一种靶向EphA2受体的的制作方法

一种靶向epha2受体的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01及制备方法与应用
技术领域
1.本发明涉及一种靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01及制备方法与应用，属于生物医学技术领域。


背景技术：

2.随着研究的进展，小分子多肽靶向诊断剂越来越受到大家的关注，越来越多的具有靶向性的小分子多肽正在被不断的开发出来，如rgd肽、apn肽、bbn肽、奥曲肽等等。这其中奥曲肽、rgd肽的研究最广泛。
3.pet检查(即正电子成像技术)是近年来兴起的最先进的诊断技术，它相对于传统的 spect检查(中文名称为单光子发射计算机断层成像术)，具有高空间分辨率、高清晰、高灵敏等特点，可以反应细胞能量代谢情况或细胞分子表达情况，结合ct或mri是迄今为止对肿瘤诊断敏感度最高的检查技术。目前临床上pet显像剂为
18
f-fdg，可反应全身葡萄糖代谢情况。因为肿瘤细胞高能量代谢状态，因此可以达到诊断肿瘤病灶的情况。但
18
f-fdg 显像剂也有一定的局限性。首先，
18
f-fdg只能评价肿瘤大小与代谢的改变，不能看出肿瘤内部的血管、淋巴管改变情况，往往是要在治疗几个月后，肿瘤的形态发生了改变，才能评价治疗是否有效，因此不能及时的了解治疗的效果。其次，由于
18
f-fdg是利用葡萄糖代谢的原理来进行检查的，因此不适合高血糖病人的临床检查。另外同一种肿瘤的患者其肿瘤生物学特性亦不同，肿瘤患者的个性化治疗越来越重要，如何选择合适的病人来进行靶向治疗越来越受到人们的关注。因此迫切的需要开发新型靶向诊断剂应用于临床pet显像技术。
4.科学家对放射性核素
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ga开始关注并进行研究开始于1950年，其半衰期为68分钟。因为几种
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ge/
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ga发生器的发现，从1970年始
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ga的研究重新被关注，放射性核素
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ga重新引起研究者的兴趣，有以下几点原因：一是近年正电子成像技术(pet)得到极大的发展， pet已经从一个研究工具进入临床应用阶段；二是能够稳定产生
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ga并用合适的洗脱液洗脱的
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ge/
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ga发生器已经被开发，其用合适的洗脱液洗脱
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ga后能够直接用于标记小分子药物；三是多种单功能和双功能螯合剂被开发，使生物分子稳定的标记
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ga；四是
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ge/
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ga 发生器产生
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ga不像
18
f一样需要现场加速器，只需要合适的洗脱液从
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ge/
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ga发生器淋洗。
5.rtk家族是具有细胞外配体结合区，跨膜区段和细胞内催化结构域的单次跨膜蛋白。rtk激活需要二聚化，二聚化时两个激酶结构域的接近会导致特定酪氨酸上的受体分子交叉磷酸化，这是激活的第一步。eph受体家族是rtk家族中最大的成员,已知这些受体在与配体(ephrins)结合后形成大的寡聚体，在近膜结构域和激活环上彼此酪氨酸残基交叉磷酸化，并因此引发激酶活性，这通常会导致细胞收缩并破坏细胞之间的接触，最终导致细胞迁移和侵袭性受到抑制。而非酪氨酸激酶依赖的信号传导(非经典)途径对于肿瘤恶性改变至关重要。
6.epha2是eph受体家族的一个重要成员，其规范信号依赖于ephrin-a1的结合及其酪氨酸激酶的活性来维持正常上皮细胞的状态。在癌症中，epha2通常过度表达并伴随着
ephrin 配体的丢失，在没有配体结合的情况下以与配体无关的方式促进恶性肿瘤发生和癌症进展。因此epha2的过表达与许多癌症的不良预后有关，对于由epha2过表达驱动的癌症，可能需要独特的epha2特异性治疗策略，特别是稳定epha2二聚体分子，降低epha2单体浓度，促进epha2酪氨酸激酶依赖的信号传导从而抑制肿瘤活性。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明提供了一种靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽 fg01及制备方法与应用。
8.术语说明：
9.nodaga-nhs：中文名为2,2
′‑
(7-(1-羧基-4-((2,5-二氧吡咯烷-1-基)氧基)-4-氧丁基)-1,4,7-三唑烷-1,4-二酰基)二乙酸。
10.本发明的技术方案如下：
11.一种靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01，其结构式如式(i)所示：
[0012][0013]
根据本发明优选的，所述靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01的氨基酸序列为：tyr-ser-ala-cyclo(lys-tyr-pro-asp-ser-val-pro-met-met-ser)，成环结构由10个氨基酸 kypdsvpmms组成，通过其氨基酸序列中的赖氨酸的氨基与丝氨酸的羧基形成酰胺键，形成环状多肽fg01；然后环状多肽fg01氨基端的氨基与偶联剂nodaga-nhs进行缩合反应，得到环状多肽偶联物nodaga-fg01；环状多肽偶联物nodaga-fg01中的螯合剂 nodaga与
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ga螯合，构建
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ga标记的环状多肽偶联物，即靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01。
[0014]
根据本发明优选的，所述nodaga-环状多肽fg01的结构式如式(ii)所示：
[0015]
[0016]
本发明还提供上述靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01的制备方法，包括步骤如下：
[0017]
(1)采用固相合成法合成多肽序列；
[0018]
(2)对步骤(1)制备得到的多肽进行环化，再进行纯化，得到环状多肽fg01；
[0019]
(3)制备nodaga-环状多肽fg01；
[0020]
(4)采用
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ga对步骤(3)所得nodaga-环状多肽fg01进行标记，得到靶向epha2 受体的放射性示踪剂
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ga-nodaga-环状多肽fg01。
[0021]
根据本发明优选的，所述靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01的制备方法，具体步骤如下：
[0022]
(1)采取fmoc方案，选取wang树脂，将环状多肽的羧基端带有tbu保护基团的丝氨酸连接到wang树脂上，脱掉fmoc保护基团，以结合在wang树脂上的丝氨酸作为合成起点，按照从羧基端到氨基端的氨基酸序列mmpvsdpyk分别依次进行缩合反应形成肽键(其中氨基酸s、d、y、k均为带有保护基团的氨基酸)，脱fmoc保护，缩合形成肽键，不断重复循环此步骤，直到序列全部偶联完全，将多肽从wang树脂上裂解并脱fmoc保护，得到氨基酸s、d、y、k带有保护基团的多肽序列；
[0023]
(2)通过赖氨酸的氨基与丝氨酸的羧基缩合形成肽键，将步骤(1)制备得到的多肽进行环化，然后采用三氟乙酸、三异丙基硅烷、水混合液将氨基酸s、d、y、k的保护基团脱保护，再利用相高效液相色谱仪进一步纯化，得到环状多肽fg01；
[0024]
(3)将步骤(2)得到的环状多肽fg01和nodaga-nhs、n,n-二异丙基乙胺一起混合振荡过夜，然后加入含0.1％tfa的水溶液终止反应，再利用相高效液相色谱仪进一步纯化，得到nodaga-环状多肽fg01；
[0025]
(4)将nodaga-环状多肽fg01溶解于naoac缓冲液中，向nodaga-环状多肽fg01 溶液中加入[
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ga]gacl3溶液，在70～90℃反应10～20min，得到靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01。
[0026]
根据本发明优选的，步骤(1)中，采用按体积比计，三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：水＝36：2：1：1的混合液将多肽从树脂上裂解。
[0027]
根据本发明优选的，步骤(2)中，采用按体积比计，三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝95： 2.5：2.5的混合液将保护基团水解。
[0028]
根据本发明优选的，步骤(3)中，所述环状多肽fg01、nodaga-nhs、n,n-二异丙基乙胺的摩尔比为(1～1.1)：(1.3～1.5)：(3～5)。
[0029]
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述nodaga-环状多肽fg01溶液的浓度为1～1.5nm。
[0030]
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述naoac缓冲液的浓度为1m，ph为4.6～5.2。
[0031]
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述[
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ga]gacl3溶液为0.01n hcl淋洗出来的溶液。
[0032]
根据本发明优选的，步骤(4)中，所述nodaga-环状多肽fg01溶液和[
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ga]gacl3溶液的体积比为(1～2)：(9～15)。
[0033]
本发明提供了上述靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01在肿瘤显像中的应用。
[0034]
根据本发明优选的，所述肿瘤为非小细胞肺癌。
[0035]
有益效果：
[0036]
1、本发明采用mtt方法测定了环状多肽fg01的细胞毒性，证实了环状多肽fg01对肿瘤细胞无明显的抑制作用，说明环状多肽fg01无细胞毒性；然后通过小动物pet/ct考察了靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01的肿瘤成像效果，发现靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01可以用于epha2高表达肿瘤的活体显像。实现利用pet对 epha2高表达的肿瘤如非小细胞肺癌分子显像，作为肿瘤分子显像剂而进行广泛使用。
[0037]
2、本发明提供了肿瘤显像剂靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01，并且提供了其制备方法，首次通过生物偶联技术连接了偶联剂nodaga并进行了
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ga标记，完成了靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01的构建。
附图说明
[0038]
图1是环状多肽fg01的esi-ms质谱图。
[0039]
图2是nodaga-环状多肽fg01的maldi-tof-ms质谱图。
[0040]
图3是
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ga-nodaga-环状多肽fg01放射化学纯度检测图。
[0041]
图4是
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ga-nodaga-环状多肽fg01的体外稳定性检测图。
[0042]
图5是环状多肽fg01对a549细胞mtt实验细胞毒性实验结果图。
[0043]
图6是环状多肽fg01对nci-h1299细胞mtt实验细胞毒性实验结果图。
[0044]
图7是a549细胞对
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ga-nodaga-环状多肽fg01的结合曲线(上)与解离曲线(下) 图。
[0045]
图8是nodaga-环状多肽fg01与epha2的竞争性结合曲线图。
[0046]
图9是
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ga-nodaga-环状多肽fg01与epha2的饱和结合曲线图。
[0047]
图10是放射示踪剂
68
ga和注射
68
ga-nodaga-环状多肽fg01样品1min后小鼠血液的放射化学纯度检测图。
[0048]
图中：图a是放射示踪剂
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ga，图b是
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ga-nodaga-环状多肽fg01。
[0049]
图11是注射
68
ga-nodaga-环状多肽fg01样品60min后小鼠血液(上)和注射
68
ga-nodaga-环状多肽fg01样品60min后小鼠尿液的放射化学纯度检测图。
[0050]
图12是实验组(上)与抑制组(下)的荷瘤小鼠pet显像图。
[0051]
图13是实验组与抑制组肿瘤放射性摄取率比较柱状图。
具体实施方式
[0052]
下面结合实验例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。
[0053]
实施例1
[0054]
一种靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01的制备方法，具体步骤如下：
[0055]
(1)采取fmoc方案，选取wang树脂，将环状多肽的羧基端带有tbu保护基团的丝氨酸连接到wang树脂上，脱掉fmoc保护基团，以结合在wang树脂上的丝氨酸作为合成起点，按照从羧基端到氨基端的氨基酸序列mmpvsdpyk分别依次进行缩合反应形成肽键，其中氨基酸s、d、y、k均为带有保护基团的氨基酸，脱fmoc保护，缩合形成肽键，不断重复循环此步骤，
直到序列全部偶联完全，将多肽从wang树脂上裂解并脱fmoc保护，得到氨基酸s、d、y、k带有保护基团的多肽序列；
[0056]
其中，裂解所用的溶液为按体积比计，三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：水＝36：2：1：1的混合液；
[0057]
(2)通过赖氨酸的氨基与丝氨酸的羧基缩合形成肽键，将步骤(1)制备得到的多肽进行环化，然后采用三氟乙酸、三异丙基硅烷、水混合液将氨基酸s、d、y、k的保护基团脱保护，再利用相高效液相色谱仪进一步纯化，得到环状多肽fg01；
[0058]
其中，脱保护所用的溶液为按体积比计，三氟乙酸：三异丙基硅烷：水＝95：2.5：2.5的混合液；
[0059]
(3)将步骤(2)得到的环状多肽fg01和nodaga-nhs、n,n-二异丙基乙胺一起混合振荡过夜，然后加入含0.1％tfa的水溶液终止反应，再利用相高效液相色谱仪进一步纯化，得到nodaga-环状多肽fg01；
[0060]
其中，所述环状多肽fg01、nodaga-nhs、n,n-二异丙基乙胺的摩尔比为1：1.5：3；
[0061]
(4)将nodaga-环状多肽fg01溶解于naoac缓冲液中，向nodaga-环状多肽fg01 溶液中加入[
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ga]gacl3溶液，在70～90℃反应10～20min，得到靶向epha2受体的放射性示踪剂
68
ga-nodaga-环状多肽fg01。
[0062]
其中，所述nodaga-环状多肽fg01溶液的浓度为1nm；naoac缓冲液的浓度为1m， ph为5；[
68
ga]gacl3溶液为0.01n hcl淋洗出来的溶液；nodaga-环状多肽fg01溶液和 [
68
ga]gacl3溶液的体积比为1：9。
[0063]
对本实施例步骤(2)制备的环状多肽fg01用esi-ms质谱进行表征，结果如图1所示。对本实施例步骤(3)制备的nodaga-环状多肽fg01用maldi-tof-ms质谱进行表征，结果如图2所示。
[0064]
由图1和图2可知，环状多肽fg01和多肽偶联物nodaga-环状多肽fg01的分子量与理论值一致。
[0065]
对本实施例步骤(4)制备的靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01用带有放射性检测器的分析型hplc进行放化纯度检测，结果如图3所示。
[0066]
其中，hplc流动相(a＝0.1％tfa/水，b＝0.1％tfa/乙腈)，zorbax 5μc18(250
ꢀ×
4.6mm，5μm)，具体见表1。
[0067]
表1
[0068][0069]
[0070]
由图3可知，
68
ga-nodaga-环状多肽fg01放射化学纯度大于99％。
[0071]
实施例2靶向epha2受体的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01的体外放射化学性质研究
[0072]
体外稳定性：将20μl的实施例1制备的
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ga-nodaga-环状多肽fg01加入到180μl、 ph＝7.4的pbs缓冲液中，在37℃下，分别孵育15min、30min、1h、2h、4h后取出20μl混合液注入放射性hplc进行检测，结果如图4所示。
[0073]
由图4可知体外的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01放射化学纯度无明显变化且均在95％以上，在4h内具有很好的体外稳定性。
[0074]
亲水亲脂性：0.15mbq的实施例1制备的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01用ph＝7.4的 hepes缓冲液稀释至500μl，然后继续加入500μl正辛醇并剧烈振荡。从水相和有机相各取出等量液体测量其放射性计数。脂水分配系数通过公式[log(有机相的放射性计数/水相的放射性计数)]计算出，结果如表2所示。
[0075]
表2
[0076][0077]
由表2可知，
68
ga-nodaga-环状多肽fg01具有良好的亲水性。
[0078]
实施例3靶向epha2受体的
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ga-nodaga-环状多肽fg01细胞生长抑制及细胞摄取研究
[0079]
细胞培养：在5％co2，37℃细胞培养箱中，含10％小牛血清的rpmi 1640培养基中培养非小细胞肺癌细胞(a549和nci-h1299)。
[0080]
mtt实验：分别将10μl浓度为0.039、0.195、0.976、4.88、24.4、122μm的实施例1 制备的环状多肽fg01加入到含有90μl培养液的非小细胞肺癌细胞(a549和nci-h1299) 中，在不同时间段(5、24、48和72h)观察环状多肽fg01对细胞生长的影响，结果如图 5、图6所示。
[0081]
由图5和图6可知，环状多肽fg01对非小细胞肺癌的生长无明显影响，说明环状多肽 fg01无细胞毒性。
[0082]
细胞摄取实验：将1
×
105个a549细胞在mattek玻璃底培养皿培养24小时后，用pbs 洗涤，然后在37℃下，与实施例1制备的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01(1nm)孵育2小时。epha2的结合特异性通过用ysa多肽(10nm)预孵育细胞30分钟进行阻断，然后在 37℃下用
68
ga-nodaga-环状多肽fg01(1nm)进一步孵育细胞2小时进行确认。孵育结束后，用冷pbs洗涤细胞3次，通过伽玛计数器检测细胞内放射性计数，从而拟合出细胞摄取曲线，结果如图7所示。
[0083]
其中，ysa为文献已报道的靶向epha2的链状肽，其多肽序列为：ysaypddsvpmms。
[0084]
由图7可知，2小时内细胞摄取
68
ga-nodaga-环状多肽fg01达到饱和状态；
68
ga-nodaga-环状多肽fg01与epha2的结合常数结合常数(k
on
)为0.0217nm-1
min-1
、解离常数(k
off
)为0.0835min-1
，根据kd＝k
off
/k
on
计算得到kd为3.85nm。
[0085]
实施例4靶向epha2受体的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01与受体的结合力研究
[0086]
在非小细胞肺癌细胞(a549和nci-h1299)中分别加入
125
i标记的ysa多肽及浓度为 10-13
～10-14
m的实施例1步骤(3)制备的nodaga-环状多肽fg01(nodaga-环状多肽fg01 最终
浓度为：10-14
～10-5
m)进行竞争性结合。测定细胞表面和细胞内的放射性计数，确定 nodaga-环状多肽fg01与epha2的亲和常数。
[0087]
其中，
125
i-ysa的制备方法如下：取indogen管，加入100μl 0.05m pb，2μg ysa，125μci 125
i，混匀反应二十分钟(每五分钟摇动混匀一次)后加入150μl 0.05m pb终止反应，然后使用c18小柱、水/乙醇(8/2)作为淋洗液进行分离纯化，采用氮气将
125
i-ysa淋洗液中的乙醇挥发，得到
125
i-ysa溶液用于竞争性实验研究。
[0088]
向非小细胞肺癌细胞中加入浓度为2.5、5、10、20、40、60、100、200nm的实施例1 制备的
68
ga-nodaga-fg01环状多肽(
68
ga-nodaga-fg01环状多肽最终浓度为：0.25、 0.5、1、2、4、6、10、20nm)，在37℃下孵育2h，测定细胞表面和细胞内的放射性计数，得到
68
ga-nodaga-fg01环状多肽与非小细胞肺癌的结合容量(特异性结合 非特异性结合)。非特异性结合容量通过共孵育
68
ga-nodaga-fg01环状多肽和ysa多肽(10nm)得到，进而得到
68
ga-nodaga-fg01环状多肽与受体最大特异性结合容量(b
max
)和结合力(kd)，结果如表3、图8(竞争实验曲线)和图9(饱和实验曲线)所示。
[0089]
表3
[0090][0091]
竞争实验结果表明nodaga-环状多肽fg01与epha2有着较强的受体结合力，ki值在0.5～2nm左右；饱和实验结果表明
68
ga-nodaga-环状多肽与epha2的受体结合力kd值达到nm级别，
68
ga-nodaga-环状多肽与a549细胞的受体最大结合容量b
max
约为270fmol/mg 蛋白，而与nci-h1299的受体最大结合容量b
max
约为169fmol/mg蛋白。
[0092]
实施例5靶向epha2受体的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01的体内稳定性研究
[0093]
裸鼠皮下瘤模型的建立：体外培养非小细胞肺癌a549细胞，用无血清培养液洗涤和离心两次，进行活细胞计数后以甲氧氟烷吸入方式麻醉裸鼠，将100μl含5
×
106个非小细胞肺癌细胞的无血清悬液注入裸鼠前肢左侧腋下，注射后5天开始观测裸鼠的状况，得到荷瘤小鼠模型。
[0094]
取6只健康雄性裸鼠评价实施例1制备的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01在体内的代谢稳定性。每只裸鼠经尾静脉注射约7.4mbq实施例1制备的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01，注射1min与60min后，分别取3只裸鼠收集尿液、粪便、血液、肾脏和肝脏等组织样本，处理后注入radio-hplc进行分析，结果如图10和图11所示。
[0095]
由如图10和图11可知，
68
ga-nodaga-环状多肽fg01的体内稳定性较强，1h后
68
ga-nodaga-环状多肽fg01在血液中的稳定性高于90％；此外，1h后尿液中发现
68
ga-nodaga-环状多肽fg01的代谢产物。
[0096]
实施例6靶向epha2受体
68
ga-nodaga-环状多肽fg01的体内生物学分布研究
[0097]
取荷瘤小鼠10只，分为两组，尾静脉注射7.4mbq放射性示踪剂
68
ga-nodaga-环状多肽fg01。注射示踪剂后0.5和1h分别处死5只小鼠，取血液及其它主要脏器和组织，称重并测定放射性计数，经放射性衰变校正后计算标准吸收值(suv)和每克组织的百分注射剂量率(％id/g)，结果如表4所示。
[0098]
表4
[0099][0100][0101]
由表4可知，在注射放射性示踪剂
68
ga-nodaga-环状多肽fg01 0.5h和1h后，其在肾脏的放射性沉积最高，肝脏次之，表明放射性示踪剂
68
ga-nodaga-环状多肽fg01主要通过肾脏和肝胆途径代谢。此外，血液中的suv值仅次于肝脏，说明
68
ga-nodaga-环状多肽 fg01在血液中有一定的滞留时间。
[0102]
实施例7靶向epha2受体的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01在肺癌小鼠中的pet显像
[0103]
取实施例5所述6只荷瘤小鼠分为两组，一组为实验组，一组为抑制组，每组3只小鼠。实验组直接尾静脉注射35mbq的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01，抑制组注射ysa多肽1h 后尾静脉注射约35mbq的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01。两组在注射
68
ga-nodaga-环状多肽fg01后15min、30min、45min、60min分别进行动态pet扫描，结果如图12所示。将 pet数据通过最大期望算法重建，观察肿瘤定位情况，并对照抑制组结果确定
68
ga
ꢀ‑
nodaga-环状多肽fg01的靶向性，结果如图13所示。
[0104]
由图12和图13可知，实验组肿瘤部位有明显的
68
ga-nodaga-环状多肽fg01放射性摄取，抑制组肿瘤的放射性沉积显著降低；表明
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ga-nodaga-环状多肽fg01特异性靶向 epha2受体，可以用于epha2高表达肿瘤的显像；环状多肽fg01是一种新型的靶向epha2 的环状多肽。