一种促毛囊再生用真皮层、人工皮肤及其制备方法与流程

1.本发明属于人工皮肤技术领域，特别涉及一种促毛囊再生用真皮层、人工皮肤及其制备方法。


背景技术：

2.大面积烧伤和慢性溃疡的修复和再生，一直是全层创面修复的一个长期临床难题。在这类伤口的治疗中，自体移植被认为是最优解；但当皮肤缺损超过体表面积的50％-60％时，用于移植的完整皮肤的可用性有限，且这种移植缺乏完整的真皮往往导致瘢痕和瘢痕疙瘩形成的增加，尤其是儿童。组织工程皮肤移植能够迅速闭合伤口，防止脱水和感染，而不受组织可用性的限制，是一种极佳的自体移植的替代品。然而，由于成年人的自我修复能力有限和在皮肤移植中缺乏皮肤附属物结构，许多皮肤附属物如毛囊、皮脂腺和汗腺的再生还有待实现。


技术实现要素：

3.本技术的目的在于提供一种促毛囊再生用真皮层、人工皮肤及其制备方法，以解决目前的人工皮肤治疗后毛囊和腺体难以再生的问题。
4.本发明实施例提供了一种促毛囊再生用真皮层，所述真皮层的原料包括：胶原蛋白、yap蛋白抑制剂和生长因子微球。
5.可选的，所述yap蛋白抑制剂包括阿卡地新磷酸盐、阿卡地新和细胞松弛素d中的至少一种。
6.可选的，所述生长因子微球中的生长因子包括：肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、角质形成细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种；
7.所述生长因子微球的微球基体的材质为明胶。
8.可选的，以质量份数计，所述真皮层的原料包括：胶原蛋白0.5-1.5份、yap蛋白抑制剂0.01-0.05份和生长因子微球0.1-0.5份。
9.基于同一发明构思，本发明实施例还提供了一种如上所述的促毛囊再生用真皮层的制备方法，所述方法包括：
10.将胶原蛋白进行溶解，得到胶原蛋白溶液；
11.将生长因子和微球基体混合，得到生长因子微球；
12.将所述胶原蛋白溶液、所述生长因子微球和yap蛋白抑制剂进行混合，得到混合物；
13.将所述混合物进行成型，后进行冷冻干燥，得到真皮层。
14.基于同一发明构思，本发明实施例还提供了一种促毛囊再生用人工皮肤，所述人工皮肤包括真皮层，所述真皮层为如上所述的真皮层。
15.可选的，所述人工皮肤还包括表皮层，所述真皮层敷设于所述表皮层下方，所述表
皮层为热敏性复合膜。
16.可选的，所述热敏性复合膜的原料包括：明胶和硅橡胶薄膜。
17.基于同一发明构思，本发明实施例还提供了一种如上所述的促毛囊再生用人工皮肤的制备方法，所述方法包括：
18.将真皮层和表皮层进行粘合，得到人工皮肤。
19.可选的，所述粘合的粘接剂包括明胶、海藻酸钠和液态硅橡胶中的至少一种。
20.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
21.本发明实施例提供的真皮层，通过采用yap蛋白抑制剂有效阻断伤口中锯齿状蛋白基因激活，从而使次生皮肤成分(毛囊和腺体)的恢复、细胞外基质结构和拉伸强度与未受伤皮肤没有区别。
22.上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其它目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举本发明的具体实施方式。
附图说明
23.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
24.图1是本发明实施例提供的方法的流程图。
具体实施方式
25.下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
26.在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
27.除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
28.本技术实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
29.申请人在发明过程中发现：人体皮肤在创面修复过程中，通过典型的机械转导(即yap)信号，会大量激活创面内的系阴性成纤维细胞的锯齿状蛋白基因表达，产生疤痕，阻止次生皮肤成分(毛囊和腺体)的恢复。yap蛋白抑制剂能有效阻断伤口中锯齿状蛋白基因激活，从而使次生皮肤成分(毛囊和腺体)的恢复、细胞外基质结构和拉伸强度与未受伤皮肤没有区别。
30.肝细胞生长因子(hgf)、胰岛素样生长因子i(igf-i)角质形成细胞生长因子(kgf)、表皮生长因子(egf)、碱性成纤维生长因子(bfgf)、血小板源性生长因子(pdgf)、血管内皮生长因子(vegf)等细胞生长因子的信号调节作用已被证明能刺激人类头皮和小鼠
毛囊的毛囊生长，上调毛球源性角质形成细胞的dna合成，并调节周期性毛发生长。
31.因此，yap蛋白和生长因子微球的协同作用可以有效促进次生皮肤成分(毛囊和腺体)的再生和恢复。
32.根据本发明一种典型的实施方式，提供了一种促毛囊再生用真皮层，所述真皮层的原料包括：胶原蛋白、yap蛋白抑制剂和生长因子微球。
33.申请人发现人体皮肤在创面修复过程中，通过典型的机械转导(即yap)信号，会大量激活创面内的系阴性成纤维细胞的锯齿状蛋白基因表达，产生疤痕，阻止次生皮肤成分(毛囊和腺体)的恢复。故采用yap蛋白抑制剂，yap蛋白抑制剂能有效阻断伤口中锯齿状蛋白基因激活，从而使次生皮肤成分(毛囊和腺体)的恢复、细胞外基质结构和拉伸强度与未受伤皮肤没有区别。
34.生长因子微球中的生长因子能刺激人类头皮和小鼠毛囊的毛囊生长，上调毛球源性角质形成细胞的dna合成，并调节周期性毛发生长。
35.在一些实施例中，yap蛋白抑制剂包括阿卡地新磷酸盐、阿卡地新和细胞松弛素d中的至少一种。
36.在一些实施例中，生长因子微球中的生长因子包括：肝细胞生长因子、胰岛素样生长因子、角质形成细胞生长因子、表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、血小板源性生长因子和血管内皮生长因子中的至少一种；
37.所述生长因子微球的微球基体的材质为明胶。
38.由于生长因子活性半衰期较短，在水溶液中易失活，且易受湿度、酸碱度等多种因素影响，在皮肤创面修复及再生的整个漫长过程中，生长因子不能长时间持续发挥促再生作用，而明胶具有良好的生物相容性，生长因子与酸性的明胶溶液发生静电络合作用，结合后，随明胶的降解而被释放，因此以多孔明胶微球为基础，制备生长因子微球做缓释剂是解决该问题的有效途径。
39.在一些实施例中，以质量份数计，所述真皮层的原料包括：胶原蛋白0.5-1.5份、yap蛋白抑制剂0.01-0.05份和生长因子微球0.1-0.5份。
40.控制胶原蛋白0.5-1.5份是为了保持真皮层冻干后海绵结构，该份数取值过大会导致孔径致密，无法形成合适孔径的海绵结构，过小则孔径过于稀疏，易坍塌。
41.控制yap蛋白抑制剂0.01-0.05份能够有效阻断伤口中锯齿状蛋白基因激活，该份数取值过大会导致抑制过多，延缓伤口愈合，无法使细胞外基质保持一定的结构和拉伸强度，过小则无法抑制伤口中锯齿状蛋白基因激活，从而生长瘢痕，破环细胞外基质结构和拉伸强度，影响次生皮肤成分(毛囊和腺体)的恢复。
42.控制生长因子微球0.1-0.5份能够刺激毛囊生长，该份数取值过大会导致生长因子过多，刺激组织细胞不断增殖分裂，不受控后会损害原有组织，过小则无法刺激毛囊生长。
43.根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种如上所述的促毛囊再生用真皮层的制备方法，所述方法包括：
44.s1.将胶原蛋白进行溶解，得到胶原蛋白溶液；
45.具体而言，胶原蛋白的溶解工艺包括：用去离子水配置质量分数1-5％的乙酸水溶液，将胶原蛋白剪碎与乙酸水溶液接触，在0-4℃下搅拌12-36h至完全溶解，加入质量分数
0.004-0.008％的戊二醛溶液，继续搅拌0.5-1h；所述明胶的溶解工艺包括：将明胶与去离子水接触，以温度为45-55℃加热搅拌1-2h至完全溶解。
46.s2.将生长因子和微球基体混合，得到生长因子微球；
47.具体而言，生长因子微球的制备工艺包括：
48.s2.1.制备多孔明胶微球：在40℃下，将25μl的戊二醛水溶液(25wt％)加入10ml的明胶水溶液(10wt％)中混合均匀，在500rpm，40℃下，将混合均匀的溶液逐滴加入375ml橄榄油中，得到水/油乳液，随后在25℃下，搅拌24h，使明胶发生化学交联；在反应混合物中加入100ml的丙酮，4℃，3000rpm条件下，离心5min收集微球，持续用丙酮清洗、离心5次，将洗过的微球放入100ml的甘氨酸水溶液(100mm，含有0.1wt％的吐温80)中，在37℃下，搅拌1h，然后用双蒸馏水对交联微球3次离心洗涤，冷冻干燥，真空干燥得到多孔明胶微球。
49.s2.2.制备生长因子微球：将上述生长因子用双蒸馏水稀释为10-1000μg/ml，然后将50μl生长因子溶液加入到2mg冻干后多孔明胶微球中，在25℃，静置1h，得到生长因子微球。
50.s3.将所述胶原蛋白溶液、所述生长因子微球和yap蛋白抑制剂进行混合，得到混合物；
51.一般而言，以质量分数计，真皮层中所述胶原蛋白的质量为混合物的总质量的0.5-1.5％；所述yap蛋白抑制剂的质量为混合物的总质量的0.01-0.05％；所述生长因子微球的质量为混合物的总质量的0.1-0.5％；
52.s4.将所述混合物进行成型，后进行冷冻干燥，得到真皮层。
53.根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种促毛囊再生用人工皮肤，所述人工皮肤包括真皮层，所述真皮层为如上所述的真皮层。
54.在一些实施例中，人工皮肤还包括表皮层，所述真皮层敷设于所述表皮层下方，所述表皮层为热敏性复合膜。
55.具体的真皮层呈多孔海绵状支架状态，通过粘合剂设于所述表皮层的下表面，具有刺激毛囊和皮脂腺再生特性；所述真皮层的组分包括：胶原蛋白、yap蛋白抑制剂和生长因子微球。所述表皮层为热敏性复合膜，起阻隔抗菌作用，创面愈合后表皮容易脱落。
56.在一些实施例中，热敏性复合膜的原料包括：明胶和硅橡胶薄膜。
57.根据本发明另一种典型的实施方式，提供了一种如上所述的人工皮肤的制备方法，所述方法包括：
58.s1.将胶原蛋白进行溶解，得到胶原蛋白溶液；
59.s2.将生长因子和微球基体混合，得到生长因子微球；
60.s3.将所述胶原蛋白溶液、所述生长因子微球和yap蛋白抑制剂进行混合，得到混合物；
61.s4.将所述混合物进行成型，后进行冷冻干燥，得到真皮层；
62.s5.将真皮层和表皮层进行粘合，得到人工皮肤。
63.具体的，整个方法包括：
64.获取所述表皮层的组分，混合得到真皮层溶液；
65.将所述真皮层倒入模具后，冷冻干燥，真空干燥后得到真皮层；
66.获取所述表皮层的组分，将硅橡胶薄膜浸泡于装有明胶溶液的模具中，冷却成型
得到表皮层；
67.将所述表皮层和所述真皮层叠加粘合，得到人工皮肤。
68.在一些实施例中，粘合的粘合剂为明胶、海藻酸钠、液态硅橡胶中的一种或几种。
69.下面将结合实施例、对照例及实验数据对本技术的促毛囊再生用真皮层、人工皮肤及其制备方法进行详细说明。
70.实施例1
71.一种促毛囊再生用人工皮肤的制备方法，方法包括：
72.制备生长因子微球：
73.1、制备多孔明胶微球：在40℃下，将25μl的戊二醛水溶液(25wt％)加入10ml的明胶水溶液(10wt％)中混合均匀，在500rpm，40℃下，将混合均匀的溶液逐滴加入375ml橄榄油中，得到水/油乳液，随后在25℃下，搅拌24h，使明胶发生化学交联；在反应混合物中加入100ml的丙酮，4℃，3000rpm条件下，离心5min收集微球，持续用丙酮清洗、离心5次，将洗过的微球放入100ml的甘氨酸水溶液(100mm，含有0.1wt％的吐温80)中，在37℃下，搅拌1h，然后用双蒸馏水对交联微球3次离心洗涤，冷冻干燥，真空干燥得到多孔明胶微球。
74.2、制备生长因子微球：将肝细胞生长因子(hgf)用双蒸馏水稀释为500μg/ml，然后将50μl生长因子溶液加入到2mg冻干后多孔明胶微球中，在25℃，静置1h，得到生长因子微球。
75.配置真皮层溶液：按0.5wt％称取胶原蛋白和1wt％乙酸，加入去离子水中，在4℃下搅拌12h，加入0.008wt％戊二醛，继续搅拌0.5h，加入0.1wt％阿卡地新磷酸盐和0.5wt％的生长因子微球，混合均匀即可；
76.将上述真皮层溶液倒入316不锈钢定制模具中，冷冻干燥，真空干燥得到真皮层；
77.配置1wt％的明胶溶液：将明胶与去离子水接触，以温度为45℃加热搅拌1h；
78.将硅橡胶薄膜浸泡于装有明胶溶液的模具中，冷却成型得到表皮层；
79.将上述得到的表皮层与真皮层通过明胶粘合，得到人工皮肤。
80.实施例2
81.一种促毛囊再生用人工皮肤的制备方法，方法包括：
82.配置生长因子微球：
83.1、制备多孔明胶微球：在40℃下，将25μl的戊二醛水溶液(25wt％)加入10ml的明胶水溶液(10wt％)中混合均匀，在500rpm，40℃下，将混合均匀的溶液逐滴加入375ml橄榄油中，得到水/油乳液，随后在25℃下，搅拌24h，使明胶发生化学交联；在反应混合物中加入100ml的丙酮，4℃，3000rpm条件下，离心5min收集微球，持续用丙酮清洗、离心5次，将洗过的微球放入100ml的甘氨酸水溶液(100mm，含有0.1wt％的吐温80)中，在37℃下，搅拌1h，然后用双蒸馏水对交联微球3次离心洗涤，冷冻干燥，真空干燥得到多孔明胶微球。
84.2、制备生长因子微球：将胰岛素样生长因子i(igf-i)用双蒸馏水稀释为800μg/ml，然后将50μl生长因子溶液加入到2mg冻干后多孔明胶微球中，在25℃，静置1h，得到生长因子微球。
85.配置真皮层溶液：按1wt％称取胶原蛋白和3wt％乙酸，加入去离子水中，在1℃下搅拌24h，加入0.006wt％戊二醛，继续搅拌0.5h，加入0.2wt％阿卡地新和0.3wt％的生长因子微球，混合均匀即可；
86.将上述真皮层溶液倒入316不锈钢定制模具中，冷冻干燥，真空干燥得到真皮层；
87.配置3wt％的明胶溶液：将明胶与去离子水接触，以温度为45℃加热搅拌2h；
88.将硅橡胶薄膜浸泡于装有明胶溶液的模具中，冷却成型得到表皮层；
89.将上述得到的表皮层与真皮层通过明胶粘合，得到人工皮肤。
90.实施例3
91.一种促毛囊再生用人工皮肤的制备方法，方法包括：
92.配置生长因子微球：
93.1、制备多孔明胶微球：在40℃下，将25μl的戊二醛水溶液(25wt％)加入10ml的明胶水溶液(10wt％)中混合均匀，在500rpm，40℃下，将混合均匀的溶液逐滴加入375ml橄榄油中，得到水/油乳液，随后在25℃下，搅拌24h，使明胶发生化学交联；在反应混合物中加入100ml的丙酮，4℃，3000rpm条件下，离心5min收集微球，持续用丙酮清洗、离心5次，将洗过的微球放入100ml的甘氨酸水溶液(100mm，含有0.1wt％的吐温80)中，在37℃下，搅拌1h，然后用双蒸馏水对交联微球3次离心洗涤，冷冻干燥，真空干燥得到多孔明胶微球。
94.2、制备生长因子微球：将角质形成细胞生长因子(kgf)、表皮生长因子(egf)和血小板源性生长因子(pdgf)用双蒸馏水稀释为300μg/ml，按1：1:1混合均匀，然后将50μl生长因子溶液加入到2mg冻干后多孔明胶微球中，在25℃，静置1h，得到生长因子微球。
95.配置真皮层溶液：按1.5wt％称取胶原蛋白和5wt％乙酸，加入去离子水中，在4℃下搅拌36h，加入0.004wt％戊二醛，继续搅拌0.5h，加入0.5wt％细胞松弛素d和0.5wt％的生长因子微球。，混合均匀即可；
96.将上述真皮层溶液倒入316不锈钢定制模具中，冷冻干燥，真空干燥得到真皮层；
97.配置5wt％的明胶溶液：将明胶与去离子水接触，以温度为55℃加热搅拌2h；
98.将硅橡胶薄膜浸泡于装有明胶溶液的模具中，冷却成型得到表皮层；
99.将上述得到的表皮层与真皮层通过明胶粘合，得到人工皮肤。
100.对比例1
101.一种人工皮肤及其制备方法，方法如下；
102.在无菌条件下分别配制下列溶液：a-按63∶37取i、iii型人胶原，先用胃蛋白酶消化除去胶原的求端，然后用醋酸配制浓度为4mg/ml的胶原醋酸溶液；b-取壳多糖配制浓度为4.5mg/ml的壳多糖醋酸溶液；c-用ph8.0，0.2mtris液和弹性蛋白配制浓度为1.5mg/ml的弹性蛋白tris溶液；d-取透明质酸、硫酸软骨素和硫酸肝素配制出每毫升含0.1mg透明质酸、0.3mg硫酸软骨素和0.005mg硫酸肝素的水溶液；用d-hanks液和纤维粘连蛋白配制浓度为5mg/ml的纤维粘连蛋白溶液。在冰浴中，用a溶液8ml，b溶液1ml，与浓缩了一倍的内含40％新生牛血清，200u/ml，青霉素，200ug/ml链霉素的dmem培养基10ml，在已清毒的玻璃瓶中混合，加入c溶液0.5ml和d溶液0.5ml，再加e溶液0.5ml混均，然后用1nnaoh和1nhcl调节ph至7.2-7.4，再快速加入浓度为2.5
×
105个细胞/ml的成纤维细胞小牛血清悬液1ml，快速混匀后在室温下自然形成基质凝胶。在37℃，95％空气/5％co2和饱和湿度下的孵箱中对形成的基质凝胶进行细胞的三维培养，即在孵箱中先将基质凝胶的成纤维细胞培养1-2周，每隔2-3天更换一次培养基；然后换用内含10％小牛血清，表皮细胞生长因子10ng/ml、氢化可的松0.4ug/ml、胰岛素5ug/ml的表皮细胞培养基60ml，按2
×
105个细胞/cm2基质凝胶接种表皮细胞，浸没培养3-10天，待表皮细胞生长融合后，用不锈钢筛网做支持，将人工皮肤升至
气液界面，补加适量表皮细胞培养基，再培养7-14天，待表皮细胞生长分化良好后即可进行人工皮肤的移植或进行组织学检查。为避免接种的表皮细胞溢出凝胶，接种时在凝胶上放置横截面略小于凝胶表面的玻璃导管，接种10-20分钟后取掉。在表皮细胞培养期间，每天更换一次培养基液。
103.对比例2
104.一种双层人工皮肤及其制备方法，方法如下：
105.(1)成纤维细胞的获取：取新生儿切除术后包皮组织，消毒后用磷酸盐缓冲液(pbs)冲洗，去除皮下脂肪及肌肉层，将皮肤剪成条状，用4u/ml中性蛋白酶液消化2小时；去除表皮层，将真皮组织剪碎，用625u/ml的胶原酶液消化2.5小时，收获成纤维细胞培养；将原代培养的成纤维细胞使用细胞工厂、或旋转瓶培养系统、或生物反应器等方法扩大培养
106.(2)脱细胞小肠粘膜下层的制备：将新鲜猪空肠用蒸馏水冲洗干净，切成所需片段，置于含有0.2％过氧乙酸和10％乙醇的水溶液中浸泡消毒1小时，用pbs液漂洗；机械刮除小肠粘膜、肌层和浆膜，用pbs漂洗干净，获得粘膜下层；再将其置入1m的naoh溶液中，于4
±
2℃条件下浸泡10分钟，用pbs液漂洗至ph中性；将其置入含有40u/ml dna酶和10u/mlα-半乳糖苷酶的混合溶液中浸泡1小时，用pbs液漂洗干净；获得脱细胞小肠粘膜下层；使用制孔机在脱细胞小肠粘膜下层上均匀制孔，孔径为0.2mm，间距1mm，用有孔的脱细胞小肠粘膜下层与无孔的脱细胞小肠粘膜下层各取相同大小叠加、压紧使其紧密结合，干燥后环氧乙烷灭菌，形成双层脱细胞小肠粘膜下层；
107.(3)双层皮肤培养液的配制，各组分按体积百分比包括有：商用最低必需培养液dmem67.5％、商用培养液f12 22.5％、胎牛血清10％，碱性成纤维细胞生长因子10ng/ml、表皮细胞生长因子5ng/ml、胰岛素5ng/ml、氢化可的松20ng/ml、腺嘌呤0.25mm、转铁蛋白5μg/ml；
108.(4)双层人工皮肤的构建：在4℃条件下，按质量比将胶原10∶壳聚糖1∶透明质酸2∶硫酸软骨素0.5混合，用0.1m的醋酸将其配制成浓度为10mg/ml的溶液，冰浴下紫外线照射，按其体积加入10％的胎牛血清，再加入终浓度为10mg/ml的dmem培养基，调节ph值为7.2～7.4，成为凝胶溶液；将制备的双层脱细胞小肠粘膜下层浸透凝胶溶液，在培养皿中37℃环境下预固化30分钟；将体外培养的成纤维细胞按106个/ml的浓度混合于上述凝胶溶液中，再按1ml/cm2滴加到预固化的双层脱细胞小肠粘膜下层的有孔面上，于5％co2环境中37℃条件下固化30分钟后，置入双层皮肤培养液培养3天后，再将其置于培养器皿内的培养支架上继续培养5天，期间每天换液，双层人工皮肤培养完成；上述的培养条件均为37℃，5％co2环境。
109.对比例3
110.一种人工皮肤及其制备方法，方法如下：
111.(1)制备负载有phmb的丝素纳米微球：配制5mg/ml的丝素蛋白溶液和0.5mg/ml的phmb溶液，将phmb溶液缓慢滴入丝素蛋白溶液中，充分混匀后在-60℃下冷冻12h，室温解冻，得到负载有phmb的丝素微球悬浮液；将该悬浮液在5500rpm下离心清洗2次，然后依次通过孔径为0.3μm、0.1μm的滤膜，后收集截留量为0.1～0.3μm的滤液组分，将该滤液组分经超声分散后冷冻干燥，得到粒径为100～300nm的负载有phmb的丝素纳米微球；其中，在丝素蛋白溶液与phmb溶液的混合溶液中，丝素蛋白与phmb的质量比为80:1。
112.(2)制备真皮层上层成孔剂和真皮层下层成孔剂：向液氮中喷洒纯水制得冰粒，将所得冰粒在-10℃条件下过筛，收集粒径20～100μm的冰粒，得到真皮层上层成孔剂；向液氮中喷洒纯水制得冰粒，将所得冰粒在-10℃条件下过筛，收集粒径110～200μm的冰粒，得到真皮层下层成孔剂；
113.(3)配制胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液：制备浓度为0.1mg/ml的胶原蛋白溶液和浓度为0.1mg/ml的丝素蛋白溶液，将该胶原蛋白溶液和丝素蛋白溶液混合，得到胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液；其中，在胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液中，胶原蛋白与丝素蛋白的质量比为0.8:0.9。
114.(4)将9g混合溶液(上述胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液)、9g真皮层上层成孔剂和0.01g负载有phmb的丝素纳米微球在-4℃下混合，得到真皮层上层基体溶液；
115.(5)将19g混合溶液(上述胶原蛋白和丝素蛋白的混合溶液)与21g真皮层下层成孔剂在-4℃下混合，得到真皮层下层基体溶液。
116.(6)将步骤(4)得到的真皮层上层基体溶液置于115
×
95mm的316l模具中，在-60℃下冷冻11h，干燥，得到厚度为0.5mm的真皮层上层。
117.(7)将步骤(5)得到的真皮层下层基体溶液置于115
×
95mm的316l模具中，在-60℃下冷冻11h，干燥，得到厚度为2mm的真皮层下层。
118.(8)将步骤(6)得到的真皮层上层和步骤(7)得到的真皮层下层依次进行粘合、交联和解析，得到真皮层；
119.其中，粘合包括：将所述真皮层上层和所述真皮层下层按人皮肤真皮层孔径分布规律叠加，后在温度为37℃、湿度为70％、乙酸蒸汽浓度为0.1％的条件下反应2h；交联包括：将所述真皮层上层和所述真皮层下层在温度为37℃、湿度为70％以及戊二醛蒸汽浓度为10％的条件下交联2h，后在温度为105℃、真空度为80pa的条件下交联12h。解析包括：将所述真皮层上层和所述真皮层下层在温度37℃下解析2h。
120.(9)将步骤(8)得到的真皮层中的真皮层上层与表皮层医用微孔硅胶膜粘合，得到所述人工皮肤。
121.本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少还具有如下技术效果或优点：
122.(1)本发明实施例提供的人工皮肤以生物相容性良好的胶原蛋白为主要原料，结合yap蛋白抑制剂和细胞生长因子微球，在真皮修复过程中，有效阻断伤口中锯齿状蛋白基因激活，使次生皮肤成分(毛囊和腺体)的恢复、细胞外基质结构和拉伸强度维持良好状态，同时持续性长时间刺激毛囊生长，上调毛球源性角质形成细胞的dna合成，并调节周期性毛发生长，使真皮层具有促进毛囊再生的特性；
123.(2)本发明实施例提供的人工皮肤中生长因子微球以明胶微球为基础，负载生长因子，生长因子与酸性的明胶溶液发生静电络合作用，结合后，生长因子随明胶的降解而被释放，随着明胶降解时间的延长，生长因子的活性持续时间也相应延长，有效的解决了生长因子在体内快速扩散并失活，而不能长时间持续发挥促再生作用的问题；
124.(3)本发明实施例提供的人工皮肤有效的解决了现有技术中次生皮肤成分(毛囊和腺体)无法再生和恢复的技术问题，得到工艺简单、能有效促进次生皮肤成分(毛囊和腺体)的人工皮肤。
125.最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他
性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
126.尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
127.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。