一种快速检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种免疫细胞及其活性测定的方法。具体而言，本发明提供了一种快速检测识别cd19和cd20的 car-t（cd19/cd20-car-t细胞）细胞活性的方法及其用途。
背景技术：
2.免疫疗法旨在增强患者自身的免疫系统以对抗疾病，可以分为主动免疫和被动免疫两大类。近年来，各种旨在诱导、加强或改造 t 细胞反应的免疫治疗策略已成为治疗癌症和自身免疫性疾病的有前途的方法。免疫疗法在肿瘤的发生发展过程中有很重要的作用，不仅可以预防癌症的发生，还可以通过增强机体的免疫力而缓解甚至治疗癌症。
3.过继性细胞治疗是细胞免疫治疗一个主要的研究方向。过继免疫细胞输注（adoptive cell transfer, act）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞( tumor-infiltrating lymphocytes，til)或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内。目前使用外周血淋巴细胞的act包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells，lak）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，cik）、树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞（dendritic cells-cytokine induced killer，dc-cik）、抗cd3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti-cd3 antibody-induced activated killer cells, cd3-ak cells）等。然而cik等是非特异性活化的淋巴细胞，缺乏肿瘤特异性反应能力。
4.在这种情况下，科学家开始通过基因修饰，将识别肿瘤抗原的t细胞受体（t cell receptor, tcr）或car基因导入淋巴细胞使之成为tcr基因修饰t淋巴细胞（tcr-t）或car-t细胞，使之具备肿瘤抗原靶向识别能力。在car-t细胞治疗制备过程中，制备完成的car-t细胞的激活活性的鉴定和质控是至关重要的一个环节。car-t细胞治疗综合运用了识别和靶向疾病的抗体技术，它是一种活体药物，不仅不会像传统药物被代谢掉，还会在病人体内复制，或者形成记忆细胞，一次给药可以延续很长时间。与单抗治疗相比，car-t细胞治疗具有许多优势，如强大的体外扩增能力、体内存续时间久、针对低表达量的靶分子仍然有效等。car-t细胞治疗目前已成功运用于多种肿瘤疾病的临床试验中，包括多数血液肿瘤以及肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、神经肿瘤等实体瘤。
5.传统的抗肿瘤方法效果检测包括血液指标、瘤体大小、细胞成分分析等等，但是这些方法往往耗时较长，或者属于定性检测结果而指导作用不明确。
技术实现要素：
6.本发明要解决的技术问题是开发一种基于生物发光报告基因的生物方法，可以在cd19和cd20 car-t 制备完成后，快速准确的评估car-t细胞活化和活性。
7.本发明提供了一种检测cd19/cd20-car-t细胞活性的工程细胞。所述的细胞是含有nfat-re-luciferase载体的肿瘤细胞株，所述的含有nfat-re-luciferase载体的肿瘤细
胞株中含有cd19抗体和/或cd20抗体的编码序列，nfat-re-luciferase中nfat-re与luciferase 串联。
8.肿瘤细胞可以选用各种已经永生化或者商品化的细胞，通常是atcc或者中国科学院生命科学分院细胞库中可以提供的细胞，也可以针对具体的肿瘤或者癌症类型进行细胞改造，例如，对于血液类癌症可以使用各种相应的悬浮癌细胞。但是，并非所有的肿瘤细胞都适于本发明，在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤细胞是k562细胞。
9.nfat(nuclear factor of activated t cells)转录因子家族在免疫反应中对多种细胞因子的表达有重要作用，也参与了肿瘤免疫、心肌功能调控、凋亡等多种功能，包括钙调蛋白和蛋白激酶c在内的多种信号通路都可以通过nfat发挥作用。nfat-re-luci稳转细胞株的基因组中稳定整合nfat控制表达的luciferase基因。nfat激活启动luciferase表达，通过检测luciferase活性可以灵敏地反应nfat通路的状态。
10.cd19是簇分化抗原的一种，是b细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原。cd19分布于全体b细胞、毛细胞白血病细胞等恶性b细胞、滤泡树状细胞上，因此是诊断b细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定b细胞最好的标记。
11.cd20表达于除浆细胞(分泌免疫球蛋白的b细胞)外的发育分化各阶段的b细胞的表面，通过调节跨膜钙离子流动直接对b细胞起作用，在b细胞增殖和分化中起重要的调节作用。
12.本发明中cd19和cd20的序列是从各种来源中筛选获得的，例如本发明的一个优选例中使用噬菌体筛选技术获得cd19和cd20的序列。
13.本发明的一个优选例中，cd19抗体的氨基酸序列为：levqvpedpvvalvgtdatlccsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsfaegqdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyqgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsilrvvlgangtysclvrnpvlqqdahssvtitpqrsptgavevqvpedpvvalvgtdatlrcsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsftegrdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyrgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsvlrvvlgangtysclvrnpvlqqdahgsvtitgqpmtfppea（seq id no 1）。
14.cd20抗体的氨基酸序列为：ggvliqrnpqlcyqdtilwkdifhknnqlaltlidtnrsrachpcspmckgsrcwgessedcqsltrtvcaggcarckgplptdccheqcaagctgpkhsdclaclhfnhsgicelhcpalvtyntdtfesmpnpegrytfgascvtacpynylstdvgsctlvcplhnqevtaedgtqrcekcskpcarvcyglgmehlrevravtsaniqefagckkifgslaflpesfdgdpasntaplqpeqlqvfetleeitgylyisawpdslpdlsvfqnlqvirgrilhngaysltlqglgiswlglrslrelgsglalihhnthlcfvhtvpwdqlfrnphqallhtanrpedecvgeglachqlcarghcwgpgptqcvncsqflrgqecveecrvlqglpreyvnarhclpchpecqpqngsvtcfgpeadqcvacahykdppfcvarcpsgvkpdlsympiwkfpdeegacqpcpincthscvdlddkgcpaeqrasplts（seq id no 2）。
15.本发明中的nfat-re-luciferase-k562细胞能够识别体系中的cd19和/或cd20的信号。
16.本发明还提供了所述细胞的制备方法，将cd19抗体和/或cd20抗体的编码序列与luciferase荧光素酶的基因共同重组表达在慢病毒质粒中或者将cd19抗体和/或cd20抗体
的编码序列插入nfat-re-luciferase载体。
17.较好的，所述的制备方法包括以下步骤：（1）在k562悬浮细胞中加入转染试剂，充分混匀，孵育；（2）2-6小时后，加入培养基以稀释转染试剂或者更换基础培养基；（3）继续培养3-4天，视细胞生长情况传代或换液；（4）获得稳定表达nfat-re-luciferase k562细胞株。
18.较好的，转染时将含有转染试剂和待转染细胞的混合物在120g-200速度条件下离心3-4小时，以使某些较难转染或者转染效率较低的细胞获得较好的转染效果。较好的，离心速度是150g-180g，例如160g或者170g，具体的离心转速可以根据离心机和实际情况调整。较好的，离心的温度可以采用18-26℃，更好的采用20-25℃。例如，采用室温或者21℃、22℃、23℃、24℃，等等。
19.另一方面，本发明提供了一种检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法，包括以下步骤：s1, 将待测细胞与含有nfat-re-luciferase的肿瘤细胞混合培养，和s2, 共培养2-6个小时后，检测荧光信号强度，s3, 根据含有nfat-re-luciferase的肿瘤细胞产生的荧光强度不同，判断抗原的亲和力的高低和cd19 /cd20 car-t的细胞活性；其中，待测细胞与含有nfat-re-luciferase的肿瘤细胞混合体系中，αcd19-car：carrier或者αcd20-car：carrier的比值为0：10-10：0，不包括0：10或者10:0。
20.本发明中制备出了基于生物发光报告基因的生物测定法来评估 cd19 /cd20 car-t 细胞活性生物测定方法。
21.本发明中，cd19/cd20-car-t细胞是携带cd19和/或cd20的car-t细胞。较好的，所述的待测细胞是携带cd19抗原或者cd20抗原的car-t细胞或者raji细胞。
22.较好的，共培养的时间是3-4小时，或者使用酶标仪检测含有nfat-re-luciferase的肿瘤细胞的荧光信号强度。
23.本发明还涉及一种细胞混合物，所述的细胞至少包括：nfat-re-luciferase-k562细胞和cd19/cd20-car-t细胞。
24.较好的，所述的细胞混合物中，αcd20-car：carrier的比值为1:9-1:2。αcd20-car和carrier载体的比例范围可以采用质量百分比或者物质的量百分比。更好的，这两种成分的比值为1：8-1：3，甚至1：5-1：6，具体的优选比例收到所用细胞和细胞混合物中其他成分的影响。
25.本发明还提供了检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法的应用，将 nfat-re（cd19/20）
‑ꢀ
luciferase组合用于cd19/cd20-car-t细胞的设计和构建，基于生物发光报告基因的生物测定法来评估 cd19 /cd20 car-t 细胞活性。
26.本发明开发了一种基于生物发光报告基因的生物测定法来评估 cd19 /cd20car-t 细胞活化生物测定方法，利用慢病毒转染k562细胞构建稳定表达报告基因的工程细胞株，在与表达抗原的细胞共培养时，可以传递信号，从而激发工程化的k562细胞中荧光基因表达，产生不同强度的荧光，从而判断不同比例的cd19/20 car-t 转染后细胞活化情况。本发明的方法操作简便，高效快捷，能够快速直观的获得cd19 /cd20car-t 细胞中cd19 /
cd20的情况，评估cd19/cd20car-t细胞的构建情况和细胞活性。
附图说明
27.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1是工程细胞株1载体构建模式图。
29.其中，nfat-re与luciferase串联。nfat-re-luciferase-k562是稳转细胞株，用nfat-re驱动荧光素酶表达的k562细胞，对cd3有反应，但对cd28刺激没有反应。
30.图2是nfat-re-luciferase-k562细胞株用于cd19/cd20car-t不同的荧光强度结果图。
31.其中，检测结果分成raji细胞共培养组和无raji细胞共培养组两组。从左到右的比例依次为αcd19-car：carrier（载体）=10：0，αcd19-car：carrier=3.3：6.6，αcd19-car：carrier=1：9，αcd19-car：carrier=0：10；αcd20-car：carrier=10：0，αcd20-car：carrier=3.3：6.6，αcd20-car：carrier=1：9，αcd20-car：carrier=0：10。raji细胞共培养组中，除了两个0：10小组，其余小组与无raji细胞共培养组相比，荧光强度都有显著增加，本发明的car-t细胞能够特异性的识别raji细胞（cd19/cd20）。四小组10：0，3.3：6.6，1：9，0：10的荧光强度依次降低，其中，最高的是αcd20-car与carrier的比例为10：0的小组，达到约9.8*105。raji细胞共培养组内8个小组的荧光强度数值从左到右依次约为4.8*105、2.7*105、1.2*105、略高于无raji细胞共培养组、9.8*105、4.3*105、1.9*105、略高于无raji细胞共培养组。从图2可以看出，相比于cd19，nfat-re-luciferase-k562细胞株检测cd20获得的荧光强度普遍更强一些。
具体实施方式
32.下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
33.实施例1.nfat-re-luciferase-k562稳转细胞株的构建nfat-re-luciferase-k562效应细胞是用nfat-re驱动荧光素酶表达的k562细胞，对cd3有反应，但对cd28刺激没有反应。
34.1）nfat-re-luciferase慢病毒质粒的构建和包装nfat-re中的cd19/cd20抗体的序列为我们通过噬菌体筛检技术获得，通过基于工程与uniprot数据库中公开的luciferase荧光素酶的基因重组表达在慢病毒质粒pmdl中，使用293细胞进行病毒的包装和收集。
35.cd19抗体的氨基酸序列：levqvpedpvvalvgtdatlccsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsfaegqdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyqgyp
eaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsilrvvlgangtysclvrnpvlqqdahssvtitpqrsptgavevqvpedpvvalvgtdatlrcsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsftegrdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyrgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsvlrvvlgangtysclvrnpvlqqdahgsvtitgqpmtfppea(seq id no 1)。
36.cd20抗体的氨基酸序列：ggvliqrnpqlcyqdtilwkdifhknnqlaltlidtnrsrachpcspmckgsrcwgessedcqsltrtvcaggcarckgplptdccheqcaagctgpkhsdclaclhfnhsgicelhcpalvtyntdtfesmpnpegrytfgascvtacpynylstdvgsctlvcplhnqevtaedgtqrcekcskpcarvcyglgmehlrevravtsaniqefagckkifgslaflpesfdgdpasntaplqpeqlqvfetleeitgylyisawpdslpdlsvfqnlqvirgrilhngaysltlqglgiswlglrslrelgsglalihhnthlcfvhtvpwdqlfrnphqallhtanrpedecvgeglachqlcarghcwgpgptqcvncsqflrgqecveecrvlqglpreyvnarhclpchpecqpqngsvtcfgpeadqcvacahykdppfcvarcpsgvkpdlsympiwkfpdeegacqpcpincthscvdlddkgcpaeqrasplts(seq id no 2)。
37.2）k562细胞的复苏和培养：复苏k562细胞，加入1640培养液 10�s，用50ml培养瓶培养，在细胞汇合度70%～80%时进行传代培养。
38.3）k562细胞的转染：（1）在2
×
105/ml的k562悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时。
39.（2）4小时后，加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
40.（3）继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
41.（4）获得稳定表达nfat-re-luciferase k562细胞株。
42.实施例2. nfat-re-luciferase-k562稳转细胞株用于评估cd19 /cd20 car-t受体的活性1）raji细胞培养raji为一种高表达cd19抗原的肿瘤细胞。从液氮罐中复苏raji细胞，使用含有10%新生小牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml链霉素、2.5 g/l葡萄糖、0.11 g/l丙酮酸钠、1.5 g/l碳酸氢钠的rpmi 1640培养液，ph值7.2，5% co2、37 ℃、相对湿度90%的条件培养raji细胞，2 d传代一次。
43.2）nfat-re-luciferase-k562稳转细胞株活性检测将raji细胞与nfat-re-luciferase-k562按照不同的比例混合培养，共培养4个小时后，使用酶标仪检测k562细胞的荧光信号强度，根据k562细胞产生的荧光强度不同，判断抗原的亲和力的高低和cd19 /cd20 car-t设计的优劣。
44.检测结果分成raji细胞共培养组和无raji细胞共培养组两组。每一组中，从左到右αcd19-car与carrier的比例依次为10：0，3.3：6.6，1：9，0：10；αcd20-car与carrier的比例依次也是10：0，3.3：6.6，1：9，0：10。raji细胞共培养组中，除了两个0：10小组，其余小组与无raji细胞共培养组相比，荧光强度都有显著增加。最高的是αcd20-car与carrier的比例为10：0的小组，达到约9.8*105，其次是αcd19-car与carrier的比例为10：0的小组，达到约4.8*105。10：0，3.3：6.6，1：9，0：10四小组的荧光强度依次降低（图2）。
45.以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，涉及一种免疫细胞及其活性测定的方法。具体而言，本发明提供了一种快速检测识别cd19和cd20的 car-t（cd19/cd20-car-t细胞）细胞活性的方法及其用途。
背景技术：
2.免疫疗法旨在增强患者自身的免疫系统以对抗疾病，可以分为主动免疫和被动免疫两大类。近年来，各种旨在诱导、加强或改造 t 细胞反应的免疫治疗策略已成为治疗癌症和自身免疫性疾病的有前途的方法。免疫疗法在肿瘤的发生发展过程中有很重要的作用，不仅可以预防癌症的发生，还可以通过增强机体的免疫力而缓解甚至治疗癌症。
3.过继性细胞治疗是细胞免疫治疗一个主要的研究方向。过继免疫细胞输注（adoptive cell transfer, act）属于肿瘤的被动免疫疗法，指的是分离肿瘤患者自体肿瘤浸润淋巴细胞( tumor-infiltrating lymphocytes，til)或者外周血淋巴细胞，在体外加以分选、扩增、活化，并回输至患者体内。目前使用外周血淋巴细胞的act包括淋巴因子激活的杀伤细胞（lymphokine activated killer cells，lak）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer，cik）、树突细胞-细胞因子诱导杀伤细胞（dendritic cells-cytokine induced killer，dc-cik）、抗cd3抗体诱导的活化杀伤细胞（anti-cd3 antibody-induced activated killer cells, cd3-ak cells）等。然而cik等是非特异性活化的淋巴细胞，缺乏肿瘤特异性反应能力。
4.在这种情况下，科学家开始通过基因修饰，将识别肿瘤抗原的t细胞受体（t cell receptor, tcr）或car基因导入淋巴细胞使之成为tcr基因修饰t淋巴细胞（tcr-t）或car-t细胞，使之具备肿瘤抗原靶向识别能力。在car-t细胞治疗制备过程中，制备完成的car-t细胞的激活活性的鉴定和质控是至关重要的一个环节。car-t细胞治疗综合运用了识别和靶向疾病的抗体技术，它是一种活体药物，不仅不会像传统药物被代谢掉，还会在病人体内复制，或者形成记忆细胞，一次给药可以延续很长时间。与单抗治疗相比，car-t细胞治疗具有许多优势，如强大的体外扩增能力、体内存续时间久、针对低表达量的靶分子仍然有效等。car-t细胞治疗目前已成功运用于多种肿瘤疾病的临床试验中，包括多数血液肿瘤以及肾脏肿瘤、肝脏肿瘤、神经肿瘤等实体瘤。
5.传统的抗肿瘤方法效果检测包括血液指标、瘤体大小、细胞成分分析等等，但是这些方法往往耗时较长，或者属于定性检测结果而指导作用不明确。
技术实现要素：
6.本发明要解决的技术问题是开发一种基于生物发光报告基因的生物方法，可以在cd19和cd20 car-t 制备完成后，快速准确的评估car-t细胞活化和活性。
7.本发明提供了一种检测cd19/cd20-car-t细胞活性的工程细胞。所述的细胞是含有nfat-re-luciferase载体的肿瘤细胞株，所述的含有nfat-re-luciferase载体的肿瘤细
胞株中含有cd19抗体和/或cd20抗体的编码序列，nfat-re-luciferase中nfat-re与luciferase 串联。
8.肿瘤细胞可以选用各种已经永生化或者商品化的细胞，通常是atcc或者中国科学院生命科学分院细胞库中可以提供的细胞，也可以针对具体的肿瘤或者癌症类型进行细胞改造，例如，对于血液类癌症可以使用各种相应的悬浮癌细胞。但是，并非所有的肿瘤细胞都适于本发明，在本发明的一个优选例中，所述的肿瘤细胞是k562细胞。
9.nfat(nuclear factor of activated t cells)转录因子家族在免疫反应中对多种细胞因子的表达有重要作用，也参与了肿瘤免疫、心肌功能调控、凋亡等多种功能，包括钙调蛋白和蛋白激酶c在内的多种信号通路都可以通过nfat发挥作用。nfat-re-luci稳转细胞株的基因组中稳定整合nfat控制表达的luciferase基因。nfat激活启动luciferase表达，通过检测luciferase活性可以灵敏地反应nfat通路的状态。
10.cd19是簇分化抗原的一种，是b细胞增殖、分化、活化及抗体产生有关的重要膜抗原。cd19分布于全体b细胞、毛细胞白血病细胞等恶性b细胞、滤泡树状细胞上，因此是诊断b细胞系肿瘤(白血病、淋巴瘤)和鉴定b细胞最好的标记。
11.cd20表达于除浆细胞(分泌免疫球蛋白的b细胞)外的发育分化各阶段的b细胞的表面，通过调节跨膜钙离子流动直接对b细胞起作用，在b细胞增殖和分化中起重要的调节作用。
12.本发明中cd19和cd20的序列是从各种来源中筛选获得的，例如本发明的一个优选例中使用噬菌体筛选技术获得cd19和cd20的序列。
13.本发明的一个优选例中，cd19抗体的氨基酸序列为：levqvpedpvvalvgtdatlccsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsfaegqdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyqgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsilrvvlgangtysclvrnpvlqqdahssvtitpqrsptgavevqvpedpvvalvgtdatlrcsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsftegrdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyrgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsvlrvvlgangtysclvrnpvlqqdahgsvtitgqpmtfppea（seq id no 1）。
14.cd20抗体的氨基酸序列为：ggvliqrnpqlcyqdtilwkdifhknnqlaltlidtnrsrachpcspmckgsrcwgessedcqsltrtvcaggcarckgplptdccheqcaagctgpkhsdclaclhfnhsgicelhcpalvtyntdtfesmpnpegrytfgascvtacpynylstdvgsctlvcplhnqevtaedgtqrcekcskpcarvcyglgmehlrevravtsaniqefagckkifgslaflpesfdgdpasntaplqpeqlqvfetleeitgylyisawpdslpdlsvfqnlqvirgrilhngaysltlqglgiswlglrslrelgsglalihhnthlcfvhtvpwdqlfrnphqallhtanrpedecvgeglachqlcarghcwgpgptqcvncsqflrgqecveecrvlqglpreyvnarhclpchpecqpqngsvtcfgpeadqcvacahykdppfcvarcpsgvkpdlsympiwkfpdeegacqpcpincthscvdlddkgcpaeqrasplts（seq id no 2）。
15.本发明中的nfat-re-luciferase-k562细胞能够识别体系中的cd19和/或cd20的信号。
16.本发明还提供了所述细胞的制备方法，将cd19抗体和/或cd20抗体的编码序列与luciferase荧光素酶的基因共同重组表达在慢病毒质粒中或者将cd19抗体和/或cd20抗体
的编码序列插入nfat-re-luciferase载体。
17.较好的，所述的制备方法包括以下步骤：（1）在k562悬浮细胞中加入转染试剂，充分混匀，孵育；（2）2-6小时后，加入培养基以稀释转染试剂或者更换基础培养基；（3）继续培养3-4天，视细胞生长情况传代或换液；（4）获得稳定表达nfat-re-luciferase k562细胞株。
18.较好的，转染时将含有转染试剂和待转染细胞的混合物在120g-200速度条件下离心3-4小时，以使某些较难转染或者转染效率较低的细胞获得较好的转染效果。较好的，离心速度是150g-180g，例如160g或者170g，具体的离心转速可以根据离心机和实际情况调整。较好的，离心的温度可以采用18-26℃，更好的采用20-25℃。例如，采用室温或者21℃、22℃、23℃、24℃，等等。
19.另一方面，本发明提供了一种检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法，包括以下步骤：s1, 将待测细胞与含有nfat-re-luciferase的肿瘤细胞混合培养，和s2, 共培养2-6个小时后，检测荧光信号强度，s3, 根据含有nfat-re-luciferase的肿瘤细胞产生的荧光强度不同，判断抗原的亲和力的高低和cd19 /cd20 car-t的细胞活性；其中，待测细胞与含有nfat-re-luciferase的肿瘤细胞混合体系中，αcd19-car：carrier或者αcd20-car：carrier的比值为0：10-10：0，不包括0：10或者10:0。
20.本发明中制备出了基于生物发光报告基因的生物测定法来评估 cd19 /cd20 car-t 细胞活性生物测定方法。
21.本发明中，cd19/cd20-car-t细胞是携带cd19和/或cd20的car-t细胞。较好的，所述的待测细胞是携带cd19抗原或者cd20抗原的car-t细胞或者raji细胞。
22.较好的，共培养的时间是3-4小时，或者使用酶标仪检测含有nfat-re-luciferase的肿瘤细胞的荧光信号强度。
23.本发明还涉及一种细胞混合物，所述的细胞至少包括：nfat-re-luciferase-k562细胞和cd19/cd20-car-t细胞。
24.较好的，所述的细胞混合物中，αcd20-car：carrier的比值为1:9-1:2。αcd20-car和carrier载体的比例范围可以采用质量百分比或者物质的量百分比。更好的，这两种成分的比值为1：8-1：3，甚至1：5-1：6，具体的优选比例收到所用细胞和细胞混合物中其他成分的影响。
25.本发明还提供了检测cd19/cd20-car-t细胞活性的方法的应用，将 nfat-re（cd19/20）
‑ꢀ
luciferase组合用于cd19/cd20-car-t细胞的设计和构建，基于生物发光报告基因的生物测定法来评估 cd19 /cd20 car-t 细胞活性。
26.本发明开发了一种基于生物发光报告基因的生物测定法来评估 cd19 /cd20car-t 细胞活化生物测定方法，利用慢病毒转染k562细胞构建稳定表达报告基因的工程细胞株，在与表达抗原的细胞共培养时，可以传递信号，从而激发工程化的k562细胞中荧光基因表达，产生不同强度的荧光，从而判断不同比例的cd19/20 car-t 转染后细胞活化情况。本发明的方法操作简便，高效快捷，能够快速直观的获得cd19 /cd20car-t 细胞中cd19 /
cd20的情况，评估cd19/cd20car-t细胞的构建情况和细胞活性。
附图说明
27.为了更清楚地说明本技术实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
28.图1是工程细胞株1载体构建模式图。
29.其中，nfat-re与luciferase串联。nfat-re-luciferase-k562是稳转细胞株，用nfat-re驱动荧光素酶表达的k562细胞，对cd3有反应，但对cd28刺激没有反应。
30.图2是nfat-re-luciferase-k562细胞株用于cd19/cd20car-t不同的荧光强度结果图。
31.其中，检测结果分成raji细胞共培养组和无raji细胞共培养组两组。从左到右的比例依次为αcd19-car：carrier（载体）=10：0，αcd19-car：carrier=3.3：6.6，αcd19-car：carrier=1：9，αcd19-car：carrier=0：10；αcd20-car：carrier=10：0，αcd20-car：carrier=3.3：6.6，αcd20-car：carrier=1：9，αcd20-car：carrier=0：10。raji细胞共培养组中，除了两个0：10小组，其余小组与无raji细胞共培养组相比，荧光强度都有显著增加，本发明的car-t细胞能够特异性的识别raji细胞（cd19/cd20）。四小组10：0，3.3：6.6，1：9，0：10的荧光强度依次降低，其中，最高的是αcd20-car与carrier的比例为10：0的小组，达到约9.8*105。raji细胞共培养组内8个小组的荧光强度数值从左到右依次约为4.8*105、2.7*105、1.2*105、略高于无raji细胞共培养组、9.8*105、4.3*105、1.9*105、略高于无raji细胞共培养组。从图2可以看出，相比于cd19，nfat-re-luciferase-k562细胞株检测cd20获得的荧光强度普遍更强一些。
具体实施方式
32.下面将对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
33.实施例1.nfat-re-luciferase-k562稳转细胞株的构建nfat-re-luciferase-k562效应细胞是用nfat-re驱动荧光素酶表达的k562细胞，对cd3有反应，但对cd28刺激没有反应。
34.1）nfat-re-luciferase慢病毒质粒的构建和包装nfat-re中的cd19/cd20抗体的序列为我们通过噬菌体筛检技术获得，通过基于工程与uniprot数据库中公开的luciferase荧光素酶的基因重组表达在慢病毒质粒pmdl中，使用293细胞进行病毒的包装和收集。
35.cd19抗体的氨基酸序列：levqvpedpvvalvgtdatlccsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsfaegqdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyqgyp
eaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsilrvvlgangtysclvrnpvlqqdahssvtitpqrsptgavevqvpedpvvalvgtdatlrcsfspepgfslaqlnliwqltdtkqlvhsftegrdqgsayanrtalfpdllaqgnaslrlqrvrvadegsftcfvsirdfgsaavslqvaapyskpsmtlepnkdlrpgdtvtitcssyrgypeaevfwqdgqgvpltgnvttsqmaneqglfdvhsvlrvvlgangtysclvrnpvlqqdahgsvtitgqpmtfppea(seq id no 1)。
36.cd20抗体的氨基酸序列：ggvliqrnpqlcyqdtilwkdifhknnqlaltlidtnrsrachpcspmckgsrcwgessedcqsltrtvcaggcarckgplptdccheqcaagctgpkhsdclaclhfnhsgicelhcpalvtyntdtfesmpnpegrytfgascvtacpynylstdvgsctlvcplhnqevtaedgtqrcekcskpcarvcyglgmehlrevravtsaniqefagckkifgslaflpesfdgdpasntaplqpeqlqvfetleeitgylyisawpdslpdlsvfqnlqvirgrilhngaysltlqglgiswlglrslrelgsglalihhnthlcfvhtvpwdqlfrnphqallhtanrpedecvgeglachqlcarghcwgpgptqcvncsqflrgqecveecrvlqglpreyvnarhclpchpecqpqngsvtcfgpeadqcvacahykdppfcvarcpsgvkpdlsympiwkfpdeegacqpcpincthscvdlddkgcpaeqrasplts(seq id no 2)。
37.2）k562细胞的复苏和培养：复苏k562细胞，加入1640培养液 10�s，用50ml培养瓶培养，在细胞汇合度70%～80%时进行传代培养。
38.3）k562细胞的转染：（1）在2
×
105/ml的k562悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。37℃孵育。或者150g室温离心4小时。
39.（2）4小时后，加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
40.（3）继续培养3-4天。中间视细胞生长情况可传代或换液。
41.（4）获得稳定表达nfat-re-luciferase k562细胞株。
42.实施例2. nfat-re-luciferase-k562稳转细胞株用于评估cd19 /cd20 car-t受体的活性1）raji细胞培养raji为一种高表达cd19抗原的肿瘤细胞。从液氮罐中复苏raji细胞，使用含有10%新生小牛血清、100 u/ml青霉素、100 u/ml链霉素、2.5 g/l葡萄糖、0.11 g/l丙酮酸钠、1.5 g/l碳酸氢钠的rpmi 1640培养液，ph值7.2，5% co2、37 ℃、相对湿度90%的条件培养raji细胞，2 d传代一次。
43.2）nfat-re-luciferase-k562稳转细胞株活性检测将raji细胞与nfat-re-luciferase-k562按照不同的比例混合培养，共培养4个小时后，使用酶标仪检测k562细胞的荧光信号强度，根据k562细胞产生的荧光强度不同，判断抗原的亲和力的高低和cd19 /cd20 car-t设计的优劣。
44.检测结果分成raji细胞共培养组和无raji细胞共培养组两组。每一组中，从左到右αcd19-car与carrier的比例依次为10：0，3.3：6.6，1：9，0：10；αcd20-car与carrier的比例依次也是10：0，3.3：6.6，1：9，0：10。raji细胞共培养组中，除了两个0：10小组，其余小组与无raji细胞共培养组相比，荧光强度都有显著增加。最高的是αcd20-car与carrier的比例为10：0的小组，达到约9.8*105，其次是αcd19-car与carrier的比例为10：0的小组，达到约4.8*105。10：0，3.3：6.6，1：9，0：10四小组的荧光强度依次降低（图2）。
45.以上所述，仅为本技术的具体实施方式，但本技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域技术的技术人员在本技术公开的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本技术的保护范围之内。因此，本技术的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
再多了解一些
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