一组关系图；
89.图12是用于比较目的的四种情况下的肿瘤体积变化的一组关系图；
90.图13是由电穿孔引起的肌肉收缩的关系图，示出了更短持续时间和更高频率的益处；
91.图14是用于脉冲波形图的一个示例的关系图；
92.图15是通过电穿孔吸收碘化丙啶的关系图；
93.图16是表示被注射液体溶液与被注射泡沫溶液相比组织中的阻抗和电流的关系图；
94.图17是在低电导率缓冲液和高电导率缓冲液中细胞透化率与电场强度的关系图；
95.图18是在低低电导率缓冲液和高电导缓冲液中细胞存活率与电场强度的关系图；
96.图19是示出电穿孔装置的泡沫注射头的示意图；以及
97.图20是示出在不同电压驱动水平下使用泡沫引起的电穿孔电流降低的关系图。
具体实施方式
98.参照图1和2，电穿孔装置1包括与使用者界面3和探测器驱动电路4链接的主控制器2，全部都安装在外壳9中。控制器2和界面3提供使用者侧功能，而驱动电路4向探测器26提供脉冲。
99.驱动电路4包括：
100.脉冲控制单元5，其由光隔离器18与驱动装置4的其余部分隔开，以避免高压被无意地传送至低压控制电子器件；
101.具有变压器的高压发生器6，跨越电容器提供高达1.5kv的电压，如下面参照图3更详细地描述的；
102.脉冲开关控制器7，如参照图4更详细地描述的，用于将高频的双极脉冲传送至七个探测器电极26的阵列；以及
103.电压设置和维持电路8。
104.触摸屏界面3可操作地耦合至控制器2，控制器管理高压的产生和脉冲控制、以及电压、脉冲持续时间、极性和方向。这种控制水平通过方框5-8中的一系列控制电路来实现。
105.高压发生器6在图3中示出。开关控制器5接收例如48v的低压直流(dc)输入。这个输入水平设置出被传送至探测器26的合成脉冲强度水平，如下文所述。开关控制器5调节初级变压器1通电的时间，以控制在电容器14上的输出电压。从该输出到开关控制器5的反馈(通过医疗级光耦合器18进行适当隔离)使得电压能够被精确设置和维持。因此，电容器14的输出电压可以在大范围内变化(通常为100v至约1.5kv)。
106.在该示例中，变压器11、12将输入电压升压至1.5kv，其由传统结构的整流器13整流。这个高压电平(现在是dc)跨越平衡电阻器15和1000μf电容器14出现，作为探测器电极(26)的输出。在该示例中，四个电容器14中的每个都处理高达450v的电压。充电时间小于10秒。
107.二极管13承受全部输出电压加上由变压器中的开关产生的峰值反向电压，其通常是正向电压的几倍。此外，高压电容器14被串联放置以能够在所需电压下操作，与电容器并联的电阻器15有助于平衡跨越电容器的电压。虽然为了清楚起见在变压器的输出端仅示出了两个绕组12，但实际上这个数量可能更多。这些部件的参数的优选范围是2至10。
108.高压发生器6将这个电平的dc电压提供给脉冲开关控制器7，该脉冲开关控制器继而经由端子27以受控模式将这个电压施加到探测器电极26，以用于优化电穿孔治疗。这将在下面更详细地描述。
109.图4和5更详细地示出了脉冲开关控制器7和电压设置和维持电路8。具有独立浮动电源20的驱动电路22能够由控制器5单独寻址，从而igbt 24和25将高压脉冲传送至探测器26端子27，在其中供应给探测器的电压的极性和持续时间被优化。
110.为了实现探测器的必要切换，驱动电路22将每个探测器26电极连接到高压轨hv或接地gnd，并且可以在软件中设置针脚对的电压持续时间和极性。为了实现所需的高压，使用了绝缘栅双极晶体管(igbt)(或其他示例中的fet)。对于更高的电压，可以增加晶体管的数量。虽然仅示出了七个电路，但可以根据需要增加或减少输出的数量。
111.如上所述，脉冲开关控制器7包括七个顶部驱动电路和七个底部驱动电路22，它们均具有到电源20的专用链路(主要是高压发生器6的电容器14)。有一系列(在本例中为七)igbt对24/25，每对igbt对用于一个探测器电极端子27。例如，第一igbt对24/25(图4中最左侧)将第一探测器电极p1连接到来自高压轨hv的高压或接地gnd。同时，第二igbt对以反向方式将探测器电极p2连接接地或连接到高压轨hv。因此，电流将在任一方向上穿过生物负载。
112.在任何时候，一个探测器电极具有高压或低压( 1.5kv或-1.5kv)，并且与其相对
的电极接地。一对电极中的一个电极的电压比另一个电极小1.5kv的事实得到了相对负脉冲。因此，观察一对相对的电极，电压是双极的，相对电压从 1.5kv切换到-1.5kv。
113.电压设置和维持电路8包括比较器和隔离控制电路，该隔离控制电路确保输出电压被维持在用于脉冲序列传送的设置电压。
114.参考图6，探测器26具有存储探测器类型、配置和输出设置数据的存储器40。有到存储器50的单线型存储i/o线。
115.参考图7，脉冲开关控制算法100由控制器5实施，以产生和施加脉冲。存在开始操作序列50，在其中读取探测器26存储器40以获取探测器类型、配置和输出设置数据。在探测器驱动序列100中，低侧驱动器22被开通，然后是高侧驱动器22。控制器等待所需的脉冲宽度和补偿时间，然后关断相关联的高侧驱动22。控制器等待关断时间和补偿时间，并且关断低侧驱动22。然后，如果需要，可以产生负极性脉冲。
116.控制器使用双针脚型探测器接触技术管理控制脉冲，以将电压源旋转180
°
，如图8所示，在其中针脚型探测器电极分别被标记为p1到p7。
117.开关控制器5询问探测器26以初始验证它是否获批并且发现旨在用于特定应用的允许脉冲轮廓。评估探测器身份并限定适当的脉冲轮廓和序列。当探测器26插入时，通过将感测线拉低，感测线将激活微控制器。然后，微控制器可以与存储器40通信以读取探测器参数。参数的几个副本被存储在探测器存储器40中，带有误差检测以验证正确的读数。探测器身份读取序列如下：
118.已附接感测探测器；
119.与存储器通信并读取第一组参数；
120.验证错误检测代码；
121.如果已经验证，设置完成；
122.如果未验证，则读取下一个参数块；
123.验证错误检测代码；
124.如果没有找到好的参数集，则产生误差消息；
125.在屏幕上指示探测器类型，作为对使用者的视觉指示。
126.再次参考图8，所示的电压脉冲的旋转导致受影响组织的全面电穿孔。在该方案中，电极成对地通电，并且可以被操纵以受控方式排列脉冲的方向。将电极p1和p2设为正极(通过顶部igbt 24链接到hv)，将电极p7和p3设为负极(通过底部igbt 25链接到gnd)，得到在图8中标记为1的电场。使电极对的极性颠倒(即，p1和p2为负，且p7和p3为正)得到反向电场。使电极p1和p7为正极且电极p2和p3为负极得到在图8中标记为5的电场，标记为5的电场穿过标记为1的电场。同样，颠倒探测器极性会得到反向电场。对于其他可能性，依此类推。
127.癌细胞显示出特征性的分形图案，实体瘤由数百万个这样的细胞组成。实体瘤的几何形状可以建模为从扁圆形到扁长形的椭圆体。虽然小肿瘤可以在单个位置单次治疗，但对于尺寸大于电极之间距离的肿瘤，有必要围绕肿瘤表面旋转电极，以最大限度地提高细胞透化率和随后的治疗效果。在本文中描述的装置具有可用性和效率优势，因为该装置使电场围绕肿瘤表面旋转，从而减少了探测器重新定位步骤的数量。
128.此外，由于从单个位置在多个方向上跨越组织传送电场的均匀性，增加了细胞膜穿孔的可能性，从而最大限度地提高博来霉素(bleomycin)和顺铂(cisplatin)等化疗药物
的治疗效果、或与诸如钙、钾和基因疗法的其他疗法结合的治疗效果，因此临床上具有有效的优势。
129.此外，重要的是要注意，为了获得优化治疗效力，有必要在药代动力学峰值期间传送脉冲。该装置减少了电极需要重新定位的次数，且因此减少了跨越整个肿瘤表面传送脉冲的时间。如下文参考图19和20更详细地描述的，此外，通过使用电极可以沿电极长度的孔直接传送诸如治疗剂的物质，这有助于优化地确保物质正确和高效的传送。
130.此外，可以使用更温和的电场条件，因为这些电场可以围绕肿瘤表面旋转。
131.图8所示的方案基于以四边形排列的至少四个探测器电极，因此在它们之间的横向平面中限定了空间。限定四边形一边的两个电极为正极(例如，p1和p7)，而限定相对边的两个电极为负极(例如，p2和p3)，并且该状态即刻颠倒。然后，在正交方向上执行这个方案(例如，p7和p3为正，p1和p2为负)。对由电极p1-p6-p5-p7和探测器p5-p7-p3-p4限定的其他四边形重复相同的模式。当然，许多电极在不同的四边形中起不同作用。
132.该方案的效果是各电极26之间的组织被分成由四边形界定的三个区域，用穿过组织的四个近似正交的电荷方向全面治疗每个区域，如图8中的四边形内的箭头所示。
133.一般而言，控制器被配置为同时驱动具有相同电位(例如，1.5kv)的第一组(例如，p1、p7)探测器端子27和具有不同电位(例如，接地)的相对的第二组(例如，p2、p3)，用于跨越由第一和第二探测器位置限定的平面(例如，正交)和在该平面之间施加电荷。由于装置1用于驱动外部探测器组，因此它被编程为以预先设置的探测器位置驱动端子27。这种预先设置可以称为映射数据，其可以采取用于驱动方案的一系列指令的形式、或者可以指示物理位置。该预先设置可以来自对探测器的询问和/或来自使用者输入。
134.控制器有利地即刻跨平面颠倒方向，第一组被施加先前施加到第二组的电势且反之亦然，在其中，第一组和第二组被重新限定，使得跨越空间在一个方向上而后即刻颠倒地施加电荷。此外，在跨越平面方向颠倒之后，控制器驱动第三和第四组(例如，p1、p2和p3、p7)，它们也限定了平面，但第三和第四组之间的方向与第一和第二组之间的方向不同，在一个示例中，如p1-p2-p3-p7的四边形内的箭头所示地近似正交。
135.电穿孔方案的另一个有利方面是，为了将脉冲驱动到一对探测器，存在斜坡上升、平稳和斜坡下降序列。每个斜坡持续时间小于0.5μs并且通常小于0.25μs，这是由于所用开关的开通时间短以及它们由单独的驱动电路22驱动，每个驱动电路均专用于单独的开关，并且每个驱动电路由控制器单独寻址。因此，如果出于治疗目的，每个脉冲所需的最小持续时间例如为2μs，则所需的总持续时间仅为2.5μs，在此之后方向即刻颠倒。因此，在对于穿过组织的一根轴线的整个周期中，两个180
°
方向的总持续时间为5μs。通过如此快速地以180
°
切换方向，可以实现优化治疗，同时最大限度地减少因肌肉收缩引起的患者不适。在许多情况下，这将避免使用全身麻醉剂来治疗例如皮肤癌。为了改进结果，还可以在两个方向上正交地跨组织产生脉冲，同样持续时间为5μs。
136.参考图9，示出了驱动脉冲的主要参数。在这些示例中，这些参数的值如下。
137.表格1
[0138][0139]
在上表中，优选示例1。示例2和3是不同电极配置的示例，具有不同的深度和间隔间距，如表中列出。电极配置的这些差异导致更高的斜坡持续时间。正如在极端情况下所指出的，尽管这通常不是优选的，但斜坡下降值可能接近1μs，且优选斜坡持续时间小于0.5μs。
[0140]
参考图10，在表1中包含的实验(1000v，2μs双极脉冲)期间拍摄的一对相对电极的代表性脉冲的图像。由于电极的位置和土豆组织的阻抗，此图像上看不到δus。由于死区时间，存在小于1μs的微小延迟，以便在一对晶体管开通之前关断另一对晶体管(防止通过系统的直接短路)。电路设计使得这个死区时间最小化。示波器示出双极脉冲( 1000v,-1000v)，在其中斜坡上升时间和斜坡下降时间很急剧，并且电穿孔脉冲幅度在脉冲持续时间内维持在预期水平。可以在该图像中识别到图9的特征(u、tr、tf、u/2)。
[0141]
可以理解的是，多级变压器方法和输出开关在紧凑的外壳中提供高压/大电流和灵活极性控制。多级变压器还集成了探测器检测和自动参数设置，以确保针对于应用的安全传送剂量。
[0142]
开关模式变压器11/12在低压下高效操作，但在高压施加中，它们往往会受到设计折衷的影响。在本发明中，特别是通过以下方式避免了这个问题；
[0143]-使用变压器驱动电路，其设计用于在各种操作条件和部件间变化中实现低死区时间损耗；
[0144]-使用串联的n个次级绕组通过模块化电路vmod传送预定的电压vout，其中vout＝vmod*n；
[0145]-变压器铁芯材料和绕组材料的选择；
[0146]-使用反馈电路(8)来监测和维持该电压。
[0147]
可以理解，该装置产生安全有效的高压脉冲，以准确可靠地控制脉冲轮廓、时间、持续时间、极性和方向。特别有利的是确保了有效治疗而不引起灼伤或对不期望剂量的麻醉剂的需要。也有助于控制水平的是感测连接探测器，以自动确定其允许的操作参数和发生器参数的配置。特别有利的是该装置对探测器执行机器启动的询问，以验证兼容性并从
内部查找表中选择适当的脉冲生成轮廓。
[0148]
此外，在其他示例中，控制器2可以生成研究界面屏幕，该屏幕提供对在受控情况下可用的更多脉冲配置设置选项的访问。这允许研究人员将脉冲参数改变到探测器允许的最大值，以研究优化参数。
[0149]
装置使用示例
[0150]
如上所述的装置可用于不可逆电穿孔或可逆电穿孔的各种治疗方法。这些方法中的一些可以使用本领域已知的其他电穿孔装置进行，只要它们可以提供所示的电参数。
[0151]
如本说明书开头的介绍性段落所述，电穿孔是医学和分子生物学技术，用于向细胞或分子施加电场以增加细胞膜的渗透性，从而允许化学物质、药物或dna被引入细胞。电穿孔具有许多可能的医学应用领域，并且可以可逆地和不可逆地使用。在典型的电穿孔过程中，会产生短而强的电脉冲以瞬时透化细胞膜。
[0152]
在可用于例如化学疗法的可逆电穿孔中，电场低于电场阈值并允许细胞膜在治疗后修复。可逆电穿孔可以涉及允许诸如药物或基因的分子进入通常不能渗透该物质的细胞或分子中，而不诱导细胞死亡。对于细胞的电场阈值因细胞而异。
[0153]
在不可逆电穿孔(用于细胞消融)中，电场大于特定的电场阈值，这会在细胞膜中产生永久性纳米孔，破坏细胞稳态并因此迫使细胞诸如经由凋亡或坏死机制进入不可逆的细胞死亡途径。
[0154]
我们描述了电穿孔的方法，包括将探测器电极插入生物负载并将电压脉冲施加到电极和负载中以进行电穿孔的步骤，并且优选地，控制器以双极方式施加相对的探测器电极的脉冲。
[0155]
优选地，脉冲平稳(u)持续时间(δt)在1μs到5μs的范围内，优选1μs到3μs。优选地，脉冲平稳电压幅度(u)在100v/cm至3000v/cm、优选500v/cm至2000v/cm的范围内。可替代地，单独的脉冲长度可以小于1μs并且在0.03-0.99μs的范围内，脉冲平稳电压幅度(u)在5kv/cm至50kv/cm、优选10kv/cm至20kv/cm的范围内。
[0156]
优选地，主动治疗的通电开通时间(在其间探测器电极被脉冲化)在100μs至300μs的范围内，并且基于一个周期两个连续脉冲的双极脉冲频率在100khz至500khz的范围内。
[0157]
可以驱动电极以使探测器电极中的电流和生物负载小于500ma，以使dna迁移到透化细胞中。
[0158]
在一些示例中，存在不可逆电穿孔，在其中将诸如高渗溶液等液体溶液的物质注射到该部位以辅助细胞消融的过程，并且所述溶液可以包括钙或钾。优选地，钙离子(ca )以2mmol/l至250mmol/l范围内的浓度且优选2mmol/l至150mmol/l范围内的浓度直接注射到组织中。
[0159]
可以至少部分地选择物质的成分以在电极附近和电极之间产生期望水平的组织电导率。例如，该物质可以包括去离子水以降低电导率。可替代地或附加地，如下文参考图15至18更加详细地描述的，与电导率更强的液体溶液相比，该物质可以包括优先提高组织环境内的电阻(欧姆：ohm)的泡沫溶液。因此，在注射了泡沫溶液的组织中，在电穿孔脉冲的传送期间产生的电流(安培：amp)会降低，从而允许实现更安全和更有效的治疗。
[0160]
注射物质
[0161]
可以注射浓度在2mmol/l至150mmol/l之间的钙离子(ca )的溶液，通过电穿孔进
行瞬时透化，施加的脉冲电压为800v/cm和2000v/cm，脉冲平稳持续时间为1μs至3μs，以及脉冲数量在1000至10,000的范围内。含有钙离子的溶液只是一个示例。其他在下文中给出。
[0162]
在一个示例中，在可逆电穿孔中将dna传送至细胞，步骤如下：
[0163]
(a)将dna注射到该部位，
[0164]
(b)插入探测器电极，
[0165]
(c)向电极驱动脉冲以渗透细胞，所述驱动是例如在100khz和500khz范围内的频率的双极脉冲；脉冲平稳持续时间在1μs至5μs、优选1μs至3μs的范围内；以及电压幅度在100v/cm至3000v/cm范围内；以及
[0166]
(d)低频电极驱动，以低于5v的低压脉冲在10ms至100ms的脉冲持续时间的电泳阶段将dna或试剂吸入细胞。
[0167]
在dna传送的一个示例中，有：
[0168]
将dna注射到该部位，和/或
[0169]
传送一个或多个单极800v/cm至1600v/cm脉冲，然后
[0170]
用双极以高频hf处理，例如，频率在100khz和500khz范围内；脉冲平稳持续时间在1μs至5μs且优选1μs至3μs的范围内；和/或电压幅度在100v/cm至3000v/cm范围内；和/或
[0171]
传送一个或多个1v/cm至200v/cm单极脉冲。
[0172]
用于800v至1600v的较高压的单极脉冲(一个或多个)可以具有在50μs至250μs范围内且优选在100μs至200μs范围内的脉冲持续时间。电压更优选在1000v/cm至1200v/cm的范围内。
[0173]
在1v/cm到200v/cm的较低压下的单极脉冲(一个或多个)可以具有10ms至10s、优选20ms至100ms的脉冲持续时间。该电压优选在100v/cm至150v/cm的范围内。
[0174]
第二单极脉冲(一个或多个)优选地在第一单极脉冲(一个或多个)的1秒内被传送。
[0175]
在一个示例中，将药物注射到该部位并进行电穿孔以使药物(例如，化疗剂)迁移到细胞中以引起细胞消融。
[0176]
在一个示例中，控制器在电极的脉冲驱动之后，以接近于零持续时间的脉冲释放存储的电荷，然后是指数衰减。
[0177]
相对电极以1mm至30mm、更优选1mm至10mm、更优选2mm至8mm的间隔插入生物负载中。探测器电极可以是针状电极，但不是必须的。
[0178]
所使用的电穿孔装置的控制器被编程以提供以下范围内的高频操作参数。
[0179]
相对的探测器或电极的脉冲优选是双极的。
[0180]
频率(双极频率，正脉冲和负脉冲的周期)优选地在100khz至500khz的范围内。这在本说明书中被称为“高频”。这对应于大约1μs到5μs的脉冲长度(平稳)，但是对于许多用途，该范围更优选地在1μs到3μs的范围内，并且更优选为大约2μs。
[0181]
电压幅度在100v/cm至3000v/cm的范围内，且优选为大约800v/cm至2000v/cm。电穿孔脉冲在有高渗溶液或发泡剂的情况下可能是有效的，如下文详述。
[0182]
其中探测器电极被脉冲化的主动治疗的持续时间优选在0.1ms至1s、更优选0.2ms至10ms的范围内。
[0183]
在此持续时间内，脉冲以100μs至300μs范围内的脉冲群(通电一次)的形式传送。
例如，如果脉冲长度为2μs，则通电开通时间内将有大约25到75个脉冲周期。
[0184]
探测器中的电流小于1a、优选小于500ma。然而，电流是派生值，取决于生物负载。对于dna迁移到细胞中，电流更优选低于约500ma，但这对于其他方法不太重要。在一些示例中，当传送高频脉冲时，电流可以在5a至40a的范围内。对于dna传送，施加的电压优选小于5v，且电流小于1a。
[0185]
以任何众所周知的注射技术向部位提供药剂。
[0186]
液体注射：细胞消融的高渗治疗
[0187]
局部注射到靶组织的液体溶液有助于不可逆电穿孔和细胞死亡，并使较低的电压脉冲能够在上述高频驱动中有效。这样的溶液可以例如包括钙离子，以诱导细胞死亡。
[0188]
在一个示例中，钙离子(ca )以2mmol/l至150mmol/l范围内的浓度被肿瘤内注射，并且由于上述高频驱动优选在该范围的底端。
[0189]
液体注射：dna传送(可逆电穿孔)
[0190]
对于可逆电穿孔有：
[0191]
(a)将dna注射到部位。
[0192]
(b)插入探测器。
[0193]
(c)根据上述高频参数进行高频处理，使细胞透化。这被称为电穿孔阶段。
[0194]
(d)低频处理以将dna吸入细胞。这被称为电泳阶段。在这个阶段，有低于5v的低频低压脉冲，脉冲持续时间为10ms至100ms。这主要是由于dna负电荷实现了dna有效吸收到细胞中。
[0195]
液体注射：药物传送
[0196]
将药物注射到部位并进行电穿孔以使药物在细胞内被动扩散。在一个示例中，选择药物(例如，化疗剂)以引起细胞死亡(消融)。化疗剂的被动扩散通过高频电穿孔的作用实现并导致细胞死亡。例如，药物可以是博来霉素或顺铂。
[0197]
通常，对于药物传送，与dna传送不同，没有低频阶段(上述(d))。
[0198]
参考图11至13，这些图示出：
[0199]
高频与标准低频电穿孔脉冲在土豆组织上的影响作用，
[0200]
当与药物结合使用时，高频电穿孔与标准低频(脉冲长度约为100μs)在小鼠肿瘤模型中的影响作用，以及
[0201]
由于高频电穿孔，减少了肌肉收缩。
[0202]
图11至13的数据清楚地展示了在临床可控电压(《1500v)下能够吸收药物、离子和dna的有效结果。
[0203]
图11
[0204]
健康生物组织表征出与异常和癌前组织不同的电阻抗，即电流更容易流过异常和癌前组织，且因此测得的阻抗低于健康生物组织。
[0205]
在一些示例中，组织阻抗和组织阻抗的变化可以由装置通过频谱测量。这允许控制器自动修改其操作并生成使用者信息，以例如区分异常和癌前组织与健康组织。这是在脉冲传送之前和脉冲传送之后的治疗期间完成的，以提供诊断能力并且可以为作出治疗的医疗保健专业人员提供关于已治疗和待治疗的区域的可操作反馈。它还允许控制器自动调节电压电平以确保电流不会过大，从而自动避免显着降低阻抗的不利影响。
[0206]
控制器通过在合适的频谱上(典型地1khz至100khz)向组织施加交流(ac)信号来测量阻抗。这是在高频电穿孔驱动即刻之前和/或高频电穿孔驱动即刻之后完成的。
[0207]
图11示出了高频(2μs双极(约217khz))与低频(100μs单极(1hz)，70μs单极(1hz))电穿孔脉冲在土豆组织上的影响作用。它展示了使用土豆组织模型测量的组织阻抗。一对探测器针状电极以0.4cm的间隔插入，并测量电穿孔前后的组织阻抗(一式三份地进行实验)。
[0208]
使用以下参数监测阻抗变化：
[0209]-2μs双极(约217khz)，通电时间200微秒(50对)，1000v/cm，传送50次
[0210]-100μs单极(1hz)，1000v/cm，传送8次
[0211]-70μs单极(1hz)，1500v/cm，传送90次
[0212]
组织阻抗的变化是由离子门的打开和电穿孔脉冲后电解质释放到周围组织中引起的。它提供了电穿孔程度的指示。最大的delta变化发生在c组(右手曲线)的不可逆电穿孔参数中，变化为130，其次是a组(左手曲线)，变化为118。标准电穿孔参数作为药物传送的对照(b组)(中间曲线)提供了72的净变化。数据表明了用双极高频参数实现的组织电穿孔程度，尽管高频传送和观察到的肌肉收缩减少，但仍发生这种情况。该数据表明细胞透化，在其中左手曲线示出装置的高频操作实现了良好透化，同时避免了由于高频操作导致患者不适的风险。
[0213]
图12
[0214]
图12示出了当与药物组合时，高频(217khz，2μs脉冲平稳)与低频(1hz)电穿孔在小鼠肿瘤模型中的影响。
[0215]
示出了使用装置1对小鼠肿瘤结肠直肠模型进行临床前测试。肿瘤在小鼠中生长至0.1cm3，然后进行治疗。研究了四组，每组6只小鼠：
[0216]
a)对照组，不治疗，
[0217]
b)ect(电化学疗法)控制，
[0218]
c)含有博来霉素的epore(装置1)，和
[0219]
d)含有钙的epore(装置1)。
[0220]
ect对照(b)：标准电穿孔参数，直接注射博来霉素(250iu)，并使用总共8,100μs的极性脉冲，以1hz的频率传送，施加场强为1000v/cm。
[0221]
epore博来霉素(c)：脉冲以217khz的频率作为双极脉冲传送，直接注射博来霉素(250iu)。
[0222]
epore钙(d)：与上述epore博来霉素相同，但使用浓度为9mg/ml的肿瘤内注射钙且以217khz频率作为双极脉冲传送的脉冲。
[0223]
较短的斜坡时间(《0.25μs至1000v)能够更有效地直接通过细胞膜吸收大分子和离子(包括ca )，并以更高的频率允许更均匀的电场穿透细胞膜。
[0224]
在一个示例中，利用高频(》200khz)脉冲群与低电流(《1amp)脉冲相结合，实现了细胞膜对dna的吸收。1-2微秒长度的双极性方波高压高频脉冲群
×
50(通电时间为100-200μs)，在随后一分钟内是小于5v且《250μamps的单极性方波低压低电流脉冲，持续时间为1-10m。
[0225]
该装置导致增强的dna内吞作用和吸收，从而改进细胞转染和dna表达。
[0226]
在另一示例中，通过在传送高渗溶液时传送高频电脉冲(》200khz)来实现细胞死亡。这种溶液可以由蔗糖、甘油、木糖、甘露醇或果糖制成，浓度在125和300mmol/l之间。这样的解决方案还可以包括高达99mmol/l ca2 或mg2 或k 。
[0227]
在另一示例中，包含浓度至少为2mmol/l的钙离子(ca )的溶液，在其中通过500-1500v/cm的电穿孔进行瞬时透化；脉冲长度为0.1μs-3μs；脉冲数量为1000-10,000；且脉冲频率为200khz至500khz。
[0228]
图13
[0229]
该图示出了由于装置1的高频电穿孔导致的肌肉收缩减少。加速度数据是根据使用猪组织在电穿孔被传送至结肠直肠组织时计算的。观察肌肉收缩的条件是：使用1000v、2μs双极脉冲，每个脉冲(约217khz)之间有小于0.5μs的间隙；使用1000v、2μs双极脉冲，每个脉冲(125khz)之间有2μs的间隙；使用1000v(1hz)、100μs单极脉冲和使用1500v(1hz)、100μs单极脉冲。在217khz下观察到的峰值加速度为0.04g；在125hz下观察到的峰值加速度为0.08g；在1000v和100微秒下观察到的峰值加速度为0.75g；在1500v和100微秒下观察到的峰值加速度为0.83g。
[0230]
图14
[0231]
如上所述，该装置以斜坡上升、平稳和斜坡下降序列将脉冲驱动到一对探测器电极。由于所用开关的开通时间短以及它们由单独的驱动电路22驱动，每个斜坡持续时间小于0.5μs或优选小于0.25μs。
[0232]
在一个变型中，控制器驱动至少一些具有如上所述的斜坡上升的脉冲，然而在关断开关以实现脉冲之前将平稳期设置为0，从而实现指数衰减脉冲。电容器正常充电，然后启动脉冲，使其自由放电。如图14所示的衰减率由平衡电阻器15和电容器14的值控制。因此，控制器将电极驱动到u
max
的幅度，然后关断脉冲，即将脉冲持续时间设置为0。因此，在某些处理时间，电穿孔装置驱动具有衰减指数形状的脉冲。
[0233]
这个操作在高频操作之后展现益处。它有效地使电容器放电。
[0234]
图15
[0235]
使用碘化丙啶(pi)标记的流式细胞术用于确定电穿孔效率/细胞透化率与用作细胞缓冲液的培养基之间的关系。
[0236]
我们评估使用超短双极脉冲长度(2μs)的电穿孔在场强(v/cm)范围内诱导的细胞透化率，其中，使用标准等渗缓冲液(～270mosm/l)和含有甘露醇或蔗糖的高渗缓冲液(～600mosm/l)。
[0237]
以100v的间隔将场强(v/cm，电极间距)从500v/cm调节到1400v/cm，并确定pi吸收的程度，从而确定细胞透化。
[0238]
为了评估使用超短脉冲从体外传送至细胞的电穿孔的效力，我们使用了流式细胞仪(facscalibur
tm
，becton dickinson公司，美国)和荧光染料碘化丙啶(pi)，它仅在与dna结合后发出荧光。由于碘化丙啶的大小，活细胞膜对碘化丙啶是不可渗透的，因此可以检测到碘化丙啶进入被电穿孔的细胞以及随后与细胞核内的dna结合后发出的荧光。facscalibur
tm
装置能够量化单个细胞中的荧光，这取决于电穿孔的效力(即，由于电穿孔而在细胞膜上打开的孔的数量—允许pi进入细胞核，从而产生从细胞可检测的荧光)。
[0239]
带有cellquest
tm
软件的facscalibur
tm
流式细胞仪用于分析细胞大小和荧光。在
电穿孔实验完成期间获得细胞样品。简而言之，电穿孔与非电穿孔细胞的测量比率计算如下。“收集标准”设置在采集和存储对话框中“事件计数或时间”的位置，并选择采集时间。设置流速并调节“电压”、“安培增益”和阈值以确保可以检测到细胞。以线性模式收集前向散射(fsc)和侧向散射(ssc)，并且fl2(pi荧光)设置为对数模式。直到样品电压稳定后才能开始采集数据。每个数据点总共收集10,000个样本点(细胞)。阴性对照(未电穿孔的细胞)的fsc与fl2-h等值线图用于限定三个区域：代表完整细胞、细胞膜透化细胞和核膜透化细胞。低通道数的剩余事件被评分为碎片。
[0240]
泡沫注射
[0241]
该物质可以是泡沫的形式，是具有非常小气泡的液体。泡沫可用于增强电穿孔的渗透效果，对高频电穿孔(大于100khz)具有特别有益的效果。下面更详细地描述泡沫的使用。在本说明书中，诸如在注射器中装有空气和液体时，泡沫中的液体和气体的相对浓度用大气压下的体积来表示。
[0242]
泡沫可以通过任何合适的方式形成，并且实际上可以由临床医生在注射器中手动完成。
[0243]
使用泡沫直接注射到要电穿孔的靶组织的一个主要益处是，如果所选择的分子需要，泡沫可以充当载体，而相对于液体，泡沫对组织电导率的影响更佳，因为它可以最大限度地减少电导率。泡沫气泡的空气或气体成分相对于液体具有最小的电导率，并且能够提供更有利的环境，特别是在高频(》100khz)脉冲的情况下，最大限度地减少传送的电流并有助于增强细胞透化。
[0244]
使用高频(》100khz)双极电脉冲有利于直接细胞消融或用于分子被动扩散的细胞透化。在一些实施例中，与泡沫结合对程序的效力有益处(相对于使用对等的液体溶液)。
[0245]
图16示出了使用液体与泡沫的阻抗和电流比较。液体具有较低的阻抗(较高的电导率)并导致传送较高的电流(a)。另一方面，泡沫具有更高的阻抗/电阻和更低的电导率，导致传送的电流(a)更低。在使用泡沫的情况下，脉冲宽度可以在比上述更宽的范围内，在某些情况下在低至0.05μs的范围内，并且在某些情况下电压可以大于10kv/cm。
[0246]
在一个示例中，图17示出了当施加增加的电场(v/cm)时，细胞透化从0％到100％。与高电导缓冲液相比，使用低电导缓冲液使得细胞在较低的电场强度下被透化。我们的理解是，与使用相应的液体溶液相比，泡沫会在细胞周围产生较低的电导率。
[0247]
图18示出了预期的细胞在增加的电场(v/cm)下的存活率。与高电导缓冲液相比，低电导率会导致在较低场强下发生细胞死亡。
[0248]
注射时无泡沫的液体会被循环血量迅速稀释。与血液的相互作用降低了液体溶液的效力，因为与血浆蛋白的结合最终减少了活性分子的数量。另一方面，泡沫能够替代血液而不是与之混合，从而增加较高浓度的活性剂与组织的接触时间，从而产生更大的效力。对于泡沫，可以使用较低浓度的药剂来获得与其液体对应物相同的治疗效果，从而减少与较高浓度相关的副作用的发生率。
[0249]
由于存在诸如空气的气体气泡，泡沫的电导率低于相应的液体溶液，因此导致较低的电流、较高的细胞渗透性和较少的患者疼痛感。
[0250]
在一些示例中，可以通过混合白蛋白、气体和液体溶液来产生泡沫，例如以1:4:1的体积比混合。优选地，气体(例如，室内空气或co2气体)与液体的体积比在1:2至1:10的范
围内。
[0251]
优选地，使用的泡沫包括以下一种或多种：
[0252]
白蛋白，人血清白蛋白；体积浓度10-50％、优选15-30％；
[0253]
聚多卡醇(体积浓度0.5-5％)或十四烷基硫酸钠(sts)(体积浓度0.5-5％)。
[0254]
sts和聚多卡醇分别是硬化剂，而白蛋白不是。
[0255]
聚多卡醇也是局部麻醉剂。
[0256]
白蛋白只是发泡剂，而聚多卡醇和sts既是发泡剂又是硬化剂(它们是刺激物并直接诱导细胞死亡)。
[0257]
溶液中的活性剂(被引入的分子)可以包括以下一种或多种：
[0258]
钙离子，ca (2mmol至150mmol)；钾(2mmol至100mmol)；博来霉素；顺铂；dna；和/或rna。
[0259]
优选地，电穿孔脉冲有利地具有如下参数：
[0260]
双极脉冲，0.05μs至5μs脉冲长度，序列传送，每序列的“开通”通电时间为0.1μs至1000μs，以1khz至1000khz的频率重复多达1000次。
[0261]
将泡沫直接注射到细胞周围的环境中，而不是使用具有相同活性剂的纯液体物质，会导致电导率较差的环境，从而实现更高效的细胞透化，有助于提高基于电穿孔的治疗效果。
[0262]
由短双极电脉冲(《50μs)产生的细胞透化(在细胞膜上产生孔)的效力受组织电导率的影响。细胞周围的液体溶液的较高电导率将导致较高的电流，这对治疗有害，从而导致较差的细胞透化和患者的疼痛感。
[0263]
细胞周围电导率增加的部分原因是该区域的液体体积和电穿孔溶液的局部注射，电穿孔溶液可以包括选择的治疗分子(钙、钾、博来霉素、顺铂等)和高浓度的离子。
[0264]
利用发泡剂传送治疗剂可降低高电导率对电穿孔脉冲渗透细胞的效力的影响作用。
[0265]
主要由气体或空气制成的泡沫的电导率低于相应的液体溶液，且因此导致电流更低、细胞渗透性更高和患者的疼痛感更小。
[0266]
泡沫注射到待电穿孔的环境中将通过不将电导率提高到可比较的液体溶液的程度而有利地促进治疗和细胞透化程度。下表列出了注射泡沫的一些优选参数范围，但这些范围有利地适用于液体注射。
[0267][0268]
还可以使用泡沫来促进局部麻醉剂分散到待治疗的组织中。局部麻醉剂可以是5-20mg/ml的利多卡因，有或没有肾上腺素。10到30mg/ml的甲哌卡因是另一个可以使用的局部麻醉剂的示例。泡沫和局部麻醉剂可以与所选择的分子(例如，钙或钾离子、博来霉素、dna)结合施用；或者可以单独提供。
[0269]
物质注射装置(仅液体或泡沫)
[0270]
参考图19，注射装置用于通过针状电极将物质传送至靶组织，该针状电极还可以促进注射物质通过“孔”或沿其导通长度的开口均匀分布。在一个示例中，装置200包括容器201和具有壁203和孔204的针202的阵列。容器201包括任何所需类型的泵，例如蠕动泵或注射器。针规尺寸优选在14ga至30ga(外径0.3mm至2.1mm；内径0.15mm至1.8mm)的范围内。更一般地，优选针具有在0.1mm至1.8mm范围内的最大内部宽度尺寸和在0.25mm至2.5mm范围内的最大外部宽度尺寸。90，优选地，开口的最大宽度尺寸在0.05mm至1.5mm的范围内，并且优选地，针与最近的针的间隔在2mm至3cm的范围内。
[0271]
在其他示例中，开口可以是任何期望形状的狭槽或孔的形式，以实现注射物质的期望流动和分布。针可以具有绝缘套管以覆盖开口和/或在不向患者组织施加电压的地方电绝缘。可以在物质传送之后和进行脉冲之前移除套管，无论套管是否绝缘。开口的图案优选是如图19所示的螺旋形(交错的)。开口的数量可能分布不均，朝向于面向其他针(一个或多个)/电极(一个或多个)的针侧更多，以有助于确保大部分体积分布在各电极之间的空间中。深度指示器可用于发送开口相对于组织深度的深度。
[0272]
探测器头部200可以与如上所述的脉冲发生器一起使用，或者与已知的第三方电穿孔发生器一起使用。
[0273]
针可以全部被连接到相同的泵或容器，或者可以具有独立的泵或阀调布置，以允许通过不同的针传送不同的物质。一根或多根针可能有自己的实心套针尖端。
[0274]
注射的物质可以是泡沫，但也可以是纯液体物质，例如非电导物质，例如，去离子水。
[0275]
测试数据表明，在可行的测试组织(动物肝脏)中，我们评估了在电压增加的电穿
孔脉冲传送期间产生的电流。脉冲的总通电“开通时间”为6ms。当在脉冲之前将泡沫注射到组织中时，每个脉冲产生的电流减少大约40％。图20示出，在测试中，对于给定的脉冲电压幅度，电穿孔电流显着降低。在此关系图中，电流单位为安培。
[0276]
通过使用图19的探测器，电极传送电脉冲并且还经由孔204将物质(仅液体或泡沫)传送至组织。这使得能够在电极周围的环境中更均匀地传送物质。此外，探测器允许应用协调的物质传送和脉冲方法，该方法可以通过电子控制器以优化方式控制，该电子控制器指示脉冲发生器和泵和/或阀将物质传送至针。例如，在一种编程方法中，先注射以提供所需的电导率水平，然后进行脉冲，而后再注射通向已穿孔的细胞。第一种物质可以是具有相对高水平气泡的泡沫，并且脉冲后溶液可以包含治疗剂，例如钙、钾、博来霉素或顺铂或dna或rna。
[0277]
在电穿孔脉冲传送之前，孔204将泡沫或其他物质(诸如非电导溶液，例如去离子水)直接传送到组织中，这样做会减少以其他方式会产生的电流。在手术期间产生的较高电流将对电穿孔脉冲对组织进行穿孔的效力产生负面影响。大电流的产生也给保护患者和发生器带来了技术和安全挑战，例如电流“电弧”、组织燃烧和手术完成之前的脉冲终止。
[0278]
具有孔204的针状电极202可用于在传送电脉冲之前传送非电导溶液；此外，一旦电脉冲被传送，相同的电极可用于即刻给予治疗溶液。在实践中，例如针状电极(一个或多个)定位在靶组织中，并且部分地基于阻抗反馈，通过针状电极(一个或多个)中的孔将泡沫(或其他溶液)直接注射到靶组织中。这之后即刻通过相同的针状电极传送电脉冲，并且可以直接通过针状电极进行电穿孔后注射治疗物质，例如钙或化学治疗溶液。
[0279]
这优化了电穿孔脉冲的效果，同时还能够将治疗物质直接传送至靶组织中。
[0280]
在图19的示例中，有两个电极，正极和负极。在其他示例中，可能存在双极单个电极，其中负极性和正极性在同一电极上传送。可替代地，在一个阵列中可以有超过2个电极，例如上文参考图8所描述的。
[0281]
益处
[0282]
一般而言，应当理解，本发明实现了非常有效的电穿孔，同时患者不适的风险最小。下面总结了一些益处。
[0283]
dna吸收得到改进，特别是如上所述的在初始高频高压脉冲(100khz至500khz；800v/cm至1600v/cm双极)之后是低频和低压脉冲。特别有利的是，由于高压脉冲的高频特性，它对患者来说是无痛的。该装置提供高频脉冲，目的是使细胞膜和内部细胞器透化，单独或与局部注射的药剂/分子结合引起消融。我们已经描述了钙的吸收，以液体或泡沫形式注射的钙的低浓度在2至150mmol/l的范围内、优选接近该范围的下限。此外，高频脉冲通过利用待治疗环境中的泡沫产生减小的电流。
[0284]
可以理解的是，该装置实现了向人类或动物受试者安全传输高压、超短脉冲(0.1μs至5.0μs范围)，同时消除了开关模式变压器设计固有的低效率。
[0285]
该装置还实现了将超短脉冲(微秒的)传送至高渗溶液中，从而实现更有效的细胞电穿孔。
[0286]
此外，该装置能够将超短脉冲(微秒的)与急剧的开通和关断时间相结合，以最大限度地发挥协同作用，随后在10-500μf的范围内进行电容放电，从而诱导局部细胞死亡。特别有益的是，平稳期在1μs至3μs的显着但短暂的持续时间内是稳定的，从而在短时间通电
开通中实现非常有效的治疗。
[0287]
并且，该装置和方法实现了具有足够大电场的组织的准确覆盖，避免了肿瘤组织由于其异质性而导致的电场分布不均匀的问题。
[0288]
通过使用注射到组织中的适当物质，例如去离子液体和/或泡沫，实现了较低的电导率。电导率越低，电场越强，因为电场在组织中的分布是由通过组织的电流决定的，因此上述方法和装置有助于产生更均匀的电场，导致更一致的结果。
[0289]
本发明不限于所描述的实施例，而是可以在结构和细节上改变。