网膜素在制备炎症性肠病治疗药物中的应用

csf mrna。
17.网膜素检测剂在制备炎症性肠病检测制剂中的应用。
18.本发明的有益效果是：
19.网膜素减少葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的结肠炎肠道炎性因子的分泌，有效改善肠道炎症；也给出了新的检测方式。同时，也针对网膜素的调节给出了相应的方案。
附图说明
20.图1为omentin在急性dss结肠炎小鼠肠道组织和血清表达情况图表；
21.图2为omentin改善急性dss结肠炎小鼠体重和结肠长度的变化程度；
22.图3为omentin减少急性dss结肠炎小鼠肠道炎性细胞因子分泌。
具体实施方式
23.本部分第一方面对网膜素的应用进行说明：
24.其中之一，网膜素在制备防治炎症性肠病药物中的应用。
25.在一些方式中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
26.在一些方式中，所述炎症性肠病为dss结肠炎(葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎)。
27.其中之二，网膜素在制备抑制结肠炎肠道炎性因子分泌制剂中的应用。
28.在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子至少为il-1β、il-1α、tnf-α、il-6、il-17、gm-csf mrna中之一。
29.在一些方式中，所述结肠炎肠道炎性因子分泌为葡聚糖硫酸钠诱导型结肠炎肠道炎性因子分泌。
30.其中之三，网膜素在制备抑制结肠炎肠道炎性因子分泌制剂中的应用。本部分第二方面对网膜素的调节进行说明：
31.肠道炎性细胞因子在制备抑制网膜素表达制剂中的应用。
32.通过肠道炎性细胞因子能够实现降低网膜素的表达行为，从而在一些场景中，实现对网膜素的调节作用。比如：在商业性网膜素性质研究实验中，为了研究网膜素表达影响条件，此时利用肠道炎性细胞因子进行调节。
33.在一些方式中，所述肠道炎性细胞因子包括l-1β、il-1α、tnf-α、il-6、il-17、gm-csf mrna。当然，其他能够影响网膜素表达的细胞因子也应当在本发明保护范围内。
34.网膜素检测剂在制备炎症性肠病检测制剂中的应用。通过检测疑似炎症性肠病待检物中网膜素水平，可以一定程度上对炎症性肠病进行表征。
35.本部分第三方面结合一具体研究项目进行说明：
36.1.材料
37.1.1动物：雄性6-8周c57bl/6j小鼠(购于北京维通利华公司)，于spf环境下饲养；
38.1.2试剂:网膜素(omentin human e.coli)，购买于欧洲biovender公司，294个氨基酸，32.7kda，纯度：》90％，内毒素《1.0eu/μg；mouse itln1(intelectin 1/omentin)elisakit，购买于武汉elabscience公司。
39.2.方法
40.2.1构建dss诱导的急性结肠炎模型及omentin干预
41.分组：雄性c57bl/6j小鼠18只，随机分为对照组、dss组、dss 网膜素组，每组6只，小鼠于spf级动物实验中心适应性喂养后，进行后续实验；
42.干预：
43.对照组：自由饮用正常水7天，每天每只小鼠腹腔注射200ul pbs溶液；
44.dss组：小鼠自由饮用3％dss溶液7天，每天每只小鼠腹腔注射200ul pbs溶液；
45.dss omentin组：小鼠自由饮用3％dss溶液7天，每天每只小鼠腹腔注射0.5ug网膜素；
46.一般情况记录：造模开始后，每天记录小鼠的体重、大便的性状(正常、糊状便还是稀水样便)及带血情况(无、隐血还是明显肉眼血便)和活动情况(活跃还是倦怠)等。
47.小鼠处死及标本的收集：于造模第7天处死，戊巴比妥钠腹腔麻醉小鼠后进行眼球取血，离心，留取血清储存于-80℃冰箱，备用。沿腹中线打开腹腔，测量完整直结肠长度并称取脾脏重量。清洁结肠粪便，留取结肠组织于-80℃冰箱中，用于后续实验。
48.2.2rt-qpcr
49.①
组织rna的提取
50.取高压灭菌2ml ep管，编号，每个ep管加入磁珠2颗和1ml trizol溶液，剪取10mg结肠组织放入相应的ep管中，置于研磨仪上匀浆，65hz、120s、2次；
51.向组织匀浆液中加入200ul氯仿，用力剧烈振荡ep管15s，待溶液呈粉红色后，室温静置5min；
52.离心：4℃、12000rpm、15min，匀浆液分为三层，其中上层无色溶液为rna相；
53.吸取300ul上层无色溶液至新的ep管，加入300ul异丙醇，轻轻上下颠倒ep管充分混匀后，室温静置5min，4℃、12000rpm、15min离心，ep管底部可见rna沉淀；
54.小心弃去上清后，缓慢地沿ep管壁加入预冷的75％乙醇1ml，轻轻上下颠倒洗涤ep管壁，4℃、12000rpm、5min离心；
55.小心弃去上清后，将ep管倒置于滤纸上，干燥rna沉淀5min；
56.根据rna沉淀量，加入适量的rnase-free水溶解沉淀，用移液枪轻轻吹打沉淀使其充分溶解；
57.rna浓度检测：使用分光光度计测定rna浓度。ddh2o清洗比色杯光滑面内外多次，加入100ul ddh2o调零。加2ul待测样本和98ul ddh2o于比色杯中，记录读数和a260/a280，最终rna浓度(ug/ml)＝读数
×
100。
58.②
逆转录
59.根据扩增反应体系和rna浓度计算所需的rna和depc水体积；
60.如10ul体系：rna-primermix(5x)2ul rna待测样品(1/浓度*1000)ul depc水(10-2-vrna)(ul)；
61.准备rna-primer mix、rna待测样品、depc水，瞬离；根据以上体系，计算各成分的体积，分别加入0.5mlep管，瞬离；
62.逆转录：在逆转录仪器中进行逆转录，37℃15min，85℃15sec，得到相应cdna，保存于-20℃冰箱。
63.③
rt-qpcr
64.配扩增反应体系：引物体系sybr green 5ul 引物1ul，目的基因体系cdna 1ul
ddh2o 3ul；
65.加样：根据实验需求，设计加样的形式，并在96孔板上做相应的记号，分别在每孔侧壁上加入6ul引物体系和4ul目的基因体系，加样完毕后用封板膜封闭96孔板并离心。
66.扩增：将96孔板放入pcr仪中，设定程序扩增，95℃10min—95℃30s—60℃30s—72℃1min，重复40个循环进行扩增；
67.结果分析：以β-actin作为内参基因，采用2
‑△△
ct方法，计算分析各组目的基因相较于对照组的表达情况。
68.引物序列：
69.mouseβ-actin:forward——agtgtgacgttgacatccgta，reverse——gccagagcagtaatctccttct；
70.mouse omentin:forward——agtgcagctgaagagaacct，reverse——acttcccacgcatgttgttc；
71.mouse il-1α:forward——cgaagactacagttctgccatt，reverse——gacgtttcagaggttctcagag；
72.mouse il-1β:forward——cctcgtgctgtcggacccata，reverse——caggcttgtgctctgcttgtga；
73.mouse tnfα:forward——tactgaacttcggggtgattggtcc，reverse——cagccttgtcccttgaagagaacc；
74.mouse il-6:forward——tagtccttcctaccccaatttcc，reverse——ttggtccttagccactccttc；
75.mouse il-17:forward——cagcagcgatcatccctcaaag，reverse——caggaccaggatctcttgctg；
76.mouse gm-csf:forward——gccatcaaagaagccctgaa，reverse——gtgaaattgccccgtagacc。
77.2.3elisa
78.①
提前20分钟取出板子，准备标准品和样品。
79.②
对应板孔中加入100ul标准品工作液或样本,37℃孵育90分钟；
80.③
弃掉板内液体后，立即加入100ul生物素化抗体工作液，37℃孵育60分钟；
81.④
弃掉板内液体，洗板3次；
82.⑤
每孔加入100ul hrp酶结合物工作液，37℃孵育30分钟，弃掉板内液体，洗板5次；
83.⑥
每孔加入90ul底物溶液，37℃孵育15分钟左右；
84.⑦
每孔加入50ul终止液；
85.⑧
立即在450nm波长下读数，处理数据，建立标准曲线，计算各个样本血清omentin含量。
86.3.统计分析
87.使用graphpad prism 8.0进行实验数据分析及绘图，结果用均数
±
标准误表示。根据变量的类型及分组的数目，组间差异分析采用单因素方差分析(one-wayanova)或t检验。p《0.05时认为组间差异具有统计学意义。
88.4.结果及分析
89.①
omentin在急性dss结肠炎小鼠肠道组织和血清表达情况
90.构建急性dss结肠炎(葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎)小鼠模型，具体见方法部分。rt-qpcr检测两组小鼠肠道组织omentin mrna水平，elisa检测两组小鼠血清omentin水平。如图1所示，dss组小鼠肠道组织和血清中omentin水平较对照组显著下降，差异有统计学意义，说明omentin在急性dss结肠炎小鼠肠道组织和血清表达下降。
91.②
omentin改善急性dss结肠炎小鼠体重和结肠长度的变化程度
92.使用omentin干预急性dss结肠炎小鼠，具体分组及操作见方法部分。测量并计算每只小鼠每日体重与第0天该小鼠体重的比值，并计算各组平均值和标准差。如图2所示，使用omentin干预组小鼠的平均体重较dss组重，差异具有统计学意义。此外，omentin干预组小鼠的平均结肠长度较dss组长，且具有统计学意义，说明omentin减轻急性dss结肠炎小鼠肠道炎症，具体表现在其可降低急性dss结肠炎小鼠模型的体重降低程度和结肠缩短程度。
93.③
omentin减少急性dss结肠炎小鼠肠道炎性细胞因子分泌
94.使用rt-qpcr检测各组小鼠肠道组织炎性细胞因子il-1β、il-1α、tnf-α、il-6、il-17、gm-csf mrna水平。柱高表示mrna水平与内参基因β-actin的比值平均值，柱上方的横线与柱的距离表示标准差。如图3所示，与dss组相比，omentin干预组小鼠il 1β、il 1α、tnfα、il-6、il 17、gm-csf mrna水平下降，差异有统计学意义，进一步从基因表达的角度证明omentin可减轻减轻急性dss结肠炎小鼠肠道炎症。
95.本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。