贝莱斯芽孢杆菌及其在防治作物疾病中的应用的制作方法

1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及贝莱斯芽孢杆菌ly149-1及其在防治作物疾病中的应用。


背景技术：

2.马铃薯(solanum tuberosum l.)是仅次于小麦、水稻、玉米之后的第四大重要粮食作物，在保障我国国家粮食安全、种植业结构调整以及农业产业转型升级等中发挥不可替代的作用。目前，由于马铃薯种植面积的不断扩大，加之多年连作重茬、单一品种长期重茬不合理的种植方式以及水分供应条件的不足等，导致马铃薯早疫病病害问题日益严重，造成了较大的经济损失。
3.在农业生产中，针对马铃薯早疫病害问题，主要通过培育抗病品种，使用化学药剂以及改良农业栽培措施等手段来防治，但效果均不理想，弊端较多。研究表明，使用微生物肥料与土壤环境的兼容性好，可降低作物病害指数，达到优质高产的效果。贝莱斯芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，在作物生长定殖过程中可产生多种抗菌脂肽类物质，例如，丰原素 (fengycin)、伊枯草菌素(iturin)、表面活性素(surfactin)等，对农业真菌病原菌的生长具有较强的抑制作用。据报道，贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)能够有效预防由子囊菌引起的植物真菌型病害，并对疫霉菌和细菌引起的植物病害也有良好的生防作用。通过筛选及丰富优质菌种资源库，对于农作物产量、品质及土壤微生态环境具有积极作用。随着生物技术迅猛发展以及绿色、环保、生态、可持续发展农业观念的不断深入和发展，生物防治方法受到人们的广泛关注。
4.针对马铃薯的疾病防治还需要进一步改进。


技术实现要素：

5.本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。针对目前马铃薯早疫病害的日益严重，且化学防治方法对环境造成的负面影响，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌，将其应用于马铃薯早疫病的防治，表现出优异的效果。为此，本发明的一个目的在于提出一种贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis、微生物菌剂、复合菌剂、微生物肥料及防治疾病的方法。
6.具体而言，本发明提供了如下技术方案：
7.本发明的第一方面提供了一种贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23508。所提供的贝莱斯芽孢杆菌经过筛选、分离、鉴定，例如经过16s rdna与gyrb基因序列测定，细胞革兰氏染色、菌落形态学观察以及生理生化特征分析，被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillusvelezensis)。并保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。所提供的贝莱斯芽孢杆菌对于多种农业真菌致病菌，例如马铃薯早疫病(phytophthora infestans)、水稻恶苗病菌(bakanae oryzae)、小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)、水稻纹枯病菌
(rhizoctoniasolani)、马铃薯黑痣病菌(solanum tuberosum)及玉米大斑病菌(xanthomonas oryzae)表现出抑制作用，具有良好的疾病防治效果。
8.本发明的第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括本发明第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌。
9.本发明的第三方面提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为本发明第一方面任一实施例所述的微生物菌剂，所述第二微生物菌剂包括选自解淀粉芽孢杆菌、其他贝莱斯芽孢杆菌中的至少一种。
10.本发明的第四方面提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括本发明第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌，或者本发明第二方面所述的微生物菌剂，或者本发明第三方面所述的复合菌剂。
11.本发明的第五方面提供了贝莱斯芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者微生物肥料中的用途，所述贝莱斯芽孢杆菌为本发明第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌。
12.本发明的第六方面提供了一种防治疾病的方法，包括：
13.对植物施用有效量的贝莱斯芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者微生物肥料，所述贝莱斯芽孢杆菌为本发明第一方面所述的贝莱斯芽孢杆菌，所述微生物菌剂为本发明第二方面所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为本发明第三方面所述的复合菌剂，所述微生物肥料为本发明第四方面所述的微生物肥料。
14.菌种保藏信息
15.贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，保藏编号为cgmcc no.23508，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，保藏日期为2021年09月29日。
附图说明
16.图1为根据本发明的实施例提供的贝莱斯芽孢杆菌对不同农业真菌的拮抗效果图，其中图1中a为马铃薯早疫病菌(phytophthora infestans)，b为水稻恶苗病菌(bakanae oryzae)， c为小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)，d为水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)，e 为马铃薯黑痣病菌(solanum tuberosum)，f为玉米大斑病菌(xanthomonas oryzae)。
17.图2为根据本发明的实施例提供的贝莱斯芽孢杆菌wb-2脂肽类物质合成基因的扩增结果，其中图2中m为dl2000 dna marker，1为阳性对照菌株(lj)，2为贝莱斯芽孢杆菌wb-2。
18.图3为根据本发明的实施例提供的贝莱斯芽孢杆菌wb-2菌落及显微形态观察结果图。
19.图4为根据本发明的实施例提供的基于16s rdna序列对贝莱斯芽孢杆菌建立的拮抗菌株wb-2的系统发育树。
20.图5为根据本发明的实施例提供的基于gyrb基因序列建立的贝莱斯芽孢杆菌wb-2的系统发育树。
具体实施方式
21.下面结合附图详细描述本发明的实施例，需要说明的是，这些实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
22.本文中，如无特殊说明，当表述某种物质的含量时，是指的该物质的质量占总物质重量的百分比。
23.本文中，当提到对于疾病的“防治”时，“防治”不仅包括预防某种疾病的发生，还包括治疗某种疾病，从而减轻、降低、缓解疾病的症状。
24.本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌bacillus velezensis，其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.23508。该菌株筛选自马铃薯植株根际土壤，土壤深度为0-20cm，经菌落形态观察、细胞革兰氏染色、生理生化特征检测以及 16s rdna、gyrb基因序列测定分析，该菌株被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌wb-2作为菌剂产品，对马铃薯早疫病菌、水稻恶苗病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、马铃薯黑痣病菌及玉米大斑病菌等农业真菌病原菌，有较好的抑制作用。此外，wb-2的代谢产物可扩增出抗菌脂肽类物质fend、ituc、srfaa、srfab 的合成基因。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌wb-2作为微生物菌剂产品，通过喷施、浇灌等方式应用于马铃薯盆栽试验中，可使马铃薯植株早疫病的病情指数分别降低50.65、7.99，相对防效达60.93％。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌wb-2，作为一种绿色多效的功能菌株，与解淀粉芽孢杆菌、其他贝莱斯芽孢杆菌进行复配，添加至复合肥中，使马铃薯早疫病发病率分别降低53.33、19.44；相对防效分别提高76.19％、27.78％；产量分别增加18.69％、 12.19％，可溶性淀粉含量分别增加3.5％、26％。而且对马铃薯早疫病(phytophthorainfestans)、水稻恶苗病菌(bakanae oryzae)、小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)、水稻纹枯病菌(rhizoctonia solani)、马铃薯黑痣病菌(solanum tuberosum)及玉米大斑病菌 (xanthomonas oryzae)6种农业真菌致病菌，具有一定的抑制作用，平板抑制率分别为87％、 65.19％、59.44％、57.22％、66.30％、63.89％，菌株wb-2的代谢产物中可扩增出抗菌脂肽类物质fend、ituc、srfaa、srfab的合成基因。所提供的贝莱斯芽孢杆菌wb-2可开发为马铃薯早疫病生防菌种资源，并应用于实际农业生产实践。
25.根据本发明具体实施方式，所述贝莱斯芽孢杆菌具有如seq id no:1所示的16s rdna 序列。根据本发明的具体实施方式，所述贝莱斯芽孢杆菌具有如seq id no:2所示的gyrb 基因序列。
26.本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包括上述所述的贝莱斯芽孢杆菌。在本发明的至少一些实施方式中，所述微生物菌剂为干粉状，每克所述微生物菌剂中含有所述贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为100亿cfu。根据本发明的具体实施方式，所提供的微生物菌剂对于马铃薯早疫病具有显著抗病、促生的作用，具体效果为：与空白对照组ck、市场菌剂相比，马铃薯早疫病盆栽发病率分别降低了50.65、7.99，相对防效达 60.93％。
27.根据本发明的实施例，所提供的微生物菌剂可以通过发酵获得。例如可以由贝莱斯芽孢杆菌wb-2菌株发酵、冷冻及干燥成菌粉而成，其中贝莱斯芽孢杆菌菌粉制剂活菌数含量不低于1.3
×
10
11
万/g。根据本发明的具体实施方式，所述微生物菌剂通过下述步骤获得：对所述贝莱斯芽孢杆菌进行发酵培养，以便获得发酵产物；基于所述发酵产物进行喷雾
干燥、粉碎处理，以便获得所述微生物菌剂。根据本发明的具体实施方式，所述发酵培养包括：对所述贝莱斯芽孢杆菌进行活化发酵培养，以便获得发酵菌液；对所述发酵菌液进行放大发酵培养，以便获得发酵产物。
28.根据本发明的具体实施方式，用于所述放大发酵培养的培养基包括玉米淀粉、豆粕、酵母粉、蔗糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠、碳酸钙和消泡剂。例如，在至少一些具体实施方式中，用于所述放大发酵培养的培养基以重量份计，包括：2-5份的玉米淀粉，3-5份的豆粕，0.1-0.3份的酵母粉，0.5-2份的蔗糖，0.1-0.3份的蛋白胨，0.1-0.3 份的磷酸氢二钾，0.2-0.5份的磷酸二氢钾，0.1-0.3份的氯化钠，0.05-0.2份的碳酸钙，和 0.2-0.5份的消泡剂。放大发酵培养基的ph可以控制在7左右。用于放大发酵培养的发酵罐的大小可以为10l、50l或者500l；不同体积大小的发酵罐逐级放大使用。将发酵产物进行烘干粉碎，可以获得相应的微生物菌剂。在进行液体发酵培养时，所用到的培养基可以为lb培养基。例如，可以在37℃条件下培养4～8小时获得发酵菌液。
29.所提供的贝莱斯芽孢杆菌不仅可以制备成微生物菌剂，作为单一菌剂使用，还可以同其他微生物菌剂进行复配，制备成复合菌剂。为此，本发明还提供了一种复合菌剂，所述复合菌剂包括第一微生物菌剂和第二微生物菌剂，所述第一微生物菌剂为上述所述的微生物菌剂。所述第二微生物菌剂不做特殊要求，所述第二微生物菌剂只要是能够起到防治病虫害或者疾病的目的即可。所述第二微生物菌剂包括选自解淀粉芽孢杆菌菌剂、其他贝莱斯芽孢杆菌菌剂中的至少一种。根据本发明的具体实施方式，所述复合菌剂包括30～35重量份的所述第一微生物菌剂，以及选自下列中的至少一种：30～35重量份的解淀粉芽孢杆菌菌剂；30～35重量份的其他贝莱斯芽孢杆菌菌剂。所提到的解淀粉芽孢杆菌菌剂是指包含有解淀粉芽孢杆菌的微生物菌剂，所提到的其他贝莱斯芽孢杆菌菌剂是指包含有其他贝莱斯芽孢杆菌的微生物菌剂。所提到的解淀粉芽孢杆菌或者其他贝莱斯芽孢杆菌可以通过自筛或购买获得，并可以通过发酵培养、烘干粉碎获得。当然，也可以直接购买获得解淀粉芽孢杆菌菌剂或者其他贝莱斯芽孢杆菌菌剂。
30.根据本发明的具体实施方式，所述复合菌剂中贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和其他贝莱斯芽孢杆菌的重量比为1～3:1～3：1～3。在至少一种具体实施方式中，所述复合菌剂中贝莱斯芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和其他贝莱斯芽孢杆菌的重量比为1:1：1。文中所提到的其他贝莱斯芽孢杆菌是不同于本发明所提供的贝莱斯芽孢杆菌的即可。
31.根据本发明的具体实施方式，所提到的其他贝莱斯芽孢杆菌菌剂可为lj(菌种保藏编号为cgmcc.no.21827，该菌株记载在申请号为202111115791.9的中国专利申请文本中)经发酵培养获得，或为贝莱斯芽孢杆菌45#经发酵获得。
32.根据本发明的具体实施方式，每克所述复合菌剂中包括贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数至少为100亿cfu，以及选自下列中的至少一种：解淀粉芽孢杆菌菌的有效活菌数至少为 100亿cfu；其他贝莱斯芽孢杆菌菌的有效活菌数至少为100亿cfu。cfu作本领域通常解释，为菌落形成单位。
33.上述提供的菌株，或者微生物菌剂或者复合菌剂可以单独使用，也可以添加到肥料中使用。本发明还提供了一种微生物肥料，所述微生物肥料包括上述所述的贝莱斯芽孢杆菌，或者上述所述的微生物菌剂，或者上述所述的复合菌剂。根据本发明的具体实施方式，所提供的微生物肥料具有防病、促生的作用，具体效果为：相比于常规施肥和市场菌剂，
马铃薯早疫病发病率分别降低了53.33、19.44；相对防效分别提高了76.19％、27.78％；产量分别增加18.69％、12.19％，可溶性淀粉分别增加了3.5％、26％。说明由该菌株复配而成的微生物肥料具有促进作物生长，提高作物产量，防治马铃薯早疫病的功能。
34.根据本发明的具体实施方式，每克所述微生物肥料中所含有的微生物有效活菌数至少为0.5亿cfu。
35.根据本发明的具体实施方式，所述微生物肥料中含有千分之一至千分之五的所述贝莱斯芽孢杆菌，或者千分之一至千分之五的所述微生物菌剂，或者千分之一至千分之五的所述复合菌剂。例如可以为千分之一、千分之二、千分之三、千分之四或者千分之五。
36.根据本发明的具体实施方式，所述微生物肥料进一步包括基础肥料，所述基础肥料选自复合肥、有机无机肥中的至少一种。根据本发明的具体实施方式，所提到的复合肥为 12-18-15/s。
37.本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌在制备微生物菌剂、复合菌剂或者微生物肥料中的用途。
38.本发明还提供了一种防治疾病的方法，包括：对植物施用有效量的贝莱斯芽孢杆菌，微生物菌剂，复合菌剂或者微生物肥料，所述贝莱斯芽孢杆菌为上述所述的贝莱斯芽孢杆菌，所述微生物菌剂为上述所述的微生物菌剂，所述复合菌剂为上述所述的复合菌剂，所述微生物肥料为上述所述的微生物肥料。根据本发明的具体实施方式，所提到的疾病包括但不限于马铃薯早疫病、水稻恶苗病菌、小麦赤霉病菌、水稻纹枯病菌、马铃薯黑痣病菌或者米大斑病菌引起的疾病。所提到的植物包括但不限于马铃薯、水稻、小麦等等。
39.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
40.实施例1贝莱斯芽孢杆菌的分离与筛选
41.本发明的贝莱斯芽孢杆菌采集于马铃薯早疫病病株根际周围土壤，采用稀释涂布平板法和平板划线法分离获得，包括以下步骤：
42.(1)土壤菌群分离：在山东省临沂市河东区梅埠街道马铃薯种植区选取马铃薯早疫病病株根际土壤进行筛选。具体步骤为：采用五点取样法采集早疫病病株根际距离地表0～ 10cm处的土样，共10份。每份土样重20g，装入采样袋，并编号及4℃保存。分别称取 10g土样放入装有90ml(250ml)无菌水中，28℃、180r/min振荡培养30min，得到土壤悬浊液。采用梯度稀释涂布平板法将其稀释为1
×
10-3
、1
×
10-4
、1
×
10-5
，每个梯度设有3 次平行，置于28℃，培养2d后，挑选形态、大小及颜色各不相同的7株菌株的单菌落在 lb固体培养基上进行划线纯化培养，编号为：wb-1、wb-2、wb-3、wk-1、wk-2，wk-3、wk-4，定期观察菌落生长情况，4℃保存备用。
43.(2)马铃薯早疫病拮抗菌株的筛选
44.初筛：采用五点对峙法，用灭菌打孔器分别在马铃薯早疫病(phytophthora infestans)、水稻恶苗病菌(bakanae oryzae)、小麦赤霉病菌(fusarium graminearum)、水稻纹枯病菌 (rhizoctonia solani)、马铃薯黑痣病菌(solanum tuberosum)及玉米大斑病菌(xanthomonasoryzae)的平板边缘打取d＝0.5cm的菌饼，将其转至于新的pda平板中央。
同时，将步骤 1中筛选到的7株菌株用灭菌牙签分别等距点接在平板四周，以只接种相应病原菌菌饼的 pda平板为对照组(ck)，放置于25℃恒温培养箱中培养，观察记录菌株对病原菌的抑制过程及程度，直到ck中的病原菌长满整个pda平板为止。
45.复筛：重复上述步骤进行复筛，获得对上述6种农业真菌病菌具有较好拮抗效果的菌株，并采用十字交叉法测定其拮抗率。
46.最终确定编号为wb-2为目标拮抗菌株，拮抗效果图如图1所示，抑菌率如表1。其中拮抗率通过下述公式计算获得：
47.拮抗率(％)＝(对照组病原菌菌落直径-处理组病原菌菌落直径)/对照组病原菌菌落直径
×
100
48.其中公式中对照菌落半径是指以下述pda培养基处理，对应的病原菌的菌落半径。
49.表1 7株功能菌株对农业真菌病原菌的拮抗率
[0050][0051]
此外，对wb-2菌株代谢产物的基因进行pcr扩增，结果显示该菌株的代谢产物中可扩增出fend(293bp)、ituc(575bp)、srfaa(273bp)、srfab(308bp)的合成基因，分别如图2 所示。
[0052]
实施例2贝莱斯芽孢杆菌的鉴定
[0053]
对贝莱斯芽孢杆菌wb-2分别进行形态学以及生理生化和分子生物学鉴定。结果如下：
[0054]
(1)形态学特征：
[0055]
拮抗细菌wb-2呈现淡黄色，边缘规则，近圆形，微凸，表面湿润，不透明，革兰氏阳性菌，可产芽孢，如图3所示。
[0056]
(2)生理生化特性：
[0057]
使用细菌微量生化鉴定管对拮抗菌株wb-2的生理生化特性进行鉴定，鉴定管均购买于青岛海博生物有限公司，具体操作方法参照使用说明书，并结合《伯杰细菌鉴定手册
(第八版)》中有关方法进行检测。
[0058]
检测结果见下表2，结果表明，供试菌株wb-2能利用多种糖类、醇类和氨基酸类物质，说明其对碳源的代谢谱较广，碳源为生物合成提供碳骨架，则有助于该菌株在土壤中的定殖。
[0059]
表2拮抗菌株wb-2的生理生化特性
[0060]
特征/characteristicswb-2特征/characteristics wb-2革兰氏染色(gram stain) 山梨醇(sorbitol) 甲基红(methyl red)-硝酸盐还原(nitrate reduction)-果糖(fructose) d-阿拉伯糖(d-arabinose) 葡萄糖(glucose) 溶菌酶(lysozyme) 麦芽糖(maltose) 甘露醇(mannitol) 乳糖(lactose) 淀粉水解(amylohydrolysis)
[0061]
注：“ ”代表反应为阳性，
“‑”
代表反应为阴性。
[0062]
(3)分子生物学特性：
[0063]
1)16s rdna基因序列(如seq id no:1所示，1044bp)及系统发育分析
[0064]
wb-2(mw365328)
[0065]
gatgcgggtgctataatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgtta gcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccg ggaaaccggggctaataccggatggttgtctgaaccgcatggttcagacataaaagg tggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaa cggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactggg actgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgg acgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagc tctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacct aaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaa gcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgt gaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcag aagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaac accagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtg gggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaag tgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggg gagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggt ggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgactcctct gacatcctaaagataggactccccttcgggggaaagtgacaggtgtgcatggttgcc tcaactccgggcctgag(seq id no:1)
[0066]
通过菌株16s rdna进化树分析，该菌株与bacillus velezensis strain c1(mk788353) 的相似度达到97％，亲缘关系最为相近，如图4所示。
[0067]
2)gyrb基因序列(如seq id no:2所示，1193bp)及系统发育分析
[0068]
wb-2(mw884255)
[0069]
atcgtcgcggagcggatataagtatccggcggtcttcacggtgtaggggcgtctgtcg taaacgccttgtcgaccactcttgacgttacggttcatcgtgacggaaaaatccacta tcaggcgtacgagcgcggtgtacctgtggccgatcttgaagtgatcggtgatactgat aagaccggaacgattacgcacttcgttccggatccggaaattttcaaagaaacaacc gtatacgactatgatctgctttcaaaccgtgtccgggaattggccttcctgacaaaag gc
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[0070]
通过菌株gyrb基因进化树分析，该菌株与bacillus velezensis strain nn95(mt119763.1) 的相似度达到94％，亲缘关系最为相近，如图5所示。
[0071]
综上所示，通过上述对拮抗菌株wb-2形态学特征、生理生化特性以及分子生物学鉴定分析，拮抗菌株wb-2被鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。将其保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3 号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.23508。
[0072]
实施例3单一防病微生物菌剂对马铃薯早疫病的防治效果验证
[0073]
首先按照如下方法制备微生物菌剂：
[0074]
步骤1：将纯化培养的贝莱斯芽孢杆菌wb-2，接种至含有100ml(250ml)lb培养液的三角瓶中，37℃，180r/min，震荡培养6h，得到发酵菌液；同时纯化接种培养产业化功能菌株：lj(贝莱斯芽孢杆菌)、45#(贝莱斯芽孢杆菌)、5#(枯草芽孢杆菌)(lj，45#， 5#均为中化化肥有限公司临沂研发中心自主筛选功能菌株)。
[0075]
步骤2：将wb-2发酵菌液接种至中试发酵罐中(10l—50l—500l)，37℃进行发酵培养后，依次进行喷雾、干燥、分装，测定其活菌数为130亿/g。与硅藻土等物料混合复配，得到贝莱斯芽孢杆菌wb-2菌粉。中试培养基配方为：玉米淀粉3.0％、豆粕4.0％、酵母粉0.15％、蔗糖1.0％、蛋白胨0.2％、磷酸氢二钾0.2％、磷酸二氢钾0.3％、氯化钠0.15％，碳酸钙0.1％、消泡剂0.3％，ph调节为7.0。单一菌与复配菌中其余菌株均按照wb-2菌粉的制备流程进行操作。
[0076]
单一菌株盆栽试验按照病原菌拮抗数据结果共设置4个处理，分别为对照组(ck-1) 不添加菌剂，处理组1(wb-3)，处理组t2-1(wb-2)，处理组t3-1(wk-3)，每组处理 5个平行，通过喷施的方法作用于马铃薯盆栽试验。单菌盆栽结果如表3显示。
[0077]
表3单一菌株盆栽效果验证结果
[0078]
编号病情指数相对防效(％)对照组(ck)83.36-处理组1(wb-3)50.2339.74处理组2(wb-2)40.8251.03
处理组3(wk-3)49.2740.89
[0079]
从表3可以看出，贝莱斯芽孢杆菌wb-2表现出最佳的效果。具体效果为：相比于ck-1，马铃薯植株早疫病的病情指数分别降低了42.54，相对防效达51.03％。
[0080]
将单一菌株盆栽验证效果较好的菌粉与马铃薯专用肥进行包膜混合制备成微生物肥料。通过底肥的方式作用于马铃薯植株，进行田间防病效果验证。具体本实施案例为：分别将单菌配方wb-2，wk-3组合分别与马铃薯专用肥进行耦合均匀后按照2
‰
添加，稳定生产得到微生物肥料，有效活菌数≥0.5亿/g。上述马铃薯专用肥为12-18-15/s。田间实验在山东省临沂市河东区梅埠街道马铃薯种植基地开展。
[0081]
单一菌处理的田间防病效果验证共设置4组处理，分别为：ck1为常规种植，t1为自研转化生产菌剂45#(贝莱斯芽孢杆菌)，添加量为1kg/亩，试验组(wb-2)，实验组(wk-3)。具体试验结果如下：
[0082]
表4功能菌株单菌有效活菌数货架期跟踪数据
[0083][0084]
表5单一菌株田间效果验证结果
[0085][0086]
单一菌菌粉与肥料12-18-15/s进行耦合数据跟踪如表4所示，wb-2效果最好，180d 活菌保留率为94％。单一菌处理田间防病效果的数据结果表5显示，经wb-2处理效果最好，相比ck1和t1，t2试验组马铃薯早疫病发病率分别降低了31.73、2.01；相对防效分别提高了45.33％、2.87％；产量分别增加7.7％、3.7％，可溶性淀粉分别增加了2.1％、4.6％。
[0087]
实施例4复合防病微生物菌剂对马铃薯早疫病的防治效果验证
[0088]
依据盆栽试验效果进行菌株复配，复合菌剂配方为将各菌粉随机复配组合为三联菌，比例均为1:1:1，复合菌理论活菌添加量均为0.5亿/g。将所制备的复配微生物菌剂进行马铃薯早疫病盆栽与田间防病效果验证。
[0089]
复合菌剂盆栽试验共设置6组处理，分别为对照组(ck)不加菌剂、市场菌剂t1(中农绿康-马铃薯专用菌剂)、试验组t3(lj、wb-2和45#复配)、试验组t5(lj、wb-2和5# 复配)，每组设置5个平行试验组。试验结果如表6显示。
[0090]
表6复配菌剂盆栽效果验证结果
[0091]
编号处理病情指数相对防效(％)ck-83.12-t1市场菌剂40.4651.35t3lj wb-2 45#32.4760.93t5lj wb-2 5#38.8953.24
[0092]
从表6可以看出，试验组t3(lj、wb-2和45#复配)表现出最佳的效果。具体效果为：相比于ck、试验组t1，马铃薯植株早疫病的病情指数分别降低了50.65、7.99，相对防效达60.93％。
[0093]
复配菌剂田间试验共设置4组处理，分别为对照组ck1、t1-1；试验组t3-1、t5-1，每组处理3小区，每个小区20m2，肥料施用量为50kg/亩。其中，ck1为常规种植，t1-1 为市场菌剂中农绿康-马铃薯专用菌剂，添加量为1kg/亩；试验组t3-1、t5-1为复配菌株盆栽试验中制备的复配菌剂。所用菌粉均与马铃薯专用肥(12-18-15/s)进行耦合用作底肥处理。复配菌剂处理的田间实验数据结果表7显示。
[0094]
表7复配菌剂田间效果验证结果
[0095][0096][0097]
从表7可以看出，试验组t3-1(lj、wb-2和45#复配)相比ck1和试验组t1-1，表现出最佳的效果。具体表现为：t3-1试验组马铃薯早疫病发病率分别降低了53.33、19.44；相对防效分别提高了76.19％、27.78％；产量分别增加18.69％、12.19％，可溶性淀粉分别增加了3.5％、26％。
[0098]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“实施方式”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0099]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。