一种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂盒及其方法与流程

1.本发明属于生物分子检测领域，涉及一种试剂盒，具体来说是一种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂盒及其方法。


背景技术：

2.奶牛乳腺炎是近年来一直困扰威胁着奶牛业的头号疾病，可引起产发病奶牛奶量下降和乳品质降低，严重者还能导致奶牛生产性能的丧失，使成年奶牛过早淘汰，造成巨大的经济损失。导致奶牛乳腺炎的因素很多，其中80%以上是由病原微生物感染引起的。临床上主要应用抗生素治疗，大量抗生素的使用既增加了治疗成本，使细菌出现了耐药性，而且造成乳制品中抗生素大量残留，严重威胁人类健康和环境安全。奶牛乳腺炎的致病菌主要包括接触传染病原微生物，包括带菌率较高的金黄色葡萄球菌、无乳链球菌，在某些地区临床检出率达70%以上。另一类是以大肠杆菌和停乳链球菌为主的环境性病原微生物。临床上主要表现为急性乳腺炎和隐性乳腺炎，其中隐性乳腺炎可引起奶牛慢性感染从而造成奶产量长期下降，给奶牛养殖业造成了巨大的经济损失。因此，如何有效防治该病具有重要意义。
3.目前微生物学检验是奶牛乳房炎诊断的最准确的方法，但确诊仍需传统的细菌分离培养，培养特性，生化实验，药物敏感试验，及其动物致病性实验。该方法费时费力，不利于现场检测。 环介导等温扩增法是一种新型的核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，在链置换dna聚合酶的作用下，60
‑‑
65℃恒温扩增，15-60分钟左右即可实现109～10
10
倍的核酸扩增，具有操作简单、特异性强、产物易检测等特点。在dna合成时，产生大量的焦磷酸根离子与二价金属离子结合形成不溶性盐，向反应溶液中加入锰离子和钙黄绿素（一种荧光金属指示剂），30-60min就可以直观地观察到扩增反应过程中荧光的实质性变化。由于信号识别高度敏感，该系统无需昂贵的专用设备即可实现结果的可视化分析。因此，只用肉眼观察白色浑浊沉淀或绿色荧光的生成，就能鉴定扩增与否，而不需要繁琐的电泳和紫外观察。由于环介导等温扩增反应不需要pcr仪和昂贵的试剂，可用于现场快速检测。
4.目前，国内针对奶牛乳腺炎的快速诊断研究较少，研制奶牛乳腺炎相关即使检测产品，提高检测水平，为人们提供优质安全的乳制品成为目前较为迫切的需求。迄今为止还没有利用环介导等温扩增技术同时对多种常见奶牛乳腺炎致病菌鉴定的方法，因此，提供一种利用可视化等温扩增技术鉴定常见奶牛乳腺炎致病菌的引物和方法具有十分重要的意义。本方法全程只需60min，克服关于奶牛致病菌传统检测手段特异性不高、灵敏度低、操作繁琐耗时及现有技术中病原菌检测不全面等问题。


技术实现要素：

5.针对现有技术中的上述技术问题，本发明提供了一种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂盒及其方法，所述的这种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂盒及其方法要解决现有
技术中检测奶牛乳腺炎的方法复杂，时间长、假阳性干扰等技术问题。
6.本发明提供了一种用于检测奶牛乳房炎致病菌的试剂盒，包括扩增金黄色葡萄球菌的引物、扩增表皮葡萄球菌的引物、扩增无乳链球菌的引物、扩增停乳链球菌的引物、扩增乳房链球菌的引物、扩增肠球菌的引物、扩增铜绿假单胞菌的引物、扩增肠杆菌的引物、扩增大肠埃希菌的引物、扩增肺炎克雷伯菌的引物、扩增单增李斯特菌的引物和扩增牛支原体的引物；用于检测金黄色葡萄球菌的上游内引物fip如seq id no.1所示；用于检测金黄色葡萄球菌的下游内引物bip如seq id no.2所示；用于检测金黄色葡萄球菌的上游外引物f3如seq id no.3所示；用于检测金黄色葡萄球菌的下游外引物b3如seq id no.4所示；用于检测表皮葡萄球菌的上游内引物fip如seq id no.5所示；用于检测表皮葡萄球菌的下游内引物bip 如seq id no.6所示；用于检测表皮葡萄球菌的上游外引物f如seq id no.7所示；用于检测表皮葡萄球菌的下游外引物b3如seq id no.8所示；用于检测无乳链球菌的上游内引物fip：如seq id no.9所示；用于检测无乳链球菌的下游内引物bip: 如seq id no.10所示；用于检测无乳链球菌的上游外引物f3：如seq id no.11所示；用于检测无乳链球菌的下游外引物b3如seq id no.12所示；用于检测停乳链球菌的上游内引物fip：如seq id no.13所示；用于检测停乳链球菌的下游内引物bip如seq id no.14所示；用于检测停乳链球菌的上游外引物f3如seq id no.15所示；用于检测停乳链球菌的下游外引物b3如seq id no.16所示；用于检测乳房链球菌的上游内引物fip如seq id no.17所示；用于检测乳房链球菌的下游内引物bip如seq id no.18所示；用于检测乳房链球菌的上游外引物f3如seq id no.19所示；用于检测乳房链球菌的下游外引物b3如seq id no.20所示；用于检测肠球菌的上游内引物fip如seq id no.21所示；用于检测肠球菌的下游内引物bip如seq id no.22所示；用于检测肠球菌的上游外引物f3如seq id no.23所示；用于检测肠球菌的下游外引物b3如seq id no.24所示；用于检测铜绿假单胞菌的上游内引物fip如seq id no.25所示；用于检测铜绿假单胞菌的下游内引物bip如seq id no.26所示；用于检测铜绿假单胞菌的上游外引物f3如seq id no.27所示；用于检测铜绿假单胞菌的下游外引物b3如seq id no.28所示；用于检测肠杆菌的上游内引物fip如seq id no.29所示；用于检测肠杆菌的下游内引物bip如seq id no.30所示；用于检测肠杆菌的上游外引物f3如seq id no.31所示；用于检测肠杆菌的下游外引物b3如seq id no.32所示；用于检测大肠埃希菌的上游内引物fip如seq id no.33所示；用于检测大肠埃希菌的下游内引物bip如seq id no.34所示；用于检测大肠埃希菌的上游外引物f3如seq id no.35所示；用于检测大肠埃希菌的下游外引物b3如seq id no.36所示；用于检测肺炎克雷伯菌的上游内引物fip如seq id no.37所示；用于检测肺炎克雷伯菌的下游内引物bip如seq id no.38所示；用于检测肺炎克雷伯菌的上游外引物f3如seq id no.39所示；用于检测肺炎克雷伯菌的下游外引物b3如seq id no.40所示；用于检测单增李斯特菌的上游内引物fip如seq id no.41所示；用于检测单增李斯特菌的下游内引物bip如seq id no.42所示；用于检测单增李斯特菌的上游外引物f3如seq id no.43所示；用于检测单增李斯特菌的下游外引物b3如seq id no.44所示；用于检测牛支原体的上游内引物fip如seq id no.45所示；用于检测牛支原体的下游内引物bip如seq id no.46所示；用于检测牛支原体的上游外引物f3如seq id no.47所示；用于检测牛支原体的下游外引物b3如seq id no.48所示。
7.进一步的，还包括2
×
lamp pcr master mix、bst 3.0dna聚合酶、钙黄绿素-mn 2
混合溶液和ddh2o。
8.本发明还提供了采用上述的试剂盒检测奶牛乳腺炎的方法，包括如下步骤：（1）提取奶牛乳汁样本，加入到含有上述引物的lamp反应体系中64℃恒温反应1小时；（2）反应后判断结果：反应后体系中钙黄绿素mncl2混合溶液由棕黄色变为绿色荧光，表示存在与引物对相对应的致病菌；反应前后没有颜色变化均为棕黄色，表示没有与该引物对相对应的致病菌的存在。
9.具体的，上述检测各致病菌的反应体系具体包括：引物fip和bip 0.8um、f3和b3 0.2um，待测乳汁样本2ul，mgcl
2 6mm，10x反应缓冲液2.5ul，钙黄绿素mncl2溶液2.5ul，dntp1mm，ddh2o 2ul，bst dna聚合酶320u/ml。其中，钙黄绿素mncl2溶液由1mm的钙黄绿素溶液与4mm的mncl2溶液等体积混合得到，钙黄绿素的终浓度为50um，mncl2溶液的终浓度为200um。该荧光指示剂不影响lamp反应，反应前加入体系中，一步反应后直接根据颜色变化判断结果，避免了开盖后加入荧光指示剂带来的假阳性干扰。
10.根据本发明的检测待测样品是否发生乳腺炎的方法，其中，所述样品可以为奶牛乳汁或乳腺分泌物，也可以为血液样本，所述方法包括使用上述用于检测奶牛乳房炎的可视化等温扩增引物组进行检测的步骤。
11.本发明检测方法容易操作，成本低廉，可广泛应用。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明提供了一种快速、低成本、准确判断奶牛乳房炎感染的特异性方法，该方法具有操作便捷、无需特殊仪器、成本低廉的特点，不仅能为养殖场的准确诊疗提供强有力的帮助，而且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，具备大规模推广应用的条件。
[0012] (2)本发明通过设计与现有引物序列不同的内引物fip和bip、外引物f3和b3，大幅提高了核酸扩增反应的灵敏度，试验表明：采用本发明设计的特异性引物，最佳反应温度为64℃恒温，最佳反应时间为60分钟，相比原有的核酸扩增反应所需时间至少缩短了一半以上。同时，基于本发明设计的引物，由于其具有高度的特异性，只需根据扩增反应产物有无即可对靶基因序列的存在与否做出判断，可以快速实现现场核酸检测，完全满足了当前奶牛乳房炎致病菌检测的需要。
附图说明
[0013]
图1显示了在稀释液中拷贝数为4
×
103copies/ml时，依然能够看到明显的变色情况。
[0014]
图2显示了在不同贮存时间下的引物与dna进行lamp反应产物均呈现绿色。
[0015]
图3显示乳杆菌对照组和双歧杆菌对照组均呈棕黄色，证明无扩增。
具体实施方式
[0016] 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市
售。
[0017]
实施例1本发明的目的是要提供一种奶牛乳腺炎12种常见致病菌的可视化等温扩增检测试剂盒及其应用，缩短了检测时间，提高了特异性和敏感性，以及提高了操作的方便性、降低了成本。
[0018]
本发明首先根据12种常见奶牛乳房炎致病菌的保守序列分别设计了4条引物，包括f3(正向外引物)、b3(反向外引物)、fip(正向内引物)、bip(反向内引物)，所有引物的序列分别如下：用于检测金黄色葡萄球菌的引物：用于检测金黄色葡萄球菌的上游内引物fip：5
’‑
accagaaagtcgccttcgcctgtagcggtgaaatgcgc-3’（seq id no.1所示）用于检测金黄色葡萄球菌的下游内引物bip:5
’‑
actgacgctgatgtgcgaaagctagcactcatcgtttacggc-3
’ꢀ
（seq id no.2所示）用于检测金黄色葡萄球菌的上游外引物f3：5
’‑
gtgcagaagaggaaagtgga-3
’ꢀ
（seq id no.3所示）用于检测金黄色葡萄球菌的下游外引物b3：5
’‑
cgttagctgcagcactaagg-3
’ꢀ
（seq id no.4所示）表皮葡萄球菌的引物：用于检测表皮葡萄球菌的上游内引物fip：5
’‑
cctgtcactctgtcccccgaacttgacatcctctgacccct-3
’ꢀ
（seq id no.5所示）用于检测表皮葡萄球菌的下游内引物bip:5
’‑
ggttaagtcccgcaacgagcgtgtcaccggcagtcaact-3
’ꢀ
（seq id no.6所示）用于检测表皮葡萄球菌的上游外引物f3：5
’‑
aacgcgaagaaccttaccaa-3
’ꢀ
（seq id no.7所示）用于检测表皮葡萄球菌的下游外引物b3：5
’‑
tcatccccaccttc-3
’ꢀ
（seq id no.8所示）无乳链球菌的引物：用于检测无乳链球菌的上游内引物fip：5
’‑
cagcttagttatcccaaatcccatagaagcaatcactttttcaactca-3
’ꢀ
（seq id no.9所示）用于检测无乳链球菌的下游内引物bip:5
’‑
attcgcattttagatccatttgctt-gcctttacatcgttaacttgag-3
’ꢀ
（seq id no.10所示）用于检测无乳链球菌的上游外引物f3：5
’‑
agaagccttaacagatgtga-3
’ꢀ
（seq id no.11所示）用于检测无乳链球菌的下游外引物b3：5
’‑
caggataagttaaaaccttttgttc-3
’ꢀ
（seq id no.12所示）停乳链球菌的引物：用于检测停乳链球菌的上游内引物fip：5’‑
tcgcaactaaatcatttgcaatgtc-agcggtcattgtacctgt-3
’ꢀ
（seq id no.13所示）用于检测停乳链球菌的下游内引物bip:5
’‑
ctgacaatgctactccggga-cgtatgcatcatttagtaaacgata-3
’ꢀ
（seq id no.14所示）用于检测停乳链球菌的上游外引物f3：5
’‑
gtttctgcagaaactatacctg-3
’ꢀ
（seq id no.15所示）用于检测停乳链球菌的下游外引物b3：5
’‑
agtcttttgattccaacacat-3
’ꢀ
（seq id no.16所示）乳房链球菌的引物：用于检测乳房链球菌的上游内引物fip：5
’‑
agtcgcgaattgaactttatactca-aaacgggttgaagaacct
ꢀ‑3’ꢀ
（seq id no.17所示）用于检测乳房链球菌的下游内引物bip:5
’‑
attccacccactacctatttttgt-tcgaaactcgtcagaggt-3
’ꢀ
（seq id no.18所示）用于检测乳房链球菌的上游外引物f3：5
’‑
aagggcatgttattctcaga-3
’ꢀ
（seq id no.19所示）用于检测乳房链球菌的下游外引物b3：5
’‑
caaaagcttttcttctgcaatt-3
’ꢀ
（seq id no.20所示）肠球菌的引物：用于检测肠球菌的上游内引物fip：5
’‑
tagctgcagcactgaagggcgtagtccacgccgtaaacg-3
’ꢀ
（seq id no.21所示）用于检测肠球菌的下游内引物bip:5
’‑
ctggggagtacgaccgcaagcatgctccaccgcttgtg-3
’ꢀ
（seq id no.22所示）用于检测肠球菌的上游外引物f3：5
’‑
gtggggagcaaacaggatt-3
’ꢀ
（seq id no.23所示）用于检测肠球菌的下游外引物b3：5
’‑
cctggtaaggttcttcgcg-3
’ꢀ
（seq id no.24所示）铜绿假单胞菌的引物:用于检测铜绿假单胞菌的上游内引物fip：5
’‑
ttggccaccttgcccttctcgggccaggtgcatgcctt
ꢀ‑3’ꢀ
（seq id no.25所示）用于检测铜绿假单胞菌的下游内引物bip: 5
’‑ꢀ
tgcccctaccaccagtgga-agtcggcgcccatctc-3
’ꢀ
（seq id no.26所示）用于检测铜绿假单胞菌的上游外引物f3：5
’‑
cggtcctggtgatccgtg-3
’ꢀ
（seq id no.27所示）用于检测铜绿假单胞菌的下游外引物b3：5
’‑
gccgtactccttcatgtcga-3
’ꢀ
（seq id no.28所示）肠杆菌的引物:用于检测肠杆菌的上游内引物fip：5
’‑
gtcagtctttgtccagggggc-caggtgtagcggtgaaatgc-3
’ꢀ
（seq id no.29所示）
用于检测肠杆菌的下游内引物bip:5
’‑
gctcaggtgcgaaagcgtgg-acctccaagtcgacatcgtt-3
’ꢀ
（seq id no.30所示）用于检测肠杆菌的上游外引物f3：5
’‑
gtcttgtagaggggggtaga-3
’ꢀ
（seq id no.31所示）用于检测肠杆菌的下游外引物b3：5
’‑
cgttagctccggaagcca-3
’ꢀ
（seq id no.32所示）大肠埃希菌的引物:用于检测大肠埃希菌的上游内引物fip：5
’‑
ggcacgagcgttaagcagct-taacgcgctagaaaaaggcg-3
’ꢀ
（seq id no.33所示）用于检测大肠埃希菌的下游内引物bip:5
’‑
cggcgcaaaaacctttgctga-acgcagcgtttttccctg-3
’ꢀ
（seq id no.34所示）用于检测大肠埃希菌的上游外引物f3：5
’‑
gcgaccagtgaaaaatgtcc-3
’ꢀ
（seq id no.35所示）用于检测大肠埃希菌的下游外引物b3：5
’‑
cgctcaccaactgataacca-3
’ꢀ
（seq id no.36所示）肺炎克雷伯菌的引物:用于检测肺炎克雷伯菌的上游内引物fip：5
’‑
tggtcatcctctcagaccagctgctagtaggtggggtaacgg-3
’ꢀ
（seq id no.37所示）用于检测肺炎克雷伯菌的下游内引物bip:5
’‑
tggaactgagacacggtccagaatggctgcatcaggcttg-3
’ꢀ
（seq id no.38所示）用于检测肺炎克雷伯菌的上游外引物f3：5
’‑
gatgtgcccagatgggatt-3
’ꢀ
（seq id no.39所示）用于检测肺炎克雷伯菌的下游外引物b3：5
’‑
gccttcttcacacacgcg-3
’ꢀ
（seq id no.40所示）单增李斯特菌的引物:用于检测单增李斯特菌的上游内引物fip：5
’‑
tgaacaatttcgttaccttcaggat-tcgatcactctggaggatac-3
，
（seq id no.41所示）用于检测单增李斯特菌的下游内引物bip:5
’‑‑
ggagcgaaaacaataaaagcaagct-gcgtaaacattaatatttctcgc-3
’ꢀ
（seq id no.42所示）用于检测单增李斯特菌的上游外引物f3：5
’‑
ttcaaaagcttatacagatggaa-3
’ꢀ
（seq id no.43所示）用于检测单增李斯特菌的下游外引物b3：5
’‑
aagctaaaccagtgcattc-3
’ꢀ
（seq id no.44所示）牛支原体的引物:用于检测牛支原体的上游内引物fip：5
’‑
accccgctaaacatcatcgcc-gatcggagtgcgcaacat-3
’ꢀ
（seq id no.45所示）用于检测牛支原体的下游内引物bip:
ꢀ5’‑
agagattgatccgccacactgg-ctactgctgcctcccgta-3’（seqidno.46所示）用于检测牛支原体的上游外引物f3：5
’‑
aggaagcgtttgcttcgc-3’（seqidno.47所示）用于检测牛支原体的下游外引物b3：5
’‑
gctccatcagactttcgtcc-3’（seqidno.48所示）根据本发明的奶牛乳腺炎12种常见致病菌的可视化等温扩增检测试剂盒，包含上述引物组，还包含检测试剂。
[0019]
优选的，所述检测试剂包括如下组分：f3(正向外引物)、b3(反向外引物)、fip(正向内引物)、bip(反向内引物)、2
×
lamppcrmastermix、bst3.0dna聚合酶、钙黄绿素-mn
2
混合溶液和ddh2o。
[0020]
根据本发明的具体实施方式，检测或辅助检测待测样品是否感染乳腺炎的方法，包括以下步骤：反应步骤：从待测乳汁样品作为模板，采用上述任一项所述的检测试剂或上述的检测试剂盒进行环介导等温扩增，得到扩增产物；作为优选，所述环介导等温扩增的反应条件为：恒温64℃，反应60min；确认步骤：扩增产物呈现绿色荧光则待测样品感染相应的奶牛乳腺炎致病菌；扩增产物呈棕黄色则待测样品未感染本试剂盒检测范围内的12种奶牛乳腺炎致病菌。
[0021]
实施例2：lamp反应体系的建立 在本发明中，通过不断的实验优化，得到了较为稳定的扩增体系如下:2
×
lamppcrmastermix12.5μl，bst3.0dna聚合酶0.5μl，内引物fip、bip(10μm)各2μl、外引物f3、b3(10μm)各0.5μl、模板2μl、ddh2o5μl，该体系在金属浴或者水浴锅中64℃恒温加热1h即可，同时在体系中加入mncl2溶液(15mm)1μl、钙黄绿素(500μm)3μl，使反应结果肉眼可断，阳性结果显示为荧光绿色，阴性结果显示为棕黄色。
[0022]
实施例3lamp引物组的灵敏性和稳定性验证试验 1.灵敏性验证试验：将已知浓度的12种菌液dna样品以10倍梯度进行系列稀释,从4
×
103～4
×
106copies/ml区间取每一数量级的稀释液5μl作为扩增模板。
[0023]
试验条件同实例1。结果显示：在稀释液中拷贝数为4
×
103copies/ml，此时依然能够看到明显的变色情况(见图1)，证明lamp法能够检测到的最低稀释度《4
×
103copies/ml，具有良好的灵敏度，每个反应都可最低检测到20个拷贝数dna。
[0024]
2.稳定性验证试验：分别在第0、5、10日、15日分别分装四组本发明提供的引物，于-20℃贮存。之后在第20日一起进行lamp法扩增试验(试验方法和程序同实施例1)，比较同一组dna样品与四组引物进行lamp试验的结果，判断引物稳定性。四组试验结果见图2。结果显示，不同贮存时间下的引物与dna进行lamp反应产物均呈现绿色，证明本发明提供的引物组具有良好的稳定性。
[0025]
实施例4lamp引物组特异性的进一步证明实验。
[0026]
以临床上常见的无致病性细菌为检测对象(包括乳杆菌和双歧杆菌)。用试剂盒提供的引物组进行lamp检测，来验证其反应的特异性，结果参见图3的乳杆菌对照组和双歧杆菌对照组。
[0027]
结果显示乳杆菌对照组和双歧杆菌对照组均呈棕黄色，证明无扩增；而同样反应
条件下的阳性对照组均变为荧光绿色，证明本发明引物组具有良好的特异性。
[0028]
本发明通过设计与现有引物序列不同的12种奶牛乳腺炎常见致病菌的内引物(fip和bip)、外引物(f3和b3)，能快速、有效地实现核酸检测。本发明能为奶牛乳腺炎的准确诊疗提供强有力的帮助，而且其检测效率高、成本低廉的特点也非常适合基层使用，更适合大规模推广应用。
[0029]
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上做出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。