注射用重组胶原蛋白水凝胶及其制备方法与流程

1.本发明属于生物医学材料技术领域，涉及一种注射用重组胶原蛋白水凝胶及其制备方法。


背景技术：

2.皮肤是人体最大的器官，是机体第一道保护屏障，对于抵御外界侵害、维持内环境的稳定发挥着至关重要的作用。皮肤老化是机体衰老的一部分，而机体衰老在皮肤上表现最为明显。目前一般把皮肤老化分为遗传因素及不可抗力因素(如重力、机体内分泌及免疫功能随机体衰老的改变)引起的固有性老化，又称自然老化，以及由环境因素如太阳辐射、接触化学物质、干燥等造成皮肤的衰老为外源性老化。其中光老化特指由于长期的紫外线暴露所引起的皮肤老化，光老化的临床症状包括皱纹、色素沉着、干燥、弹性丧失等。过量的紫外照射往往引起皮肤一系列的氧化应激反应，如诱导产生大量的活性氧如羟基自由基、超氧自由基、过氧自由基等。活跃自由基的大量产生，使自由基与抗氧化剂之间的平衡被打破，易造成细胞膜、dna、脂质和蛋白质的损伤，也是皮肤老化的主要原因。
3.随着皮肤老化，皮肤的外观和机械性能都发生了深刻的变化，最常见的表现为面部组织的松弛和皱纹等的产生。面部组织松弛的主要原因是面部容量的流失和脂肪的分布不均衡。研究表明注射填充物可较好地减轻面部松弛松垂、补充容量缺失、重塑面部轮廓以及改善皮肤质量等。局部注射填充物因操作简便、损伤小且生物相容性好等优势，已成为最常用的方法。
4.目前对于填充剂的研究，主要针对由于自然老化而导致的面部松弛的填充。例如中国专利申请201310268278.2公开了一种注射用胶原蛋白水凝胶及其制备方法，该水凝胶无生物学毒性且保留时间长；中国专利申请202010674496.6公开了一种注射用交联透明质酸凝胶的制备及应用，该方法制备的水凝胶交联效率高、均匀性好，在体内维持时间久。然而上述水凝胶均仅适用于减轻自然老化导致的面部松弛松垂、补充容量缺失和重塑面部轮廓等，无法改善光老化所造成的皮肤损伤。


技术实现要素：

5.本发明提供一种可减轻面部容量流失、改善光老化造成的皮肤损伤的注射用重组胶原蛋白水凝胶及其制备方法。
6.本发明的技术方案如下：
7.注射用重组胶原蛋白水凝胶的制备方法，具体步骤如下：
8.(1)将重组胶原蛋白和茶多酚溶于碱性溶液中，得到ph值为9～13的预混液，其中重组胶原蛋白质量为碱性溶液质量的6wt％～30wt％，茶多酚质量为碱性溶液质量的5wt％～15wt％；
9.(2)将交联剂加入预混液中，混合均匀后得到混合溶液；
10.(3)将混合溶液在50～80℃下水浴加热，进行交联反应，得到交联重组胶原蛋白水
凝胶；
11.(4)将交联重组胶原蛋白水凝胶凝胶切块，置于缓冲溶液中，搅拌清洗，经均质后灌装、灭菌，得到注射用重组胶原蛋白水凝胶。
12.优选地，步骤(1)中，重组胶原蛋白由保藏编号为cgmcc no.5021的巴斯德毕赤酵母pichia pastoris发酵所产生。
13.优选地，步骤(1)中，碱性溶液为氢氧化钠溶液或碳酸钠溶液。
14.优选地，步骤(1)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.05mmol/l～12.5mmol/l。
15.优选地，步骤(1)中，重组胶原蛋白质量为碱性溶液质量的10wt％～20wt％。
16.优选地，步骤(1)中，茶多酚质量为碱性溶液质量的10wt％～15wt％。
17.优选地，步骤(1)中，预混液的ph值为10～12。
18.优选地，步骤(2)中，交联剂选自1,4-丁二醇二环氧甘油醚(bdde)、3-氯-1,2-环氧丙烷、1,3-二环氧丁烷、碳化二亚胺或1,2,7,8-二环氧辛烷等环氧类化合物，更优选为1,4-丁二醇二环氧甘油醚(bdde)。
19.优选地，步骤(2)中，1,4-丁二醇二环氧甘油醚质量为预混液质量的1.4wt％～2.6wt％，更优选为1.6wt％～2.1wt％。
20.优选地，步骤(3)中，加热温度为55～65℃。
21.优选地，步骤(3)中，交联反应时间为0.5～4h，优选为1.5～3h。
22.优选地，步骤(4)中，块状凝胶的体积为0.5cm3～3cm3，更优选为1cm3。
23.优选地，步骤(4)中，缓冲溶液为生理盐水或磷酸盐缓冲溶液；清洗时间为4～36h，更优选为8～24h。
24.优选地，步骤(4)中，可注射用重组胶原蛋白水凝胶的粒径为50μm-1000μm。
25.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
26.本发明以具有良好生物相容性的天然高分子材料重组胶原蛋白为原料，引入交联剂形成水凝胶，通过均质和灭菌制备注射用重组胶原蛋白水凝胶，可作为面部重塑的软组织填充物，其具有良好的生物相容性、非免疫原性及发生不良反应风险低等特点。同时，在交联前添加茶多酚，茶多酚与交联重组胶原蛋白水凝胶通过席夫碱反应接枝在凝胶上，通过缓释作用而改善由于光老化所造成的暴露部位皮肤的松弛、粗糙、皱纹加深、不规则性色素沉着、表皮角化不良和异常增殖等问题。
附图说明
27.表1为经均质后凝胶的流变学性能、bdde含量和灭菌前后的动力黏度。
28.图1为实施例7经均质后凝胶颗粒经甲苯胺蓝染色后的形态图。
29.图2为实施例7和对比例8的茶多酚缓释曲线图。
30.图3为皮肤光老化模型小鼠皮肤组织t-aoc、sod、mda的含量。
具体实施方式
31.下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。
32.实施例1
33.将1g重组胶原蛋白和0.5g茶多酚溶于10g浓度为1.25mmol/l的氢氧化钠溶液中混
合均匀得ph值为12的预混液。再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为1h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为1cm3，经生理盐水清洗24h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
34.实施例2
35.将1g重组胶原蛋白和1g茶多酚溶于10g浓度为0.04mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为10的预混液。再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为1h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为1cm3，经生理盐水清洗24h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
36.实施例3
37.将1g重组胶原蛋白和1g茶多酚溶于10g浓度为1.25mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为12的预混液。再将0.3g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为1h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为1cm3，经生理盐水清洗24h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
38.实施例4
39.将1g重组胶原蛋白和1.5g茶多酚溶于10g浓度为1.25mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为12的预混液。再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为55℃，反应时间为1h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为1cm3，经生理盐水清洗24h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
40.实施例5
41.将1g重组胶原蛋白和0.5g茶多酚溶于10g浓度为1.25mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为12的预混液，再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为0.5h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为1cm3，经生理盐水清洗24h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
42.实施例6
43.将1g重组胶原蛋白和1g茶多酚溶于10g浓度为1.25mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为12的预混液，再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为1h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为1cm3，经生理盐水清洗12h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
44.实施例7
45.将2g重组胶原蛋白和1g茶多酚溶于10g浓度为1.25mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为12的预混液，再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为3h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为1cm3，经生理盐水清洗24h，均质，灌封，灭菌，得
到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
46.实施例8
47.将1g重组胶原蛋白和1g茶多酚溶于10g浓度为1.25mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为12的预混液，再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为60℃，反应时间为1h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为2cm3，经生理盐水清洗24h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
48.实施例9
49.将0.6g重组胶原蛋白和1g茶多酚溶于10g浓度为100mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为13的预混液，再将0.3g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为80℃，反应时间为0.5h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为3cm3，经生理盐水清洗36h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
50.实施例10
51.将3g重组胶原蛋白和1g茶多酚溶于10g浓度为0.01mmol/l的氢氧化钠溶液中混合均匀得ph值为9的预混液，再将0.2g 1,4-丁二醇二缩水甘油醚加入到预混液中，混合均匀后置于恒温水浴锅中，设定反应温度为50℃，反应时间为4h得到交联重组胶原蛋白凝胶。然后将交联重组胶原蛋白凝胶切块，体积约为0.5cm3，经生理盐水清洗4h，均质，灌封，灭菌，得到注射用交联重组胶原蛋白凝胶。
52.对比例1
53.按照实施例7的方法制备注射用交联重组胶原蛋白凝胶，不同之处在于，重组胶原蛋白的加入量为0.5g。
54.对比例2
55.按照实施例7的方法制备注射用交联重组胶原蛋白凝胶，不同之处在于，茶多酚的加入量为0.06g。
56.对比例3
57.按照实施例7的方法制备注射用交联重组胶原蛋白凝胶，不同之处在于，ph为8。
58.对比例4
59.按照实施例7的方法制备注射用交联重组胶原蛋白凝胶，不同之处在于，反应温度为40℃。
60.对比例5
61.按照实施例7的方法制备注射用交联重组胶原蛋白凝胶，不同之处在于，交联剂的加入量为0.005g。
62.对比例6
63.按照实施例7的方法制备注射用交联重组胶原蛋白凝胶，不同之处在于，切块的体积约为5cm3。
64.对比例7
65.按照实施例7的方法制备注射用交联重组胶原蛋白凝胶，不同之处在于，清洗时间为2小时。
66.对比例8
67.按照实施例7的方法制备注射用交联重组胶原蛋白凝胶，不同之处在于，茶多酚在重组胶原蛋白凝胶均质完后加入，茶多酚的加入量为1g。
68.性能测试1
69.将各实施例和对比例制备的注射用交联重组胶原蛋白凝胶用haake rs6000(赛默飞世尔(中国)公司)高级旋转流变仪测定凝胶的粘弹性，在测试温度25℃的条件下，狭缝宽度1.00mm，振动频率在0.1-100hz范围，对注射用交联重组胶原蛋白凝胶进行弹性和粘性的动态测定，观察指标为弹性模量(g’)和粘性模量(g”)。记录0.1hz频率下的弹性模量(g’)和粘性模量(g”)如表1所示。实施例相比于对比例1、5和3的弹性模量(g’)远大于粘性模量(g”)，说明实施例所制备的凝胶具有良好的粘弹性，说明反应体系中的重组胶原蛋白的含量、交联剂的含量及ph值，对凝胶的性能具有显著的影响。
70.表1各样品的流变学性能、bdde含量和灭菌前后的动力黏度
[0071][0072][0073]
性能测试2
[0074]
按照yy/t 0962-2014(整形手术用交联透明质酸钠凝胶)附录f交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油基醚(bdde)的残留量测定的酶标法对实施例和对比例的bdde残留量测定，结果如表1所示。实施例与对比例6和7的测试结果表明实施例的凝胶切块体积大小和清洗时间均会影响bdde的残留量，凝胶切块体积过大以及清洗时间过短，均会导致bdde的残留量过
高，不满足后续人体应用要求。
[0075]
性能测试3
[0076]
按照《中华人民共和国药典(四部)》(2020版)0633黏度测定法的旋转黏度计测定法，利用转子型黏度计通过将转子浸入待测样品中，并以恒定的角速度(ω)转动，测定马达转动产生的扭矩(m)，根据公式η＝k*m/η(k为常数)可得出待测样品的黏度，结果如表1所示。结果表明，灭菌前后样品的黏度无明显变化，表明湿热灭菌可保证样品的灭菌稳定性。
[0077]
性能测试4
[0078]
按照yy/t 0962-2014(整形手术用交联透明质酸钠凝胶)附录a交联透明质酸钠粒径分布实验方法对实施例7的注射用交联重组胶原蛋白凝胶进行测定，结果如图1所示。结果表明，样品形态不一，尺寸在一定范围内。
[0079]
性能测试5
[0080]
将实施例7和对比例8的样品分别放入20ml的ph7.4的pbs缓冲液的玻璃瓶中，置于37℃恒温摇床上，设定转速为60r/min，每隔一定的时间更换缓冲溶液，用紫外分光光度计测定吸光度值。记录实验数据，并根据实验数据计算缓冲溶液中的药物浓度，然后计算累积释放的百分率，具体结果如图2所示。通过实施例7和对比例8的缓释曲线，表明茶多酚通过席夫碱反应及可逆的共价键反应，可显著提高茶多酚的缓释时间。
[0081]
性能测试6
[0082]
采用化学比色法测定皮肤组织的总抗氧化能力(t-aoc)、超氧化物歧化酶(sod)和脂质过氧化物丙二醛(mda)含量，实施例7、对比例2和对比例8实验结果如图3所示。跟空白组相比，添加茶多酚可有效防治小鼠皮肤光老化；实施例7和对比例2的结果表明，茶多酚的加入量对防治小鼠皮肤光老化具有显著影响；实施例7和对比例8的结果表明，茶多酚的加入时机对防治小鼠皮肤光老化具有显著影响，实施例7的茶多酚与重组胶原蛋白凝胶通过席夫碱反应形成的注射用交联重组胶原蛋白凝胶相比于对比例8的茶多酚与重组胶原蛋白凝胶的物理结合形成的注射用交联重组胶原蛋白凝胶，对防治小鼠皮肤光老化具有更显著的作用。