一种甘草甜素在改善前列腺增生中的应用的制作方法

1.本技术涉及医药技术领域，具体涉及一种甘草甜素在改善前列腺增生中的应用。


背景技术：

2.良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,bph)是引起中老年男性排尿障碍原因中普遍存在的良性疾病，随着病程的发展会引起严重的下尿路症状。
3.前列腺增生的发病机制复杂，涉及众多因素，现有研究表明睾酮(tp)、雄激素受体(ar)、组织学炎症以及自噬等多种途径在前列腺增生中发生重要作用。通过调控上述途径可能对前列腺增生有改善作用。前列腺增生对于患病人群造成了极大的生活困扰。
4.因此，亟需提供一种安全、无毒、高效的物质来改善前列腺增生。


技术实现要素：

5.本技术提供一种甘草甜素在改善前列腺增生中的应用，能够通过甘草甜素下调前列腺细胞自噬水平以改善前列腺增生。
6.第一方面，本技术示出一种甘草甜素在改善前列腺增生中的应用，甘草甜素的结构式为：
[0007][0008]
在一些实施例中，甘草甜素通过下调前列腺细胞自噬水平以改善前列腺增生。
[0009]
在一些实施例中，甘草甜素通过抑制hmgb-1的表达以下调前列腺细胞自噬水平，进而改善前列腺增生。
[0010]
在一些实施例中，甘草甜素通过雄激素受体信号系统抑制hmgb-1的表达以下调前列腺细胞自噬水平，进而改善前列腺增生。
[0011]
在一些实施例中，甘草甜素通过下调前列腺细胞bph-1的自噬水平以改善前列腺增生。
[0012]
在一些实施例中，甘草甜素通过下调前列腺细胞bph-1的自噬水平以改善前列腺增生的应用浓度为800μm/l。
[0013]
第二方面，本技术还示出一种甘草甜素在改善前列腺增生的药物中的应用，该药物包括唯一活性成分的甘草甜素以及药学上可接受的辅料；药物用于抑制前列腺增生。
[0014]
以上示出的技术方案，能够通过甘草甜素下调前列腺细胞自噬水平以改善前列腺增生。
附图说明
[0015]
为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0016]
图1示出了根据一些实施例的大鼠前列腺组织的he染色结果；
[0017]
图2示出了根据一些实施例的大鼠前列腺组织的免疫组化结果；
[0018]
图3示出了根据一些实施例的大鼠前列腺组织透射电镜结果；
[0019]
图4示出了根据一些实施例的不同组大鼠前列腺组织western blot结果；
[0020]
图5示出了根据一些实施例的bph-1细胞mdc染色结果；
[0021]
图6示出了根据一些实施例的bph-1细胞免疫荧光结果；
[0022]
图7示出了根据一些实施例的cck-8细胞增殖实验结果；
[0023]
图8示出了根据一些实施例的细胞western blot结果。
具体实施方式
[0024]
为使本技术的目的、实施方式和优点更加清楚，下面将结合本技术示例性实施例中的附图，对本技术示例性实施方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的示例性实施例仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0025]
基于本技术描述的示例性实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本技术所附权利要求保护的范围。此外，虽然本技术中公开内容按照示范性一个或几个实例来介绍，但应理解，可以就这些公开内容的各个方面也可以单独构成一个完整实施方式。需要说明的是，本技术中对于术语的简要说明，仅是为了方便理解接下来描述的实施方式，而不是意图限定本技术的实施方式。除非另有说明，这些术语应当按照其普通和通常的含义理解。
[0026]
下面对本技术中涉及的专业术语进行解释。
[0027]
本技术中所使用的术语“自噬”，是广泛存在于真核生物细胞中的一种生命现象，被认为是细胞的程序性存活过程，是细胞内维持能量稳态和应对细胞毒性物质作用的重要生物过程。
[0028]
本技术中所使用的术语“高迁移率族蛋白b-1(hmgb-1)”是细胞核内的一种非组蛋白dna结合蛋白，在炎症、肿瘤和组织修复中具有独特作用。hmgb-1可激活类固醇激素受体，提示hmgb-1在性激素依赖器官中可能发挥重要作用。hmgb-1还是重要的自噬调控因子，hmgb-1可通过介导细胞自噬，减弱细胞凋亡，发挥促细胞增长作用。
[0029]
本技术中所使用的术语“甘草甜素”是甘草的主要提取物之一。甘草是一种传统的中药，味甘、平；是补脾益缓急、止痛，解毒的良药。甘草甜素具有抑菌、消炎、解毒等多种功能。
[0030]
由于现有研究表明睾酮、雄激素受体、组织学炎症以及自噬等多种途径在前列腺增生中发生重要作用。现有研究表明前列腺增生患者的前列腺间质成纤维细胞自噬水平升高，给予雄激素干预后致雄激素受体表达下调，其自噬水平降低，提示靶向抑制自噬可能是改善前列腺增生的有效方法。
[0031]
为此，本技术示出的技术方案，提供了一种甘草甜素，用于改善前列腺增生，本申
请示出了一种甘草甜素在改善前列腺增生中的应用，所述甘草甜素的结构式为：
[0032][0033]
在一些实施例中，甘草甜素通过下调前列腺细胞自噬水平以改善前列腺增生。
[0034]
在一些实施例中，甘草甜素通过抑制hmgb-1的表达以下调前列腺细胞自噬水平，进而改善前列腺增生。
[0035]
在一些实施例中，甘草甜素通过雄激素受体信号系统抑制hmgb-1的表达以下调前列腺细胞自噬水平，进而改善前列腺增生。
[0036]
在一些实施例中，甘草甜素通过下调前列腺细胞bph-1的自噬水平以改善前列腺增生。
[0037]
在一些实施例中，甘草甜素通过下调前列腺细胞bph-1的自噬水平以改善前列腺增生的应用浓度为800μm/l。
[0038]
本技术还示出一种甘草甜素在改善前列腺增生的药物中的应用，该药物包括唯一活性成分的甘草甜素以及药学上可接受的辅料；药物用于抑制前列腺增生。
[0039]
具体实现中，本技术示出了相关实验以证实上述实施例。
[0040]
首先，本技术通过建立大鼠前列腺增生模型，并将甘草甜素对大鼠前列腺增生模型进行干预。
[0041]
具体实验过程如下：
[0042]
本技术的实验动物为：体重在250g-280g范围内的成年雄性sd大鼠，spf级，共48只，动物许可证号scxk(宁)2011-001。其中，sd大鼠为大鼠的一个品系，spf级表示无特定病原体，使用spf动物可以确保不会有特定的疾病对实验结果造成干扰。
[0043]
本技术的实验材料包括：甘草甜素(日本)、丙酸睾丸素(索莱宝)、沃漫霉素(mce)、脱脂奶粉、bph-1细胞，mdc染色试剂盒、吖啶橙染色试剂盒、全蛋白提取试剂盒、锐博小干扰rna试剂盒、takara反转录试剂盒、takara tb green rt-qpcr检测试剂盒、总rna提取试剂盒。
[0044]
本技术的实验试剂包括：rpmi培养基(bi)、胎牛血清、青链霉素混合液(solarbio公司)、0.25％胰蛋白酶消化液(含edta)，ar、hmgb-1、beclin-1、p62、lc-3b、磷酸盐缓冲液、荧光二抗、甲醇。
[0045]
本技术的实验过程包括：动物实验以及细胞实验。
[0046]
其中，动物实验包括以下步骤：
[0047]
步骤s101，建立大鼠前列腺增生模型。
[0048]
实验用大鼠均在宁夏医科大学实验动物中心饲养，在宁夏医科大学基础医学研究所动物周转单元适应性饲养一周后进行造模，48只雄性sd大鼠随机分4组(n＝12)：ctrl组、tp组、gly组、tp gly组。ctrl组：大鼠开腹后进行前列腺多点注射生理盐水，背部皮下注射
橄榄油；tp组：大鼠背部皮下注射tp[3mg*(kg-1
*d-1
)]；gly组：腹腔注射gly[10mg*(kg-1
*d-1
)]；tp gly组：大鼠背部皮下注射tp[3mg*(kg-1
*d-1
)]，腹腔注射gly[10mg*(kg-1
*d-1
)]。实验大鼠的饲养以及本研究的造模实验操作均严格遵守宁夏医科大学实验动物的使用和管理原则。
[0049]
需要说明的是，ctrl组为对照组，tp组为睾酮实验组，gly为甘草甜素实验组，tp gly组为睾酮及甘草甜素实验组。
[0050]
步骤s102，获取大鼠前列腺增生模型的标本并计算所述标本的前列腺指数。
[0051]
各组大鼠处理21天后，在麻醉状态下迅速摘取前列腺组织；随机取4只，均分两半后用于电镜、he染色和免疫组化染色；8只测量前列腺体积、湿重用于计算前列腺指数[大鼠前列腺湿重(g)/大鼠体重(g)*100％]后，组织冻存于-80℃冰箱用于western blot蛋白检测。
[0052]
步骤s103，将从所述标本获取的大鼠前列腺组织进行形态学检测。
[0053]
步骤s103-1，将从所述标本获取的大鼠前列腺组织进行he染色。
[0054]
21天造模结束后取大鼠前列腺组织，冷生理盐水中冲洗后浸泡至4％的多聚甲醛中固定过夜，完成固定后，梯度脱水、石蜡包埋，切片，将切片置于37℃烘箱中烤片过夜；he染色前将切片放入65℃烤箱中至少30min进行融蜡，融蜡完成后在染缸中进行脱蜡步骤，后将载玻片放入苏木精染色液中染色6min，ddh2o洗3次，每次5min；洗完后放入0.5％盐酸酒精溶液中分化30s，置于干净的染缸中流水冲洗1min；加0.5％的伊红染色溶液染色50s，染色完成后用pbs冲洗1min；在乙醇中进行梯度脱水，脱水完成后在通风柜中用中性树胶进行封片，显微镜下观察染色结果。染色结束后，对各组大鼠前列腺组织的病理状况进行双盲阅片，观察前列腺组织增生情况。
[0055]
步骤s103-2，将从所述标本获取的大鼠前列腺组织进行ihc染色。
[0056]
ihc染色前将切片置于37℃烘箱中30min进行融蜡，然后进行脱蜡处理，洗片后枸橼酸钠高压抗原修复5min，37℃烘箱中孵育一抗1.5h，洗片后用二步法孵育二抗然后通风柜中用中性树胶封片，观察。
[0057]
步骤s103-3，通过透射电镜观察大鼠前列腺组织自噬小体形成情况。
[0058]
迅速摘取前列腺于遇冷的生理盐水中冲洗干净，置于4％多聚甲醛-2.5％戊二醛中预固定，在蜡板上用双面刀片修块，修块完成后4度冰箱固定2小时；磷酸盐缓冲液冲洗5次每次20min,并浸泡过夜；1％四氧化锇4度固定2小时；丙酮4度梯度脱水；用epon812:丙酮(3：1)浸泡45min，纯epon812包埋浸泡2小时；将处理好的样品根据自己的需要放置于包埋模具中加入新鲜的包埋液；45度聚合10小时，60度下聚合12小时，超薄切片后透射电镜观察。
[0059]
步骤s104，将从所述标本获取的大鼠进行蛋白质表达量检测。
[0060]
制胶；分别制作分离胶及浓缩胶，待浓缩胶固定成型，安装好胶板后，置于垂直电泳槽中，倒入1x电泳液，每孔上样10-20μl，蛋白跑到分离胶边缘，停止电泳；转膜：电泳结束后按照目的蛋白的分子量切胶，放到湿转槽中，260ma转膜1小时；封闭：湿转结束后用5％的脱脂牛奶室温封闭2小时或4度冰箱封闭过夜；孵育一抗：加入目的一抗，室温摇床孵育1.5-2小时，或4度冰箱孵育过夜；孵育二抗：回收目的一抗后pbst洗膜3遍，每次8min，洗膜完成后，加入相应的二抗孵育2小时，pbst洗膜3次，每次8分钟；ecl化学发光法进行显色：将pvdf
膜置于曝光机板上铺好，每张膜大概铺200μl发光液，铺均匀后进行曝光并保存结果；用image软件对wb条带灰度值进行分析。
[0061]
其中，细胞实验包括以下步骤：
[0062]
步骤s201，将前列腺增生细胞进行细胞培养。
[0063]
人前列腺增生细胞(人bph-1细胞株)采用含10％的胎牛血清，1％的青链霉素混合液的rpmi培养基培养，观察贴壁细胞，将处于对数生长期的细胞0.25％的含edta的胰蛋白酶消化处理后，分别取2ml置于6孔板和24孔板中，按照分组分别加入tp(10nm/l)、gly(800μm/l)、tp gly、每组各设置2个复孔，分别用于自噬小体染色wb和免疫应荧光取1ml铺96孔板每组设置7个复孔，用于检测细胞活力。
[0064]
步骤s202，对细胞培养后的前列腺增生细胞采用mdc法进行细胞自噬检测。
[0065]
细胞培养24h直接去除培养基，1x washing buffer(10x washing buffer去离子水稀释至1x)500μl清洗细胞2次；根据样本数稀释mdc染液至1x(1x washing buffer：mdc＝9:1),mdc避光染色1小时；染色完成后1x washing buffer洗2次后荧光倒置显微镜激发光波长512nm，阅片。
[0066]
步骤s203，对细胞培养后的前列腺增生细胞进行细胞免疫荧光检测。
[0067]
细胞培养24h直接去除培养基，pbs清洗细胞2次；取出24孔板后吸出培养基每孔加预冷的pbs轻柔冲洗3次防止大量掉片，每次5min；4％多聚甲醛或甲醇(根据抗体说明书)固定细胞15min，pbs冲洗3次，每次5min；0.5％triton-x100穿孔15-20min，pbs冲洗3次，每次5min；10％山羊血清37度封闭30min；加入1％bsa稀释的一抗(根据抗体说明书确定浓度)，37度杂交2小时或放入湿盒中4度过夜，回收抗体后，pbs洗三次，每次5min；加入1％bsa稀释的荧光二抗，避光37度杂交1-1.5小时，pbs避光洗三次，每次5分钟；含dapi的抗荧光淬灭的封片剂避光封片，采图。
[0068]
步骤s204，对细胞培养后的前列腺增生细胞进行蛋白质表达量检测。
[0069]
细胞计数铺板后待细胞贴壁，加药刺激，收集细胞于1.5mlep管中，加入配好的裂解液，提取细胞蛋白，定量后用于wb检测各组细胞蛋白表达情况，wb步骤同动物。
[0070]
在一些实施例中，对动物实验以及细胞实验获取的数据进行数据统计的方式为：用spss 23.0软件，计量资料以均数
±
标准差表示，多组间比较采用anov分析。以p《0.05为差异有统计学意义。
[0071]
上述实施例中，具体的实验结果如下述所示。
[0072]
其中，动物实验的实验结果包括：
[0073]
表1示出了大鼠前列腺体积、湿重及指数的比较。
[0074]
表1
[0075][0076][0077]
注：与ctrl组相比*p《0.05，**p《0.01；与tp组相比#p《0.05，##p《0.01。
[0078]
图1示例性示出了本技术实施例中的大鼠前列腺组织he染色结果。如图1所示，大鼠前列腺组织he染色结果显示，ctrl组大鼠前列腺腺腔形状规则，腺上皮细胞呈单层柱状排列整齐细胞核位于基底部；tp组大鼠腺上皮细胞增生明显并内褶凸向腺腔内；gly组与ctrl组一致，腺上皮细胞呈单层柱状，细胞核位于基底部；tp gly组腺体增生明显缓解，腺上皮增生减轻，腺体内褶减轻。
[0079]
图2示例性示出了本技术实施例中的大鼠前列腺组织免疫组化结果。如图2所示，大鼠免疫组化结果显示，在ctrl组ar、hmgb-1、beclin-1、p62、lc-3b均有轻微表达，ar、hmgb-1为核表达，beclin-1、p62、lc-3b为胞浆表达；tp组大鼠前列腺组织中ar、hmgb-1、beclin-1、lc-3b表达均增强，p62蛋白表达减弱；gly组与ctrl组基本一致，tp gly组与tp组相比ar、hmgb-1、becl in-1、lc-3b蛋白表达减弱。
[0080]
图3示例性示出了本技术实施例中的大鼠前列腺组织透射电镜结果。如图3所示，大鼠前列腺组织透射电镜结果显示，ctrl组大鼠前列腺腺上皮细胞内自噬小体数极少；tp组大鼠前列腺腺上皮细胞内自噬小体数量明显增多，gly组与ctrl组相比无明显差异；tp gly组与tp组相比自噬小体数明显减少。
[0081]
图4示例性示出了本技术实施例中大鼠前列腺组织western blot结果。如图4所示，western blot结果显示，与ctrl组相比，tp组大鼠前列腺组织ar、hmgb-1、becl in-1、lc-3bⅱ/ⅰ蛋白表达水平明显升高(p《0.05)，p62蛋白表达水平降低(p《0.05)；给予gly干预后，ar、hmgb-1、beclin-1、lc-3bⅱ/ⅰ蛋白表达水平与ctrl组无明显差别；与tp组比较，tp gly组前列腺组织ar、hmgb-1、lc3bⅱ/ⅰ、beclin-1表达明显降低(p《0.05)，p62蛋白表达增加(p《0.05)。
[0082]
其中，细胞实验的实验结果包括：
[0083]
图5示例性示出了本技术实施例中bph-1细胞mdc染色结果。如图5所示，bph-1细胞自噬mdc染色显示，tp刺激24h后较ctrl组bph-1细胞自噬水平明显增加，gly组自噬水平与ctrl组类似，tp gly组较tp组自噬水平明显降低。
[0084]
图6示例性示出了本技术实施例中细胞免疫荧光结果。如图6所示，细胞免疫荧光结果显示gly可降低bph-1细胞自噬水平。细胞免疫荧光结果显示tp组hmgb-1、beclin-1、lc-3b蛋白荧光强度增强lc-3b点状聚集增多，联合使用gly干预后各指标荧光强度减弱，lc-3b点状聚集明显减少。
[0085]
图7示例性示出了本技术实施例中cck-8细胞增殖实验结果。如图7所示，cck-8结果显示gly可抑制bph-1细胞增殖能力。bph-1细胞tp刺激24h后tp组细胞增殖活力增强(p《0.01)，给予gly干预后与tp组相比细胞增殖活力降低(p《0.05)。
[0086]
图8示例性示出了本技术实施例中细胞western blot结果。如图8所示，bph-1细胞western blot结果显示：gly干预后，ar、hmgb-1及自噬相关蛋白表达减少。bph-1细胞tp刺激24h后tp组ar、hmgb-1、becl in-1、lc-3b蛋白表达增加(p《0.05)，p62蛋白减少(p《0.05)，给予gly干预后与tp组相比ar、hmgb-1、beclin-1、lc-3b蛋白表达减少(p《0.05)，p62蛋白增加(p《0.05)。
[0087]
综之，本研究试验结果表明雄激素可能通过激活ar信号系统促进hmgb-1蛋白的表达进而介导细胞自噬促进前列腺细胞增殖的发生；加入gly后抑制hmgb-1的表达，前列腺细胞自噬水平下调，前列腺增生明显缓解。揭示了gly调节自噬信号通路的关联性和作为潜在
治疗前列腺增生药物的可能性。本发明中，gly对自噬的抑制作用揭示了gly作为自噬抑制剂的潜在可能性，同时也表明gly在辅助治疗前列腺增生方面具有重要的应用价值。
[0088]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围
[0089]
为了方便解释，已经结合具体的实施方式进行了上述说明。但是，上述示例性的讨论不是意图穷尽或者将实施方式限定到上述公开的具体形式。根据上述的教导，可以得到多种修改和变形。上述实施方式的选择和描述是为了更好的解释原理以及实际的应用，从而使得本领域技术人员更好的使用所述实施方式以及适于具体使用考虑的各种不同的变形的实施方式。