常山乙素用于提高NK细胞杀伤力的用途的制作方法

常山乙素用于提高nk细胞杀伤力的用途
技术领域
1.本发明属于细胞治疗领域，涉及高杀伤力nk细胞的培养，具体涉及常山乙素用于提高nk细胞杀伤力的用途。


背景技术：

2.nk细胞是固有免疫的重要组成部分，nk细胞的抗肿瘤作用不仅体现在对肿瘤细胞的杀伤，且与肿瘤微环境中的dcs等免疫细胞存在关联，可强化适应性免疫应答。此外，nk细胞可靶向杀伤肿瘤干细胞，在抗肿瘤转移中发挥重要作用。nk细胞可直接杀伤肿瘤细胞。nk细胞通过表面抑制性受体与激活受体的协同作用，活化并识别靶细胞后，与靶细胞之间会建立突触，用于传递颗粒酶与穿孔素，穿孔素可插入靶细胞的质膜并形成导致渗透溶解的孔洞，颗粒酶可通过穿孔素形成的孔转移并激活胱天蛋白酶，导致靶细胞凋亡(nk细胞的抗肿瘤机制及其在肿瘤靶向治疗中的应用研究进展，药学学报，2021)。
3.有研究表明，常山乙素体外对小鼠淋巴细胞增殖的免疫调节作用(常山提取物和常山乙素对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，中国兽医学报，2013)。但是，并没有研究公开常山乙素对nk细胞等其他免疫细胞的影响。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供常山乙素用于提高nk细胞杀伤力的用途。
5.本发明目的通过如下技术方案实现：
6.常山乙素用于提高nk细胞杀伤力的用途。
7.常山乙素用于nk细胞体外培养提高其杀伤力的用途。
8.常山乙素用于nk细胞体外培养提高其增殖活性和杀伤力的用途。
9.一种提高nk细胞增殖活性和杀伤力的培养基，该培养基中含有常山乙素。
10.技术效果：
11.本发明基于细胞增殖实验、westernblot实验、elisa实验和靶细胞杀伤实验，发现常山乙素在体外可以促进nk细胞增殖并提高其杀伤力，这说明常山乙素具有提高nk细胞增殖活性和杀伤力的作用，可以用于开发提高nk细胞增殖活性和杀伤力的培养基。
附图说明
12.图1为不同处理的nk细胞中颗粒酶b和穿孔素表达水平(a)、ifn-γ分泌水平(b)。
具体实施方式
13.下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
14.一、实验材料
15.nk细胞培养基购自德国cellgro scgm，胎牛血清、rpmi 1640培养液购自gibco。
k562购自atcc。elisa试剂盒购自上海仁捷生物科技有限公司。常山乙素购自成都瑞芬思生物科技有限公司，纯度98％。rhil-2、庆大霉素购自苏州瑞诺德生物科技有限公司。
16.二、实验方法
17.1、nk细胞培养
18.采集健康志愿者外周血，ficoll密度梯度离心，分离获得外周血单个核细胞，用含有5％自体血浆、500u/ml的rhil-2、80u/ml庆大霉素的nk细胞培养基将外周血单个核细胞调至起始细胞数为1.0
×
106/l，置于37℃，5％co2培养箱培养，每2天半量换液1次，将细胞数控制为1.0
×
106/l。收集培养0、11天的细胞，流式细胞仪检测cd3
－
cd56

细胞比例。
19.2、细胞增殖实验
20.取生长状态良好的nk细胞，调整细胞浓度至5
×
104个/ml，接种于96孔板中，每孔100μl，每组设5个复孔。24h后，药物组加入100μl含有不同浓度常山乙素(2.5μm、10μm)的nk细胞培养基继续培养，对照组加入100μl不含有常山乙素的nk细胞培养基。继续培养48h后，每孔加入20μl浓度为5mg/ml的mtt溶液，培养4h，去上清液，加入150μl dmso轻轻震荡，用酶标仪检测其在490nm处的吸光度(od值)，通过od值按照如下公式计算实验组增殖活性，od值越高代表细胞增殖活性越强。对照组细胞增殖活性计为100％。药物组细胞增殖活性＝药物组od值/对照组od值
×
100％。
21.3、western blot实验
22.取生长状态良好的nk细胞，调整细胞浓度至5
×
104个/ml，接种于24孔板中，每孔500μl，每组设5个复孔。24h后，药物组加入500μl含有不同浓度常山乙素(2.5μm、10μm)的nk细胞培养基继续培养，对照组加入500μl不含有常山乙素的nk细胞培养基。继续培养48h后，收集细胞，pbs洗涤，提取总蛋白按western blot法测定各组细胞中颗粒酶b和穿孔素表达水平。western blot法的内参蛋白为gapdh。
23.4、elisa实验
24.取生长状态良好的nk细胞，调整细胞浓度至5
×
104个/ml，接种于24孔板中，每孔500μl，每组设5个复孔。24h后，药物组加入500μl含有不同浓度常山乙素(2.5μm、10μm)的nk细胞培养基继续培养，对照组加入500μl不含有常山乙素的nk细胞培养基。继续培养48h后，收集培养上清液，用elisa试剂盒根据说明书测定上清液中ifn-γ浓度。
25.5、靶细胞杀伤实验
26.取生长状态良好的nk细胞，调整细胞浓度至5
×
104个/ml，接种于6孔板中，每孔1ml，每组设2个复孔。24h后，药物组加入1ml含有不同浓度常山乙素(2.5μm、10μm)的nk细胞培养基继续培养，对照组加入1ml不含有常山乙素的nk细胞培养基。继续培养48h后，收集细胞，pbs洗涤，作为效应细胞。以对数生长期的k562肿瘤细胞作为靶细胞。
27.取靶细胞，用含10％胎牛血清的rpmi 1640培养液调整细胞密度为2.5
×
104/ml，接种于96孔板中，每孔加100μl；取效应细胞，用含10％胎牛血清的rpmi 1640培养液调整细胞密度为2.5
×
105/ml，接种于96孔板中，每孔加100μl(即效靶比为10:1)，同时设单效应细胞孔、单靶细胞孔和空白孔。培养24h，每孔加入10μl cck8试剂，孵育4h，用酶标仪检测其在450nm处的吸光度(od值)，以空白孔校零，按公式计算杀伤力。
28.杀伤力(％)＝[1-(实验孔od值－单效应细胞孔od值)/单靶细胞孔od值]
×
100％。
[0029]
6、统计学分析
[0030]
采用graphpad prism 5软件对数据进行统计分析，采用配对t检验对数据进行显著性分析，p《0.05认定为差异显著。
[0031]
三、实验结果
[0032]
1、nk细胞培养
[0033]
培养0、11天的细胞中cd3-cd56

表型比例分别为(6.08
±
2.35)％、(83.72
±
4.91)％。cd3-cd56

表型的细胞即为nk细胞。这表明已通过对外周血单个核细胞培养得到nk细胞。
[0034]
2、细胞增殖活性
[0035]
各组nk细胞增殖活性如表1所示，药物组nk细胞增殖活性显著高于对照组nk细胞。也就是说，不同浓度常山乙素干预nk细胞后均促进nk细胞增殖，且在测试浓度范围内，作用浓度越高对nk细胞的促增殖活性越强。
[0036]
表1 nk细胞增殖活性
[0037][0038]
3、颗粒酶b和穿孔素表达水平
[0039]
各组nk细胞中颗粒酶b和穿孔素的表达水平如图1中a所示，药物组nk细胞中颗粒酶b和穿孔素的表达水平显著高于对照组nk细胞。颗粒酶b和穿孔素是nk细胞发挥杀伤活性的重要活性因子。也就是说，不同浓度常山乙素干预nk细胞后均促进nk细胞中颗粒酶b和穿孔素的表达，且在测试浓度范围内，作用浓度越高对nk细胞中颗粒酶b和穿孔素的表达促进作用越强。
[0040]
4、ifn-γ分泌水平
[0041]
各组nk细胞培养上清液中ifn-γ的浓度如表2和图1中b所示，药物组nk细胞培养上清液中ifn-γ的浓度显著高于对照组。ifn-γ也是nk细胞发挥杀伤活性的重要活性因子。也就是说，不同浓度常山乙素干预nk细胞后均促进nk细胞分泌ifn-γ，且在测试浓度范围内，作用浓度越高对nk细胞分泌ifn-γ的促进作用越强。
[0042]
表2 nk细胞增殖活性
[0043][0044]
5、对肿瘤靶细胞的杀伤力
[0045]
不同效应细胞对靶细胞的杀伤力如表3所示，不同浓度常山乙素干预培养的nk细胞对肿瘤靶细胞明显具有更强的杀伤力，且在测试浓度范围内具有剂量效应。
[0046]
表3对肿瘤靶细胞的杀伤力(效靶比10:1)
[0047][0048]
上述实施例基于细胞增殖实验、western blot实验、elisa实验和靶细胞杀伤实验，发现常山乙素在体外可以促进nk细胞增殖并提高其杀伤力，这说明常山乙素具有提高nk细胞增殖活性和杀伤力的作用，可以用于开发提高nk细胞增殖活性和杀伤力的培养基。