一种海参多肽及其提取方法与应用与流程

1.本发明涉及海参加工技术领域，具体地涉及一种海参多肽及其提取方法、以及该方法提取的海参多肽的应用。
技术背景
2.海参(sea cucumber)是我国传统的海产珍品及滋补食品,近年来其营养功能日益受到重视,需求量不断增加,已成为我国重要的经济水产品。现已证明,海参含有胶原蛋白、多糖、多肽等多种功效成分,利用各种功效成分开发功能食品已经成为海参精深加工的重要方向。其中,由海参体壁中的胶原蛋白经降解制得的海参多肽具有良好的溶解性和稳定性,能够发挥抗氧化、提高免疫力、抗疲劳、延缓衰老、降血压、预防心脑血管疾病等一系列作用，在功能食品开发方面展现出良好的应用前景。
3.海参加工过程中，提取各种有效活性物质之后的酶解醇沉上清液副产物，一般将其回收乙醇后作为废弃物不再利用，造成环境污染和资源的浪费，但是其中还富含可进一步回收的有效活性成分，对这些废液进行处理，不仅可以减轻对环境的污染，同时可以从该海参副产物中可以提取海参多肽等具有药用价值和保健作用的产品。为了尽可能的环保和高效利用海参副产物废液，需要开发操作简单，高效，适于工业化且对环境友好的提取方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种利用海参副产物提取海参多肽的方法。本方法操作简单，适合工业生产海参副产物回收利用，降低了企业生产成本，提高海参资源的利用率。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.一种海参多肽的提取方法，包括以下步骤：
6.(1)海参多肽粗品的提取：取海参副产物(海参酶解醇沉上清液)，减压浓缩至浸膏密度为1.1-1.3g/ml，加去离子水溶解后，离心取清液，上清液经中空纤维柱超滤，取超滤截留液，减压浓缩后冷冻干燥，得海参多肽粗品；
7.(2)海参多肽粗品精制：将上述海参多肽粗品用去离子水溶解，上已预处理好的大孔树脂柱，依次用去离子水和乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液，减压浓缩后冷冻干燥即得海参多肽。
8.所述步骤(1)中，所述海参副产物(酶解醇沉上清液)是指海参经过酶解、离心分离清液经乙醇醇沉处理的醇沉上清液。
9.优选地，所述步骤(1)中，所述海参副产物(酶解醇沉上清液)的制备方法为：取粉碎后的干燥海参，加入8-10倍海参重量的去离子水，质量分数为1％-3％的木瓜蛋白酶，50℃-55℃酶解6-8h，酶解液煮沸灭活，离心机离心取上清液，加乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为60％-70％(v/v)，静置8h以上，离心机离心取上清液。
10.优选地，所述步骤(1)中，减压浓缩温度≤80℃，真空度≤-0.08mpa，海参副产物浸
膏相对密度为1.1-1.3g/ml。
11.优选地，所述步骤(1)中，溶解海参副产物浸膏加入的去离子水量为浸膏重量的1.5-3.5倍。
12.优选地，所述步骤(1)中，离心条件为4000-15000rpm。
13.优选地，所述步骤(1)中，超滤条件为：5kd中空纤维柱，回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数；超滤行为持续至超滤截留液、透过液cl-均为阴性。
14.优选地，步骤(1)所述的取超滤截留液时减压浓缩条件为：温度≤60℃，真空度≤-0.085mpa。
15.优选地，所述步骤(2)中，所述大孔树脂柱选自：d101型大孔树脂柱、d204型大孔树脂柱和ab-8型大孔树脂柱，优选地，所述大孔树脂柱为ab-8型大孔树脂柱。
16.优选地，步骤(2)所述的减压干燥条件为：温度≤80℃，真空度≤-0.08mpa。
17.有益效果：海参多肽提取方法的现有的技术中多加入多种有机试剂，会损害人体健康，并造成环境污染等，不适合工业化生产，不符合绿色可持续发展理念；本发明采用酶解、醇沉、离心、超滤、减压干燥、柱层析纯化以及冷冻干燥等工艺对海参提取的过程副产物进行海参多肽的回收，提高了海参的资源利用率，节省了生产成本，又减少环境污染。并且经实验验证，该方法提取的多肽具有明显的抗疲劳作用。除此之外，海参多肽具有抗氧化性、提高免疫力、降血压、抗菌、抗肿瘤、抗疲劳以及降血糖等功能，在功能食品开发方面展现出良好的应用前景。
具体实施方式
18.下文结合具体实施例来详细说明本发明内容，但这些具体实施例对本发明的权利要求的范围不构成任何限制。
19.材料与试剂
20.5kd中空纤维柱：北京旭邦膜设备有限责任公司，003w型。
21.d101型大孔树脂柱：天津允开树脂科技有限公司，1kg/袋。
22.d204型大孔树脂柱：郑州勤实科技有限公司，500g/瓶。
23.ab-8型大孔树脂柱：天津允开树脂科技有限公司，1kg/袋。
24.其他试剂均为市售产品。
25.小鼠：昆明种小鼠，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。
26.实施例1
27.一种海参多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
28.(1)海参副产物的制备：称取30kg粉碎后的干燥糙海参，分别加入8倍海参重量的去离子水，质量分数为1％的木瓜蛋白酶，50℃酶解6h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得220l上清液，加377l 95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为60％(v/v)，静置8h以上，离心机离心得590l上清液，即为海参副产物。
29.(2)海参多肽粗品提取：将原药材是糙海参的海参副产物，在温度为60℃，真空度为≤-0.08mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.1g/ml，用海参副产物浸膏重量1.5倍的去离子水溶解，8000rpm，15min离心，取上清液；经5kd中空纤维柱超滤，超滤条件
为：回流压≤0.1mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数，超滤行为持续至超滤截留液、透过液cl-均为阴性，取超滤截留液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085mpa)并冷冻干燥，得海参多肽粗品1.764kg，得率为5.88％。
30.(3)海参多肽粗品精制：将上述海参多肽粗品用去离子水溶解，均分成三份，分别命名为样1、样2和样3，处理如下：
31.样1上已预处理好的d101型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积55％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液；
32.样2上已预处理好的d204型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积55％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液；
33.样3上已预处理好的ab-8型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积60％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液。
34.(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压浓缩后冷冻干燥，即得海参多肽；样1的海参多肽0.285kg，得率为2.85％；样2的海参多肽0.309kg，得率为3.09％；样3的海参多肽0.312kg，得率为3.12％。
35.实施例2
36.一种海参多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
37.(1)海参副产物的制备：称取30kg粉碎后的干燥梅花参，分别加入10倍海参重量的去离子水，质量分数为1.5％的木瓜蛋白酶，55℃酶解6h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得230l上清液，加395l 95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为62％(v/v)，静置8h以上，离心机离心得620l上清液，即为海参副产物。
38.(2)海参多肽粗品提取：将原药材是梅花参的海参副产物，在温度为70℃，真空度为≤-0.08mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.2g/ml，用海参副产物浸膏重量2.5倍的去离子水溶解，10000rpm，18min离心，取上清液；经5kd中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.15mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数，超滤行为持续至超滤截留液、透过液cl-均为阴性，取超滤截留液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085mpa)并冷冻干燥，得海参多肽粗品1.839kg，得率为6.13％。
39.(3)海参多肽粗品精制：将上述海参多肽粗品用去离子水溶解，均分成三份，分别命名为样4、样5和样6，处理如下：
40.样4上已预处理好的d101型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积55％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液；
41.样5上已预处理好的d204型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积55％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液；
42.样6上已预处理好的ab-8型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积60％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液。
43.(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压浓缩后冷冻干燥，即得海参多肽；样4的海参多肽0.304kg，得率为3.04％；样5的海参多肽0.326kg，得率为3.26％；样6的海参多肽0.317kg，得率为3.17％。
44.实施例3
45.一种海参多肽的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
46.(1)海参副产物的制备：称取30kg粉碎后的干燥象牙参，分别加入8倍海参重量的去离子水，质量分数为1％的木瓜蛋白酶，52℃酶解8h，酶解液煮沸灭活，离心机离心得224l上清液，加384l 95％乙醇溶液进行醇沉处理，使乙醇终浓度为65％(v/v)，静置8h以上，离心机离心得600l上清液，即为海参副产物。
47.(2)海参多肽粗品提取：将原药材是象牙参的海参副产物，在温度为80℃，真空度为≤-0.08mpa的条件下，减压浓缩至海参副产物浸膏密度为1.3g/ml，用海参副产物浸膏重量3.5倍的去离子水溶解，8000rpm，15min离心，取上清液；经5kd中空纤维柱超滤，超滤条件为：回流压≤0.1mpa，超滤截留液体积至超滤前二分之一时，开始补去离子水，补至超滤前的液体体积数，超滤行为持续至超滤截留液、透过液cl-均为阴性，取超滤截留液，减压浓缩(温度50℃、真空度≤-0.085mpa)并冷冻干燥，得海参多肽粗品1.815kg，得率为6.05％。
48.(3)海参多肽粗品精制：将上述海参多肽粗品用去离子水溶解，均分成三份，分别命名为样7、样8和样9，处理如下：
49.样7上已预处理好的d101型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积55％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液；
50.样8上已预处理好的d204型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积55％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液；
51.样9上已预处理好的ab-8型大孔树脂柱，依次用3倍柱床体积去离子水和3倍柱床体积60％乙醇溶液洗脱，收集乙醇洗脱液。
52.(4)分别将上述三个样品的乙醇洗脱液减压浓缩后冷冻干燥，即得海参多肽；样7的海参多肽0.297kg，得率为2.97％；样8的海参多肽0.315kg，得率为3.15％；样9的海参多肽0.320kg，得率为3.20％。
53.实施例4
54.取上述实施例1、2和3的海参多肽样品，用folin-酚法检测其多肽含量；三个实施例的海参多肽得率及多肽含量如表1。
55.表1：海参副产物中海参多肽得率及多肽含量
[0056][0057]
实施例5海参多肽的抗疲劳活性试验
[0058]
取实验室常规饲养的昆明种小鼠，体重18-22g，按体重随机分成4组，每组8只，雌雄各半，作为对照组、海参多肽低剂量组、海参多肽中剂量组合海参多肽高剂量组(海参多肽样品采用实施例3样9方法制备所得)。小鼠适应性饲养7天后灌胃。海参多肽低、中、高剂量组每天灌胃剂量分别为3.22mg/0.5ml/20g体重、6.44mg/0.5ml/20g体重、12.88mg/0.5ml/20g体重；对照组给予同体积的双蒸水，连续给予受试物28天后，分别进行负重游泳实验和转棒实验。
[0059]
(1)负重游泳实验：第28天给予受试物30min后，给小鼠尾部绑上其体重5％重量的铅丝，将小鼠防御水深为30cm，水温为25
±
1℃的游泳池内游泳，记录自游泳开始至头部全部沉入水中8秒不能浮出水面的时间为游泳时间。
[0060]
(2)转棒实验：在转速为36转/min，时间30min的条件下训练2天。第3天在给予受试物30min后，将小鼠放在转棒仪的棒上，按(转速：36转/min，时间：45min)进行转棒实验。转棒仪将自动记录小鼠从开始到从棒上跌落下来的时间，即作为转棒时间。
[0061]
不同剂量组的海参肽对小鼠游泳时间和转棒时间的影响结果见表2。
[0062]
表2：海参多肽对小鼠负重游泳和转棒时间的影响
[0063][0064]
注：
*
表示与对照组相比，p＜0.05，差异显著；
**
表示与对照组相比，p＜0.01，差异及其显著。
[0065]
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强的最直接、最客观的指标，游泳时间和转棒时间的长短可以反映动物运动疲劳的程度。从表2数据可以得出：与对照组相比，实验组的小鼠负重游泳和转棒时间明显延长，并随灌胃剂量的提高而延长(正相关)，其中高剂量组的游泳时间和转棒时间比对照组提高了一倍以上。表明海参多肽能明显延长受试小鼠的负重游泳时间和转棒时间，反映其具有抗疲劳作用。