利用血流变化位点靶向纳米囊泡的动脉硬化的诊断及治疗方法与流程

1.本发明涉及利用血流变化位点靶向纳米囊泡的动脉硬化的诊断及治疗方法。


背景技术：

2.动脉硬化(atherosclerosis)为死亡的主要原因，但目前的诊断方法还不能检测与不可逆级联反应相关的其早期病因信号。尽管仍然存在疾病进展的实质性风险，但仍普遍使用以低胆固醇水平、血压或斑块形成为目的的现有的预防及治疗选择。作为在分叉处、弯曲的区域或外周发生狭窄的早期动脉硬化事件的血流紊乱(disturbed blood flow)的发生导致血管内皮细胞(endothelial cell，ec)的功能障碍。在正常血流中，内皮细胞沿着血流方向排列，保持抗炎及抗血栓功能。相反，动脉粥样硬化、血流紊乱激在增加炎症及血栓事件的同时激活内皮细胞功能障碍，最终诱发动脉硬化。需要彻底证明可作为针对该致命慢性疾病的有希望的解决方案而提出的靶向血流紊乱的诊断治疗(theragnostic)。
3.据报告，间充质干细胞(mesenchymal stem cell，msc)调节免疫反应且弱化血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，vsmc)的增殖，从而保持用于抗-动脉硬化治疗的治疗前景。但是，为了临床应用，依然需要克服它们的低存活率及不足的靶向效率。间充质干细胞衍生的纳米囊泡已成为如下的治疗纳米载体，即，不仅具有细胞衍生抗炎及促再生特性，还具有可促进细胞相互作用的得以提高的体内循环时间。尽管尝试研发针对包括心血管疾病、肾损伤、肝脏疾病及神经系统疾病的多种致命疾病及损伤的基于纳米囊泡的治疗法，但在长期且困难的生产工序中，以高收率保持大小均匀性及有效成分的一致性仍然是一个挑战。近来，在作为代替方案的工程方法中，通过微孔过滤物理破坏细胞，并诱导生成的细胞膜碎片及内部内容物的自组装，从而能够以100倍以上的高收率生产来源于细胞的纳米囊泡。
4.不可逆级联反应成为动脉硬化的重要发病原因，并示出针对早期诊断及预防的未满足的必要性。血流紊乱形成为最快的动脉硬化事件之一，这增加了内皮渗透性及随后的单核细胞募集。


技术实现要素：

5.[技术问题]
[0006]
本发明的目的在于，提供在表面展示能够靶向诱发动脉硬化的血流紊乱位点的肽的源自干细胞的纳米囊泡及其制备方法。
[0007]
本发明的再一目的在于，提供上述纳米囊泡的动脉硬化的预防、诊断及治疗用途。
[0008]
但是，本发明所要实现的技术目的并不局限于以上所提及的目的，(该行业)从业者可通过下述记载明确理解未提及的其他目的。
[0009]
[技术方案]
[0010]
为了实现上述目的，本发明提供一种纳米囊泡，源自干细胞，在表面展示血流紊乱
位点靶向肽。
[0011]
并且，本发明提供一种上述纳米囊泡的制备方法，包括从由依次插入有信号肽-血流紊乱位点靶向肽-跨膜蛋白的编码序列的载体转染的干细胞中获得在表面展示血流紊乱位点靶向肽的纳米囊泡的步骤。
[0012]
并且，本发明提供包含上述纳米囊泡的用于诊断动脉硬化的组合物。
[0013]
并且，本发明提供包含上述纳米囊泡的用于预防或治疗动脉硬化的组合物。
[0014]
并且，本发明提供包括向个体给药治疗有效量的上述纳米囊泡的步骤的动脉硬化的治疗方法。
[0015]
[发明的效果]
[0016]
本发明提供作为利用能够靶向血流紊乱位点的肽的抗-动脉硬化诊断治疗平台的源自干细胞的纳米囊泡，上述纳米囊泡提供与间充质干细胞相似的强力的抗炎及促内皮修复效果，从而可用作能够预防动脉硬化的发病的新型诊断治疗剂。
附图说明
[0017]
图1a示出源自prey/间充质干细胞的纳米囊泡(pmsc-nv)的作用机制及prey肽展示简图，具体地，血流紊乱位点靶向肽(prey)选自噬菌体展示筛选，通过特别设计的质粒的转染及表达展示在间充质干细胞膜(pmsc)的外部。
[0018]
图1b示出源自pmsc的纳米囊泡(pmsc-nv)通过使用以一系列微孔尺寸控制的膜的连续挤压工序生产，pmsc-nv包含与pmsc相同的跨膜及细胞内成分。
[0019]
图1c示出部分颈动脉结扎(partial carotid ligation，pcl)模型用于体内试验，向静脉内注射pmsc-nv并使其在全身循环，从而靶向血流紊乱位点并测试它们的诊断治疗性能。
[0020]
图2a为关于用于在间充质干细胞膜的外层表达prey的质粒设计的简图。通过设计绿色荧光蛋白(gfp，green fluorescence protein；内膜信号)-跨膜蛋白-v5标签(外模信号)-prey来验证prey的表达及位置。
[0021]
图2b为三种跨膜蛋白(cd86、cd105及cd271)和两种人间充质干细胞(hmsc)类型(脂肪源性干细胞(asc)及骨髓源性干细胞(bmsc))成对且通过流式细胞荧光分选技术(facs)(x-轴：绿色荧光蛋白 细胞/y-轴：v5标签(v5 tag) 细胞)定量比较转染效率的结果。此时，cd271-脂肪源性干细胞对具有最高的转染效率，因此被预选。
[0022]
图2c为转染30分钟后，利用alexa fluor 488-偶联的膜联蛋白v(annexin v)评价prey-cd271质粒容量-依赖性细胞凋亡(0x：没有质粒的电穿孔，1x、2x：100ng、200ng质粒(plasmid)/105细胞(cells))的结果。
[0023]
图2d为绿色荧光蛋白(绿色内膜信号)及prey-v5标签(红色外模信号)的位置利用脂肪源性干细胞转染prey-cd271-v5标签质粒后在pmsc中可视化的结果，示出红色及绿色信号主要分别在细胞膜的外部及内部中观察到。
[0024]
图2e为利用透射电子显微镜(tem)测定pmsc-nv的大小及形态分布的结果，黄色虚线示出pmsc-nv的膜。
[0025]
图2f为通过蛋白质印迹法分析转染的表达及细胞膜蛋白cd9的结果。
[0026]
图2g为利用mirna阵列分析内部mirna成分是否保存的结果。
[0027]
图3示出用于表达prey融合蛋白的载体设计的示意图，为了克隆prey融合蛋白的序列基因，与氨苄青霉素抗性基因一同插入在共同cmv启动子骨架。
[0028]
图4a为为了调查根据人间充质干细胞类型的转染效率而转染prey-cd271质粒并24小时后分别在骨髓源性干细胞及脂肪源性干细胞中示出1х质粒的转染效率的荧光图像(蓝色：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)染色的核)。
[0029]
图4b为在骨髓源性干细胞及脂肪源性干细胞中测定根据prey-cd271质粒的转染容量(0x、0.5x、1x、2x)的存活细胞数的结果，脂肪源性干细胞的存活细胞数更多，因此将其选择为人间充质干细胞类型(*p＜0.05骨髓源性干细胞比脂肪源性干细胞，#p＜0.05比0x骨髓源性干细胞，$p＜0.05比0x脂肪源性干细胞)。
[0030]
图4c为在脂肪源性干细胞中通过流式细胞荧光分选技术分析根据prey-cd271质粒的容量(0.5x、1x、2x)的转染效率的结果。
[0031]
图5为示出prey-cd271的表达的共聚焦成像结果，可在相邻的脂肪源性干细胞的细胞膜中通过绿色荧光蛋白及prey-v5标签的表达确认prey-cd271的表达(蓝色：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色的核)。
[0032]
图6为对于转染后从脂肪源性干细胞(pmsc-nv)挤压纳米囊泡前后的样品，通过蛋白质印迹法分析转染的表达及细胞膜蛋白cd9水平的结果(msc-nv：从未转染的脂肪源性干细胞挤压纳米囊泡，*p＜0.05)。
[0033]
图7a为示出通过处理骨髓源性干细胞(骨髓源性干细胞纳米囊泡)或脂肪源性干细胞(脂肪源性干细胞纳米囊泡)衍生msc-nv(无prey转染)而活化的单核细胞的抗炎效果的图，单核细胞通过摄取msc-nv来示出抗炎及噬菌抑制效果。
[0034]
图7b为通过使用dio(绿色)及dii(红色)来将raw264.7细胞及msc-nv分别可视化的成像结果，为示出两种msc-nv类型均被有效地内化在巨噬细胞的结果(蓝色：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色的核)。
[0035]
图7c为测定通过qrt-pcr在小鼠raw 264.7细胞中处理脂多糖(lps)时的抗炎(il-10及il-13)及促炎标志物(il-1β及tnf-α)mrna的表达的结果。
[0036]
图7d为使用条件培养基的斑点印迹分析结果，示出各类型的抗炎细胞因子的右侧下方黑点的量在纳米囊泡处理组中减少。示出左侧上方黑点(由实线圆形表示)在测试培养基中的抗炎细胞因子的量在所有组中相似。
[0037]
图7e为通过测定内化的大肠杆菌颗粒(绿色)的量来分析噬菌活性的结果，示出在所有msc-nv类型之间没有显著差异，下侧图为进行ox-低密度脂蛋白(ldl)的油红o染色(oil red o staining)的结果，示出除骨髓源性干细胞纳米囊泡组之外的所有纳米囊泡处理组中的ox-低密度脂蛋白(ldl)摄取(uptake)减少，下侧图表为定量结果。
[0038]
图8a为示出通过处理骨髓源性干细胞(骨髓源性干细胞纳米囊泡)或脂肪源性干细胞(脂肪源性干细胞纳米囊泡)衍生msc-nv(无prey转染)而引起的内皮细胞的血管保护效果的图，msc-nv提供内皮细胞保护，示出随着抑制单核细胞募集，通过吸收msc-nv来使内皮细胞功能障碍恢复。
[0039]
图8b为分别使用dio(绿色)及dii(红色)来将永生化小鼠内皮细胞(immortalized mouse ec，imaec)及msc-nv可视化的成像结果，为示出两种msc-nv类型均有效地内化在永生化小鼠内皮细胞的结果(蓝色：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色的核)。
[0040]
图8c通过qrt-pcr测定内皮细胞功能障碍标志物(e-选择素、细胞粘附分子-1(icam-1)及血管细胞黏附分子-1(vcam-1))基因的表达水平的结果，示出通过处理所有msc-nv来使各个基因的表达减少。
[0041]
图8d为在永生化小鼠内皮细胞中通过免疫染色分析血管细胞黏附分子-1(绿色)的蛋白表达的图像及其定量分析结果(蓝色：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色的核)。
[0042]
图8e为示出对于通过处理环孢菌素a(cya)而诱导的内皮细胞血管形成的破裂，处理骨髓源性干细胞纳米囊泡或脂肪源性干细胞纳米囊泡的血管保护效果的结果，示出在两种msc-nv类型之间没有显著差异(*p＜0.05比脂多糖/生理盐水处理组)。
[0043]
图9为在对于通过处理环孢菌素a的内皮细胞血管形成妨碍的反应中，分析msc-nv的促血管生成作用的结果，为示出利用钙黄绿素am染色人脐静脉内皮细胞(huvec)的图像及血管结构因子的定量分析结果(生理盐水处理组比*p＜0.05)。
[0044]
图10为在对于血管细胞黏附分子1表达、血管破裂及抗-血管形成的反应中示出pmsc-nv的促内皮细胞恢复效果的结果。
[0045]
图11为示出小鼠部分颈动脉结扎模型中的结扎前(左侧)及结扎后(右侧)的照片，示出4个左颈动脉(lca)分支中的3个(eca：外部颈动脉，ica：内部颈动脉，oa：喉动脉)通过使用10-0尼龙缝线来结扎且甲状腺上动脉(sta)未结扎。
[0046]
图12示出在小鼠部分颈动脉结扎模型中通过多普勒超声成像验证左颈动脉后结扎中的血流紊乱形成的结果，右颈动脉图像(上端)示出正常脉动层流，相反，左颈动脉图像(下端)示出与右颈动脉图像相比在流速中显著减少的同时异常来回移动的血流。
[0047]
图13a为在小鼠部分颈动脉结扎模型中示出血流紊乱位点中的pmsc-nv的诊断治疗效果，在对小鼠进行部分颈动脉结扎手术的3天后，静脉给药vivotrack680-标记的msc-nv及pmsc-nv来使其全身循环，之后，24小时后通过活体成像系统(ivis)在整个小鼠身体中分析msc-nv、pmsc-nv及pmsc的体内分布的结果。
[0048]
图13b为在进行与图13a相同的实验后采集的右颈动脉(对照组)及左颈动脉(结扎的)中通过活体成像系统确认msc-nv、pmsc-nv及pmsc的分布并对其进行定量分析的结果(组之间的*p＜0.05)。
[0049]
图13c为在采集的右颈动脉及左颈动脉中通过免疫染色分析细丝蛋白a蛋白的表达及是否与msc-nv及pmsc-nv共存的图像结果及其定量分析结果(组之间的*p＜0.05及*p＜0.001)。
[0050]
图13d示出进行部分颈动脉结扎手术14天后对左颈动脉进行苏木精-伊红(h&e)染色的图像结果(上排)及通过新生血管内膜结构参数的定量分析的pmsc-nv处理引起的新生血管形成抑制，为示出在采集的左颈动脉(蓝色：4’,6-二脒基-2-苯基吲哚染色的核)中通过cd68(中间排)及血管细胞黏附分子-1(下排)的免疫染色来进行对于内皮细胞的巨噬细胞募集的结果。此时，白色线示出朝向内膜的介质层的内部边界(*p＜0.05比生理盐水处理组)。
[0051]
图14为向部分颈动脉结扎小鼠分别注射msc-nv、pmsc-nv及pmsc后通过活体成像系统的成像(左侧)分析主要器官中的生物体分布的图像结果及其定量分析结果(ht：心脏，lg：肺，lv：肝，sp：脾，kn：肾)。此时，在试验组中，lg中的pmsc-nv的最低的荧光强度示出可使细胞超出肺毛细血管诱捕(右侧)的prey及纳米囊泡的协同作用(组之间的*p＜0.001)。
[0052]
图15为示出结扎14天后供给动脉硬化饮食的载脂蛋白e(apoe)ko及正常小鼠(balb/c)的左颈动脉中的加速的粥瘤形成的图像及其定量分析结果。虽喂食动脉硬化饮食但未结扎的小鼠在左颈动脉中未示出可看见的粥瘤形成(nd：无法检测)。
[0053]
图16为示出在部分颈动脉结扎小鼠模型中处理msc-nv或pmsc-nv并在11天后对小鼠器官(肺、肝、心脏及脾)进行苏木精伊红染色的结果。
[0054]
图17a为示出通过使用不锈钢棒(直径＝0.9mm)来诱导左颈动脉的外科结扎来制备猪部分颈动脉结扎模型，并显示结扎后去除棒的照片及结扎手术后正常状态(上)和左颈动脉的部分闭塞状态(下)的超声影像(黄色箭头：结扎的上端及下端)。
[0055]
图17b为通过多普勒超声图像示出，与正常组及右颈动脉组中的单向层流相反地，在左颈动脉的结扎位置的远端区域中形成血流紊乱的结果(黄色箭头：血流方向)。
[0056]
图17c为示出右颈动脉及左颈动脉中的内皮层的细丝蛋白a表达的图像结果。
[0057]
图17d至图17g为对猪进行部分颈动脉结扎手术后第3天静脉给药纳米囊泡并在24小时后采集血管来分析的结果，示出在采集的左颈动脉(图17d及图17e)及主动脉弓(图17f及图17g)(自然血流紊乱形成区域)中通过活体成像系统及免疫染色有效靶向猪模型中的血流紊乱位点的pmsc-nv的结果(组之间的***p＜0.001)。
[0058]
图18为示出在猪部分颈动脉结扎模型中用pmsc-nv处理24小时后的右颈动脉及左颈动脉(诱导血流紊乱)(左侧)及主动脉弓(自然血流紊乱)(右侧)的活体成像系统成像结果。
[0059]
图19a示出为了利用微流体模型在血流紊乱下分析人动脉内皮细胞的pmsc-nv靶向效率，附着培养人冠状动脉内皮细胞(hcaec)并在12小时后，在单向层流或血流紊乱下培养1天后，再次利用纳米囊泡处理1小时的过程。
[0060]
图19b为通过绘图示出正常(层)流动及血流紊乱模式。
[0061]
图19c为为了通过包括细丝蛋白a的表达(绿色)在内的f-肌动蛋白的表达(红色)分析人冠状动脉内皮细胞的排列而实施免疫染色的结果。
[0062]
图19d为根据上述图19c的结果定量分析流动方向上的f-肌动蛋白排列的结果。
[0063]
图19e为根据上述图19c的结果在血流紊乱下定量分析细胞质内细丝蛋白a的表达水平的结果(组之间的*p＜0.05)。
[0064]
图19f为根据上述图19c的结果测定纳米囊泡荧光强度并在血流紊乱位点中定量分析对于人冠状动脉内皮细胞的msc-nv及pmsc-nv的体外靶向效率的结果(组之间的***p＜0.001)。
[0065]
图19g为根据上述图19c的结果定量分析纳米囊泡与细丝蛋白a的共存来确认细丝蛋白a的prey靶向的结果(组之间的***p＜0.001)。
[0066]
图20为利用体外微流体模型通过活体成像系统成像分析靶向人主动脉内皮细胞(haec)的pmsc-nv的效率的结果。
具体实施方式
[0067]
以下，具体说明本发明的结构。
[0068]
本发明涉及在表面展示血流紊乱位点靶向肽的源自干细胞的纳米囊泡。
[0069]
并且，本发明提供上述纳米囊泡的制备方法，其包括从由依次插入有信号肽-血流
紊乱位点靶向肽-跨膜蛋白-绿色荧光蛋白的编码序列的载体转染的干细胞中获得在表面展示血流紊乱位点靶向肽的纳米囊泡的步骤。
[0070]
在本说明书中，“血流紊乱”是指血管的结构特性引起的异常且不规则的血流流动，是导致血管内皮细胞的功能障碍的早期动脉硬化的事件。
[0071]
在本说明书中，“纳米囊泡(nanovesicle，nv)”是指通过将细胞通过过滤器的方式人为粉碎细胞来通过自组装制备的，应理解为与从细胞提取的外泌体(exosome)不同。
[0072]
本发明提供利用靶向血流紊乱位点的肽功能化的源自干细胞的纳米囊泡(参照图1a至图1c)。
[0073]
上述血流紊乱位点靶向肽可选自由seq id no:1至seq id no:5组成的组中。更具体地，seq id no:1为具有gspreytsymph的氨基酸序列的prey肽，seq id no:2为具有spreytsymph的氨基酸序列的myoferlin肽，seq id no:3为具有slssyngsalas的氨基酸序列的眼缺乏同源物1同种型2(eyes absent homolog 1isoform 2)的肽，seq id no:4为具有acntgspyec的氨基酸序列的锌指蛋白(zinc finger protein)、部分(partial)肽seq id no:5为具有actpsfskic的氨基酸序列的钙同线蛋白1(calsyntenin 1)、同种型(isoform)cra_b肽。
[0074]
在本发明的纳米囊泡中，与现有的血流紊乱位点靶向肽-脂质体相比，容易确认血流紊乱位点靶向肽表达，可通过纳米囊泡提取前细胞步骤中的绿色荧光蛋白/v5标签流式细胞荧光分选技术分选(gfp/v5tag facs sorting)提高血流紊乱位点靶向肽表达比例。并且，与脂质体相比，纳米囊泡自身包含源自干细胞的动脉硬化抑制治疗物质。与其他化学药物相比，其对于稳定性或副作用风险等具有优点。并且，可使用来源于患者的自体干细胞，因此，不受免疫反应等的影响，尤其，源自间充质干细胞的纳米囊泡为不受宿主免疫排斥反应的影响的细胞，保留了间充质干细胞的表面标志物的pmsc-nv也具有这种特征，因此，还具有异体移植的可能性，在本发明中，通过利用小鼠及猪的临床前实验确认了一部分的其可能性。并且，由于间充质干细胞的宿主免疫排斥避免机制，预计与脂质体相比，不受巨噬细胞的影响，这将有望提高靶向效率。
[0075]
上述纳米囊泡可利用公知的转化技术，可通过尺寸控制方式的挤压分离由依次插入有信号肽-血流紊乱位点靶向肽-跨膜蛋白(tmp)-绿色荧光蛋白的编码序列的载体转染的干细胞。
[0076]
根据本发明的一具体例，以将靶向血流紊乱位点的prey肽展示在间充质干细胞膜的外部的方式进行功能化，使用以通过物理细胞粉碎及之后的自组装生成纳米囊泡的方式设计的质粒dna。为此，构建了外部n-末端-启动子-信号肽-prey-v5标签-跨膜蛋白-绿色荧光蛋白-内部c-末端结构的质粒(参照图2a至图2g、图3)。上述信号肽可诱导将prey肽定位在细胞膜的外部，并可通过切割使诱导信号失活。上述v5标签及绿色荧光蛋白可用于监测prey的位置及表达水平。根据本发明的一具体例，在细胞膜内侧表达绿色荧光蛋白，在细胞膜外侧表达v5标签及prey肽。
[0077]
并且，为了改善血流紊乱位点靶向肽表达，可通过使用跨膜蛋白来使搜索及靶向扰血液流动位点的肽的能力最大化。因此，上述跨膜蛋白如下。
[0078]
i)可以为在干细胞或纳米囊泡中表达的蛋白质。例如，上述跨膜蛋白可使用如cd86的外泌体标志物、如cd105及cd271的间充质干细胞标志物等。
[0079]
ii)蛋白质的n-末端与c-末端需隔着细胞膜面向相反方向。
[0080]
优选地，可使用转染效率高的cd271。
[0081]
上述信号肽可使用信号肽f(signal peptide f)(bku002587，韩国人类基因库(korea human gene bank)，韩国(republic of korea))及信号肽r(signal peptide r)(bku008396，韩国人类基因库，韩国)，但并不局限于此。
[0082]
上述信号肽-血流紊乱位点靶向肽-跨膜蛋白-绿色荧光蛋白的编码序列为核酸序列，上述核酸以最广义的含义使用，包括单链(ss)dna、双链(ds)dna、cdna、(-)-rna、( )-rna、dsrna等。优选为双链dna。
[0083]
优选地，在选择dna作为上述信号肽-血流紊乱位点靶向肽-跨膜蛋白的编码序列的情况下，能够以插入于表达载体的形态使用。
[0084]
在本说明书中，术语“载体”是指能够搬运与其连接的其他核酸的核酸分子。作为载体的一种类型，具有“质粒”，质粒是指可将额外的dna片段结扎的圆形双链dna环。作为载体的另一类型，具有可利用病毒基因组将额外的dna片段结扎的病毒载体。当引入至宿主细胞时，一部分载体可在该宿主细胞内自我复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体及附加型哺乳动物载体)。当引入至宿主细胞时，另一部分载体(例如，非附加型哺乳动物载体)可整合到宿主细胞的基因组中，并可与宿主基因组一同复制。并且，一部分载体可指示它们可操作地连接的基因的表达。在本说明书中，将这种载体称为“重组表达载体”(或简称为“表达载体”)。通常，用于重组dna技术的表达载体大致为质粒形态，是质粒最常用的载体类型，因此，“质粒”与“载体”可互换使用。但是，本发明还包含提供等同功能的如病毒载体(例如，腺病毒载体、腺相关病毒(aav)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体、杆状病毒载体)的其他形态的表达载体。优选地，可使用慢病毒载体。转化包括将核酸引入至有机体、细胞、组织或器官的任何方法，如在本领域公知的，可根据宿主细胞选择适合的标准技术来执行。这种方法包括电穿孔(electroporation)、原生质体融合、磷酸钙(capo4)沉淀、氯化钙(cacl2)沉淀、利用碳化硅纤维的搅拌、农杆菌介导的转化、peg、硫酸葡聚糖、脂质体等，但并不局限于此。
[0085]
上述干细胞可使用来源于选自由骨髓、脐带、脐带血、胎盘、血液、皮肤、脂肪组织、神经组织、肝、胰胆管、肌肉及羊膜组成的组中的一种以上的组织的干细胞；间充质干细胞；胚胎干细胞或诱导多能干细胞等。优选地，可使用具有抗-动脉硬化特性的包含如mir-21、mir-132、mir-10、mir-146、mir-143及let 7的mirna的干细胞。例如，可使用转染效率高且细胞凋亡比例低的源自脂肪的干细胞。
[0086]
根据本发明的一具体例，本发明的纳米囊泡可通过下述方式获得，即，对于由表达prey肽的载体转染的干细胞，依次更换10μm、5μm及400nm的多孔性膜并进行挤压。根据本发明的一具体例，透射电子显微镜及动态光散射(dls)的分析结果，可获得分别具有约47.2
±
12.1nm及约83.7
±
20.6nm的平均的纳米囊泡直径的均匀分布，小于干细胞在动态光散射中的14.9
±
2.0μm直径。
[0087]
本发明的纳米囊泡的特征在于，与干细胞的细胞内成分相比，在挤压后也保留细胞内成分，抗-动脉硬化mirna，例如，mir-21、mir-132、mir-10、mir-146、mir-143及let 7的水平在挤压时增加。
[0088]
本发明的纳米囊泡的特征在于，若在通过脂多糖处理而激活的巨噬细胞处理，则
通过增加抗炎细胞因子的基因表达来示出抗炎效果。并且，氧化的低密度脂蛋白(ldl)的摄取引起的巨噬细胞的泡沫细胞形成最终诱导血管平滑肌细胞的表型变化及内部生长，因此，是动脉硬化发展的重要部分。该结果启示纳米囊泡可预防动脉硬化过程。
[0089]
并且，通过激活永生化小鼠内皮细胞的促炎功能障碍来测试通过处理纳米囊泡的内皮细胞修复效果的结果，内皮细胞优先表达e-选择素、细胞粘附分子-1及血管细胞黏附分子-1，当激活功能障碍时，募集炎症细胞，因此，若测定这些标志物的基因表达，则可通过脂多糖处理均上调，但若处理纳米囊泡，则显著下调，由此，纳米囊泡示出内皮细胞修复效果。同时，在人脐静脉内皮细胞中，对于环孢菌素a处理，纳米囊泡提高促内皮细胞修复及促血管生成作用。
[0090]
并且，在小鼠及猪部分颈动脉结扎模型中测试纳米囊泡的血流紊乱位点靶向效果的结果，可知，作为血流紊乱位点靶向肽的prey肽靶向在血流紊乱位点中过表达的细丝蛋白a，并可确认具有预防动脉硬化的早期进展的协同诊断治疗效果。同时，在体外微流体模型中，纳米囊泡与细丝蛋白a共存，在血流紊乱条件下增加，从而证明纳米囊泡的诊断治疗潜力。
[0091]
并且，本发明的纳米囊泡在全身循环后减少至在心脏、肺、肝及脾中并不具有明显的毒性效果的对照组的表达水平。
[0092]
因此，本发明还提供包含上述纳米囊泡的用于预防、诊断及治疗动脉硬化的组合物。
[0093]
本发明的用于预防或治疗动脉硬化的组合物可包含在体外、体内或离体中组成适合预防、诊断或治疗用途的组合物的活性成分及活性或无活性药学上可接受的载体。
[0094]
上述药学上可接受的载体包含如包括磷酸缓冲生理盐水溶液、人血清白蛋白(has)等的血清白蛋白、重组人白蛋白(rha)、明胶、酪蛋白等的的蛋白质赋形剂的可与纳米囊泡混合使用的任意的药学载体。载体、稳定剂及佐剂的例参照martin remington's pharm.sci,18th ed.(mack publ.co.,easton(1995))及the“physician's desk reference”,58nd ed.,medical economics,montvale,nj.(2004)。术语“载体”可包含缓冲液或ph调整剂，通常，缓冲液由有机酸或碱基制备的盐。作为代表性缓冲液，包括如柠檬酸盐、抗坏血酸盐、葡萄糖酸盐、碳酸盐、酒石酸盐、琥珀酸盐、醋酸盐或邻苯二甲酸盐等的有机酸盐；氨基丁三醇(tris)、缓血酸胺盐酸盐(tromethamine hydrochlorid)或磷酸盐缓冲液。作为额外的载体，包括聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖(聚合物糖)、葡萄糖结合剂(例，环糊精，例如2-羟丙基-正交(quadrature)，-环糊精)、聚乙二醇、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例，“吐温20(tween 20)”及“吐温80(tween 80)”等的聚山梨酯)、脂质(例，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例，胆固醇)及螯合剂(例，乙二胺四乙酸(edta))等的聚合赋形剂/添加剂。还可包含防冻剂或除冰剂。
[0095]
本发明的用于预防、诊断或治疗动脉硬化的组合物可制备为各种适当剂型。例如，如动脉内(关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹腔内、结节内(intranodal)及皮下途径的适合肠胃外给药的剂型和载体包含抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂及将剂型制备为与目标接受者的血液等渗的溶质以及能够包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂及防腐剂的水性及非水性无菌悬浮液。静脉内或腹腔给药为优选方法。向个体给药的细胞的剂量为随着时间的推移在个体实现所期望的有益治疗反应的有效量。例如，可通过下述方式实施，即，在注射之前，从
个体获得血液试样后保存，并用于后续的分析及比较。通常，可向70kg的患者静脉或腹腔注射至少约104至106及通常1
×
108个至1
×
10
10
个的细胞60分钟至120分钟。在给药时，考虑个体的整体健康状态及体重，并以根据细胞类型的ld-50(或其他毒性测定方法)及通过各种浓度中的根据细胞类型的副作用确定的比例给药本发明的纳米囊泡。给药可一次给药或分为多次给药。本发明的纳米囊泡可通过使用包括细胞毒剂、核苷酸类似物及生物反应调节剂的公知的通常治疗法来补充对于其他特定症状的治疗。与此类似地，在通过本发明的纳米囊泡的治疗中可选择性地追加生物反应调节剂。
[0096]
本发明还提供动脉硬化的治疗方法，其包括向个体给药治疗有效量的上述纳米囊泡的步骤。
[0097]
用于动脉硬化的治疗方法的纳米囊泡及给药方法已在上文中记述，因此，为了避免本说明书过于复杂，将省略关于两者之间共同的内容的记载。
[0098]
上述个体可以为狗、猫、大鼠、小鼠、人等的哺乳动物，但并不局限于此。
[0099]
参照详细后述的实施例，就能明确本发明的优点、特征及实现这些优点及特征的方法。但是，本发明并不限定于以下所公开的实施例，能够以互不相同的各种实施方式实现，本实施例仅使本发明的公开更加完整，为了向本发明所属技术领域的普通技术人员告知发明范畴而提供，本发明仅由发明要求保护范围的范畴定义。
[0100]
以下，将通过实施例更加详细地说明本发明。这些实施例仅用于例示本发明，不应解释为本发明的范围局限于这些实施例，这对本技术领域的普通技术人员而言是显而易见的。
[0101]
实施例1：prey肽-纳米囊泡的制备及表征
[0102]
设计及克隆用于表达prey的质粒
[0103]
在细胞膜在外部表达及定位prey的质粒由外部侧n-末端-启动子-信号肽-prey-v5-跨膜蛋白-绿色荧光蛋白-内部侧c-末端构成。信号肽使用信号肽f(bku002587，韩国人类基因库，韩国)或信号肽r(bku008396，韩国人类基因库，韩国)。在质粒序列中，i)信号肽诱导prey肽定位在细胞膜的外部；以及ii)v5标签及绿色荧光蛋白监测prey的位置及表达水平。表达载体通过使用neb gibson assembly kit(new england biolabs，ma)根据制造商的说明书进行克隆。信号肽及跨膜蛋白的各个类型通过利用下述模板的pcr单独扩增：对于信号肽f(bku002587，韩国人类基因库，韩国)、信号肽r(bku008396，韩国人类基因库，韩国)、cd86、cd105及截短的cd271(lngfr)，使用神经生长因子受体(ngfr)(addgene plasmid#27489；addgene,ma)。载体成分与质粒合成(macrogen，韩国)一同插入在cas9-digested p3s-cas9-hn(addgene plasmid#104171)骨架中。根据上述流程执行pcr扩增及吉布森克隆(gibson cloning)。所有引物及质粒均列于表1及表2。
[0104]
表1
[0105]
用于克隆的引物列表
[0106]
[0107][0108]
表2
[0109]
质粒的种类及序列(信号肽；prey；v5标签；跨膜蛋白；gs衔接物及增强绿色荧光蛋白)
[0110][0111]
测定转染效率
[0112]
prey转染效率与两种间充质干细胞类型(脂肪源性干细胞及骨髓源性干细胞)进行比较，在转染1天后进行定量分析，同时，使用facscanto(bd bioscience，ca)并通过流式细胞术(flow cytometry)在跨膜蛋白的试验候选物质(cd86、cd105及cd271)中进行比较。因此，细胞利用抗-v5标签一抗(ab27671，abcam，ma)及alexa fluor 647-偶联二抗(jackson immuno research，pa)进行免疫染色。为了评价质粒容量依赖性细胞凋亡，在转染30分钟后采集转染的脂肪源性干细胞及骨髓源性干细胞，利用alexa fluor 488-偶联的
膜联蛋白v(thermo fisher scientific，ca)进行免疫染色，由此执行流式细胞术。转染后的第1天，还通过台盼蓝染色计数存活细胞数。
[0113]
纳米囊泡挤压
[0114]
转染3天后，利用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗人脂肪源性干细胞(promoc ell，germany)、骨髓源性干细胞(lonza，switzerland)及pmsc两次，并利用0.25％的胰蛋白酶(trypsin)/乙二胺四乙酸分离。接着，为了生成纳米囊泡，使用挤压试剂盒(avanti polar lipids，al)，在通过依次更换10μm、5μm及400nm气孔大小的聚碳酸酯膜过滤器(whatman，uk)的同时将1
×
106细胞/ml的溶解在磷酸盐缓冲液的细胞悬浮液挤压6次。在15000g的条件下离心分离30分钟来收集纳米囊泡。之后，药粒再次悬浮在磷酸盐缓冲液，通过0.20μm的注射器过滤器(avantec，japan)过滤，在-70℃的温度中保存直到使用为止。通过透射电子显微镜(tem；jem-f200，jeol，japan)及动态光散射(dls；els-1000zs，otsuka electronics，japan)测定pmsc-nv的大小及形态。
[0115]
体外抗炎效果的测定
[0116]
将raw264.7细胞接种在24-孔板(5
×
105细胞/孔)。利用脂多糖(sigma-aldrich；100ng/ml)处理24小时后，利用脂肪源性干细胞纳米囊泡或骨髓源性干细胞纳米囊泡(10μg/ml)处理24小时来诱导raw264.7细胞的促炎性激活。为了使细胞摄取可视化，利用dio及dii(invitrogen，ca)分别标记raw264.7细胞及纳米囊泡，并通过共聚焦显微镜(lsm780；zeiss，germany)成像。为了进行qrt-pcr分析，利用纳米囊泡处理24小时后，采集细胞。在表3中列出il-10、il-1β、il-6及tnf-α的引物序列。为了利用小鼠炎症抗体阵列(ab133999，abcam)分析细胞因子，根据制造商的说明书采集细胞上清液。通过使用vybrant
tm
phagocytosis assay kit(v6694，molecular probes，or)并根据制造商的说明书测定msc-nv的抗吞噬作用。通过共聚焦显微镜获取图像，通过使用varioskan
tm lux多模式酶标仪(varioskan
tm lux multimode microplate reader)(thermo fisher scientific，ma)来测定荧光强度。
[0117]
表3
[0118][0119]
体外促内皮细胞恢复效果的评估
[0120]
将永生化小鼠内皮细胞(atcc，va)接种在24-孔板(1
×
105细胞/孔)，利用脂多糖(100ng/ml)处理24小时。接着，还利用脂肪源性干细胞纳米囊泡、骨髓源性干细胞纳米囊泡或pmsc-nv(10μg/ml)处理24小时。为了使细胞摄取可视化，利用dio及dii分别标记永生化小鼠内皮细胞及纳米囊泡，并通过共聚焦显微镜成像。为了进行qrt-pcr分析，利用纳米囊泡处理24小时后采集永生化小鼠内皮细胞。在表3列出e-选择素、细胞粘附分子-1及血管细胞黏附分子-1的引物序列。针对永生化小鼠内皮细胞，利用血管细胞黏附分子-1抗体(ab134047，abcam)进行免疫染色，在利用imagej进行定量分析的同时通过共聚焦显微镜成像。在人脐静脉内皮细胞(lonza)处理纳米囊泡(10μg/ml)及环孢菌素a(25μg/ml；santa cruz biotechnology，ca)，并在基质胶(bd biosciences，ma)中分别培养2小时及24小时，从而测定针对抗-血管形成及血管破裂的促内皮细胞恢复效果。通过共聚焦显微镜获取图像，并利用imagej定量化。
[0121]
小鼠部分颈动脉结扎模型
[0122]
所有动物研究根据延世大学医学院动物护理和使用机构委员会(iacuc)批准的程序(2018-0044)执行。外科手术利用6周龄雄性balb/c(orient bio inc，韩国)或kor-载脂蛋白e(apoe)(shl)(slc，japan)小鼠进行。为了进行部分颈动脉结扎手术，通过腹腔内注射甲苯噻嗪(10mg/kg)及舒泰(50mg/kg)混合物来进行麻醉。颈部剃毛，并利用必妥碘消毒。接着，执行中线切开(5mm)。左颈动脉暴露后，利用10-0聚酰胺缝线结扎左颈动脉的4个分支中的3个(eca、ica、oa)，将甲状腺上动脉保持未结扎的状态。之后，利用6-0丝缝线缝合切开部。并且，监测小鼠并喂食动脉硬化饮食(research diets，nj)，结扎3天后，静脉给药msc-nv、pmsc或pmsc-nv。
[0123]
小鼠部分颈动脉结扎模型中的靶向效率及抗-动脉硬化效果的测定
[0124]
在试验组的注射24小时后，通过活体成像系统成像(perkinelmer，wa)及组织学分析，在小鼠部分颈动脉结扎模型中测定血流紊乱位点的体内pmsc-nv靶向效率。针对间充质干细胞及纳米囊泡组，利用vivotrack680(perkinelmer)标记30分钟，并向部分颈动脉结扎模型注射。接着，在利用异氟烷进行呼吸麻醉的情况下，执行活体成像系统成像。之后，处死小鼠并采集它们的左颈动脉、右颈动脉及主要器官，并执行离体活体成像系统成像及组织学分析。针对左颈动脉及右颈动脉的组织切片，利用抗-细丝蛋白a抗体(ab51217，abcam)进行免疫染色，通过imagej软件将相应的荧光强度定量化。针对组织切片，还利用苏木精-伊红(h&e)进行染色，或者利用抗-cd68抗体(ab125212，abcam)及抗-血管细胞黏附分子-1抗体(ab134047，abcam)进行免疫染色。通过imagej定量分析新生血管内膜(neointima)结构因素(新生血管内膜与新生血管内膜 内腔的面积比例、新生血管内膜与培养基的面积比例及新生血管内膜面积)或相应的荧光强度。
[0125]
猪部分颈动脉结扎模型中的靶向效率的测定
[0126]
在重量为25kg～30kg的雌性约克夏猪(xp bio，韩国)中根据先前研究执行部分颈动脉结扎手术。对猪肌肉内注射阿托品(0.04mg/kg)、甲苯噻嗪(2mg/kg)及阿扎哌隆(2mg/kg)作为术前用药(premedication)。利用阿法沙龙(1mg/kg)麻醉小鼠，在手术过程中，通过器官插管2％的异氟烷来保持该状态。使用必妥碘来消毒颈部，接着，进行中线皮肤切开。将无菌不锈钢棒(外径＝0.9mm)放置在左颈动脉作为间隔物，与5-0丝缝线一同结扎。依次去除棒并缝合，由此，阻塞切开来诱发颈动脉的80％的闭塞。右颈动脉为正常组，在未结扎的
状态下放置其。通过超声波(s22v；sonoscape medical corp.,china)观察血流模式。结扎3天后通过耳静脉(1mg/pig)静脉内注射vivotrack680-标记的msc-nv或pmsc-nv，在注射后的第1天或第21天处死猪。为了离体活体成像系统及组织学分析，采集右颈动脉、左颈动脉及主动脉弓。针对它们的组织切片，利用抗-细丝蛋白a抗体及抗-cd31抗体(sc-1506，santa cruz biotechnology，ca)进行免疫染色，接着，在进行imagej分析的同时执行荧光成像。
[0127]
体外血流模型中的人内皮细胞的靶向效率的测定
[0128]
如前所记述(sei,y.j.et al.sci rep 7,10019,201)，微流体装置通过软光刻技术制备为聚二甲基硅氧烷(pdms，dow corning，mi)，与玻璃盖玻片(vwr,pa)结合来放入聚苯乙烯盒(ted pella inc.,ca)。将装置利用70％的乙醇消毒，并利用磷酸盐缓冲液清洗。接着，利用50μg/ml的胶原蛋白i(corning，ma)在37℃的温度下涂敷通道1小时。将人冠状动脉内皮细胞(hcaec；lonza)或人主动脉内皮细胞(haec；lonza)接种在通道(2
×
107细胞/ml)中12小时。各装置的排出口与phd ultra注射泵(harvard ap paratus，ma)连接来确保正常的培养基流动及血流紊乱的形成。为了产生正常的层流，以10dyne/cm2的剪切应力灌注22.5μl/分钟的培养基。血流紊乱分别通过以22.5μl/分钟(10dyne/cm2)及20μl/分钟(9dyne/cm2)的流速注射及去除培养基的重复循环生成。将人内皮细胞暴露在一侧流动类型后，在37℃的温度下，向通道灌注纳米囊泡(10μg/ml)1小时。在各个试验组中，使用imagej来定量分析人内皮细胞的纳米囊泡摄取。
[0129]
qrt-pcr及mirna阵列
[0130]
根据制造商的说明书，使用1ml的特里佐(trizol)试剂(invitrogen)，从各个样品中提取总rna。将rna溶解在焦碳酸二乙酯(depc)水，通过使用accupower cyclescript rt premix(bioneer，韩国)来合成了cdn a。接着，在steponeplus real-time pcr system(applied biosystems，ca)中，利用sybr green pcr mix(thermo fisher scientific)执行pcr。将甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)提供至管家基因，通过使用相对定量方法2-δδct
来测定各个标志物的基因表达。在表3中列出引物序列。通过使用mirna阵列(genechip 4.0microrna microarray；affimetrix，japan)根据制造商的说明书来分析溶解的rna。
[0131]
细胞及组织的免疫荧光染色
[0132]
利用4％的多聚甲醛(sigma-aldrich)固定细胞样品10分钟，利用10％的多聚甲醛固定组织样品3天，两者均在室温条件下执行。利用磷酸盐缓冲液洗涤固定的样品，并固定在石蜡来制备组织切片。接着，利用一系列的二甲苯及乙醇溶液(在蒸馏水中，100％v/v、95％v/v、80％v/v、70％v/v)将其水合，为了抗原修复，在37℃的温度下，利用胃蛋白酶试剂(sigm a-aldrich)处理30分钟。之后，在室温条件下，对组织切片，利用封闭溶液(5％的胎牛血清白蛋白(millipore，md) 0.3％的triton x-100(sigma-aldrich))处理1小时。一抗为抗-v5标签抗体(ab27671，abcam)、抗-血管细胞黏附分子-1(ab134047，abcam)、抗-cd68(ab125212，abcam)、抗-细丝蛋白a(ab51217，abcam)及抗-cd31(sc-1506，santa cruz biotech nology，ca，usa)。将这些抗体以1∶100稀释并在磷酸盐缓冲液中处理，接着，将后续二抗以1∶200稀释并在磷酸盐缓冲液中处理。二抗为与alexafluor 594偶联的抗-小鼠抗体、与alexa fluor 594偶联的抗-兔抗体、与ale xa fluor 488偶联的抗-兔抗体及与alexa fluor 488偶联的抗-山羊抗体(全部来自jackson laboratories)。接着，放置样品，并利用包含4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(vector laboratories，ca)的封固溶液进行对比染
色来将细胞核可视化。
[0133]
蛋白质印迹法分析
[0134]
将样品溶解在ripa缓冲液(sigma-aldrich)来获得了总蛋白，通过使用蛋白浓度测定(sigma-aldrich)来测定蛋白质的浓度。在10％(w/v)的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)凝胶中对蛋白质提取物进行电泳后移动至硝酸纤维素膜上。与5％(w/v)的脱脂乳一同在tbst(20mm的tris，0.9％的nacl，0.1％的吐温20，ph值为7.4)中封闭膜后，与作为一抗的抗-v5标签(ab27671，abcam)、抗-cd271(345102，bio legend，ca)、抗-绿色荧光蛋白(ab32146，abcam)、抗-cd9(ab92726，abcam)及抗β-肌动蛋白(ab8227，abcam)一同培养。接着，根据制造商的说明书应用作为二抗的山羊抗-小鼠igg(h l)-辣根过氧化物酶(hr p)偶联物及山羊抗-兔igg(h l)-辣根过氧化物酶偶联的抗体(均为vec tor laboratories公司产品)。通过使用cl plus western blotting detection kit(amersham biosciences，uk)根据制造商的说明书将信号可视化，并使用las-3000图像读取器(fujifilm，japan)进行分析。
[0135]
统计分析
[0136]
由平均
±
标准偏差(stdev)表示定量数据。作为使用sigmaplot 12.0(systat software,inc.,california,usa)的turkey's significant difference post hoc test，通过单向方差分析(anova)对结果进行统计分析。
[0137]
实验例1：在膜的外部展示rpey
[0138]
为了可使纳米囊泡靶向血流紊乱位点，作为靶向肽的prey通过跨间充质干细胞膜(pmsc：prey-表达人间充质干细胞)来表达专门设计的质粒，由此在外部展示。质粒以在n-末端表达信号肽和prey胞外域的方式设计，由此，信号肽诱导从间充质干细胞膜定位在prey胞外域的外部侧，并可通过切割使诱导信号失活。
[0139]
并且，测试了用于改善prey表达的3个跨膜蛋白，即，外泌体标志物(cd86)及间充质干细胞标志物(cd105及cd271)的能力。通过这种方式，将搜索及靶向血流紊乱位点的prey的能力最大化。prey与v5标签连接后，与绿色荧光蛋白(外部n-末端-启动子-信号肽-prey-v5标签-跨膜蛋白-绿色荧光蛋白-内部c-末端)连接来确认细胞膜外部及内部中的prey的定位及表达水平(图2a、图3)。
[0140]
具有3个跨膜蛋白的试验组中，脂肪源性干细胞及骨髓源性干细胞的prey-cd271(神经生长因子受体：ngfr)的表达水平均高于prey-cd86及prey-cd105的表达水平，由此示出优秀的转染效率(图2b、图4a至图4c)。在prey-cd271质粒的容量增加的情况下，表达水平通过容量依赖性方式增加，相反，2х容量的转染后，细胞存活能力迅速减少(图2c、图4a至图4c)。因此，考虑与细胞存活能力的平衡，将质粒容量确定为1
×
(每1
×
106细胞1μg的prey-质粒)。若利用膜联蛋白v 比较死细胞数，可生存的脂肪源性干细胞多于转染后的骨髓源性干细胞，这表示，脂肪源性干细胞为与prey转染相比更合适的来源(图2c、图4a至图4c)。
[0141]
为了在间充质干细胞膜中确认prey的外部展示，在序列中靠近prey时对v5标签进行免疫染色(外部n-末端-启动子-信号肽-prey-v5-跨膜蛋白-绿色荧光蛋白-内部c-末端)。两种形态均无法明确获得两种信息类型，因此，将pmsc的附着(图5)及悬浮(图2d、图1a至图1c)形态分别用于测定prey的表达水平及位置。
[0142]
在附着形态中，如通过v5标签及绿色荧光蛋白信号所提示，prey沿着细胞膜高度表达，由此示出成功的转染。若通过向明胶水凝胶插入细胞来制备悬浮的形态，则共聚焦图像分别在间充质干细胞膜边界外部及内部中示出v5标签(红色)及绿色荧光蛋白(绿色)信号的外观，从而确认细胞膜外部中的prey展示。
[0143]
实验例2：纳米囊泡的挤压及表征
[0144]
为了生产pmsc-nv，气孔直径从10μm逐渐减少至5μm，最终减少到0.4μm，由此通过一系列的聚碳酸酯微孔膜依次挤压pmsc(图1b)。透射电子显微镜结果(图2e)示出具有47.2
±
12.1nm的平均的pmsc-nv直径的均匀分布。并且，通过蛋白质印迹法分析测定转染及纳米囊泡挤压过程中的prey-肽(绿色荧光蛋白及v5标签)的完整保存及外泌体特性(cd9)(图2f、图6)。
[0145]
之后，在msc-nv、pmsc及pmsc-nv中比较内部成分来确认了prey转染及纳米囊泡挤压后的细胞内成分的保存。提供mirna作为重要的治疗剂，大部分由外泌体传递。纳米囊泡本质上与外泌体相似，因此，pmsc-nv、msc-nv及pmsc的mirna内容物通过mirna阵列进行分析(图2g及表4及表5、图6)。在转染(msc-nv比pmsc-nv)及挤压工序(pmsc比pmsc-nv)中，对总mirna的2.72％及6.71％，将表达水平改变2倍以上，由此证明了它们的生产过程中的细胞内的内容物的保存。在抗-动脉硬化的mirna中，mir-21、mir-132、mir-10、mir-146、mir-143及let 7的水平在挤压过程中增加，但是，其他mirna在从间充质干细胞生产纳米囊泡的过程中保持它们的表达水平。
[0146]
表4
[0147]
[0148][0149]
表5
[0150]
挤压工序中的2倍以上的mirna变化(pmsc比pmsc-nv)
[0151]
[0152]
[0153]
[0154]
[0155][0156]
实验例3：msc-nv的体外抗炎效果
[0157]
间充质干细胞及间充质干细胞衍生细胞中的内容物示出强力的抗炎效果是周知的。因此，在prey转染前测试骨髓源性干细胞纳米囊泡及脂肪源性干细胞纳米囊泡的抗炎效果(图7a)。通过在小鼠单核细胞/巨噬细胞(raw264.7细胞)处理msc-nv来抑制了它们的炎症反应。分别利用dio及dii将细胞及msc-nv可视化来确认了通过活化的巨噬细胞的msc-nv的有效细胞摄取(图7b)。脂肪源性干细胞纳米囊泡及骨髓源性干细胞纳米囊泡均被活化的巨噬细胞相似的摄取。
[0158]
通过qrt-pcr(图7c)、斑点印迹细胞因子阵列(图7d)及噬菌作用测定(图7e)分析骨髓源性干细胞纳米囊泡、脂肪源性干细胞纳米囊泡及pmsc-nv的抗炎活性。抗炎性白细胞
介素-10(il-10)和il-13基因表达被上调，但促炎标志物(il-1β、tnf-α)未上调，这表示，从间充质干细胞排出后也保持通过msc-nv的巨噬细胞的抗炎潜力。这些结果得到了下述分析的支持，即，由从条件培养基分泌的细胞因子(图7d)及所有纳米囊泡处理组中的细菌成分减少的噬菌活性(图7e)示出抗炎效果。针对氧化的低密度脂蛋白(ldl)的摄取(uptake)程度，利用油红o染色(oil red ostaining)(图7e，下图)确认了在除骨髓源性干细胞纳米囊泡之外的所有msc-nv中，氧化的低密度脂蛋白(ldl)摄取降低，这将支持脂肪源性干细胞纳米囊泡和pmsc-nv的泡沫细胞的抑制效果。因摄取氧化的低密度脂蛋白(ldl)而形成的巨噬细胞的泡沫细胞，最终诱导血管平滑肌细胞的表型变化及内部生长，因此，是动脉硬化发达的重要部分。该结果启示msc-nv可预防动脉硬化过程。
[0159]
实验例4：msc-nv的体外促内皮细胞恢复效果
[0160]
通过激活脂多糖处理导致的永生化小鼠主动脉内皮细胞的促炎功能障碍来测试了msc-nv处理的内皮细胞恢复效果(图8a)。分别利用dio及dii标记，脂肪源性干细胞纳米囊泡及骨髓源性干细胞纳米囊泡两者均有效内化为激活的永生化小鼠内皮细胞，并将其可视化(图8b)。在纳米囊泡摄取时，脂肪源性干细胞纳米囊泡与骨髓源性干细胞纳米囊泡之间没有明显差异。内皮细胞主要表达e-选择素、细胞粘附分子-1及血管细胞黏附分子-1，当激活功能障碍时，募集炎症细胞。因此，若在永生化小鼠内皮细胞中，通过qrt-pcr测定这些标志物的基因表达(图8c)，则通过脂多糖处理均被上调，或者，利用两个msc-nv类型处理，甚至不处理也显著下调，这不仅保证了两个msc-nv类型的内皮细胞恢复效果，还启示了通过100ng/ml的脂多糖处理来有效诱导内皮细胞功能障碍。该结果也得到了下述内容的支持，即，血管细胞黏附分子-1为最初内皮功能障碍标志物之一，因此，在免疫染色过程中，表达血管细胞黏附分子-1蛋白(图8d)。促内皮细胞恢复效果在脂肪源性干细胞纳米囊泡、骨髓源性干细胞纳米囊泡及pmsc-nv中没有显著差异(图9及图10)，这启示了prey转染不损伤msc-nv的治疗效果。
[0161]
环孢菌素a处理通过抑制血管形成内皮细胞活性来妨碍血管形成而周知。因此，在基质胶中培养人脐静脉内皮细胞后，接种2小时(图9)或12小时(图8e)后，一同处理环孢菌素a及纳米囊泡来测试了间充质干细胞(骨髓源性干细胞比脂肪源性干细胞)纳米囊泡的促血管生成(图9)及促内皮细胞恢复效果(图8e)。接着，测定了人脐静脉内皮细胞的血管结构因子(即，连接处、主节段、总长度和极端节点的数量)。结果，与间充质干细胞来源无关地，msc-nv处理通过对于环孢菌素a处理的反应提高了人脐静脉内皮细胞的促内皮细胞修复及促血管生成作用。并且，在接种12小时及2小时后进行环孢菌素a处理时确认了人脐静脉内皮细胞中的pmsc-nv的促内皮细胞修复及促血管生成作用的一致性(图10)。
[0162]
实验例5：体内靶向及抗-动脉硬化功能
[0163]
在小鼠部分颈动脉结扎模型中测定了pmsc-nv的诊断治疗效率。若将4个左颈动脉分支中的3个动脉，即，外部颈动脉、内部颈动脉及喉动脉结扎(图11)，则通过多普勒超声成像确认血流紊乱的形成(图12)。接着，结扎后的3天内，通过尾静脉静脉注射msc-nv、pmsc-nv及pmsc。在注射24小时后，通过活体成像系统将它们的或体内分布可视化(图13a～图13b、图14)。pmsc-nv的左颈动脉-靶向效率优于msc-nv或pmsc，这启示了prey及纳米囊泡具有通过妨碍细胞的肺毛细血管诱捕来有效靶向血流紊乱位点的上升作用。肺毛细血管诱捕为用于全身细胞传递的主要障碍。通过本发明人之前的蛋白质组学分析鉴定了细丝蛋白a
作为prey的靶分子。采集右颈动脉及左颈动脉并在注射24小时后，进行免疫染色(图13c)。细丝蛋白a表达在左颈动脉中显著高于右颈动脉，这证实了其为了募集pmsc而在血流紊乱位点中过表达。在利用vivotrack680标记纳米囊泡的试验组中，只有pmsc-nv与细丝蛋白a一同明确共内化。
[0164]
证实了msc-nv的抗炎及促内皮细胞恢复效果(图7a～图7e，图8a～图8e、图9及图10)及prey的靶向效率(图13a～图13c)，因此，假设它们的组合(pmsc-nv)可示出能够预防动脉硬化的早期进展的协同诊断治疗效果。为了本实验的该部分，使用了接受部分颈动脉结扎手术的载脂蛋白e(apoe)ko小鼠。这是因为，该小鼠菌株示出与相应的正常菌株相比更积极的动脉硬化发生(图15)。在载脂蛋白e(apoe)ko部分颈动脉结扎模型中，若在注射纳米囊泡11天后采集左颈动脉及右颈动脉，则pmsc-nv在保持与正常对照组相似的血管形态的同时有效防止新生血管形成，但其他试验组未示出明确的治疗效果(图13d顶行)。另外，pmsc的容量不足以进行有效靶向，因此，与pmsc-nv相比，无法有效预防新生血管形成(图13b)。cd68(图13d中间行)及血管细胞黏附分子-1(图13d底行)的蛋白表达分别被测定为单核细胞募集及内皮细胞活化的标识。当处理pmsc-nv时，它们的表达水平在全身循环后减少至在心脏、肺、肝及脾中并不具有明显的毒性效果的对照组的表达水平(图16)。相比之下，与正常对照组及pmsc-nv组相比，其他试验组的标志物的表达显著高。
[0165]
实验例6：体内猪部分颈动脉结扎及体外人内皮细胞模型
[0166]
作为临床前大型动物模型，使用猪部分颈动脉结扎模型并根据之前确立的方法确认了对于血流紊乱位点的pmsc-nv的靶向效率。简而言之，即使将不锈钢棒(直径＝0.9mm)与左颈动脉(直径＝4.5mm)紧密结扎后去除(图17a顶部)，也诱导了左颈动脉的70％～80％的闭塞(图17b底部)。通过多普勒超声成像确认了结扎的左颈动脉的远端部分中形成了清晰的血流紊乱(图17b)。并且，细丝蛋白a与右颈动脉相比在左颈动脉的内皮中表达得更高(图17c)。通过耳静脉静脉内给药vivotrack680-标记的msc-nv或pmsc-nv，结扎3天后全身循环。分别在纳米囊泡注射后的24小时或第21天从正常、诱导血流紊乱及自然血流紊乱位点采集右颈动脉、左颈动脉及主动脉弓作为组织样品。由于其曲率和分支结构，自然血流紊乱形成在主动脉弓。在活体成像系统图像中，pmsc-nv在作为致病性重塑的指标的左颈动脉的结扎位置的远端区域积累的更多，但未在右颈动脉中观察到(图17d、图18左侧)。在主动脉弓样品中，与msc-nv相比，pmsc-nv的活体成像系统荧光分布与血流紊乱位点的相关性更高，示出有效靶向prey的功能(图17f、图18右侧)，与msc-nv相比，这得到通过pmsc-nv的cd31的更大的共存(图17e及图17g)支持。
[0167]
最后，在血流紊乱中，通过使用体外微流体模型来测定靶向人冠状动脉内皮细胞(图19a～图19g)及人主动脉内皮细胞(图20)的pmsc-nv的效率。在该微流体模型中，附着在胶原涂敷的玻璃表面上的内皮细胞单层暴露在通过泵系统生成的介质流中，这成功模拟了健康或动脉硬化条件下的血流。并且，该微流体系统不仅能够精确观察在体内实验中难以实现的pmsc-nv的靶向效率，还能够精确观察靶向位点。为了在血管中模拟健康的状态及动脉硬化状态，在处理msc-nv前，将内皮细胞暴露在正常(10dyne/cm2)或血流紊乱(与1dne脉冲一同具有10dyne/cm2及-9dyne/cm2)(图19a～图19c)。确认了暴露在正常流动的内皮细胞沿流动方向排列，但暴露在血流紊乱的内皮细胞并非如此(图19d)。并且，细丝蛋白a表达在血流紊乱中增加(图19e)，相反，f-肌动蛋白表达在正常流动与暴露在血流紊乱的内皮细胞
之间相似(图19f)。重要的是，在微流体模型中，由于与细丝蛋白a的共存，pmsc-nv的信号与正常流动条件相比在血流紊乱条件(图20)中增加，由此在临床解释时，证明了pmsc-nv的诊断治疗潜在力。
[0168]
以上，详细记述了本发明内容的特定部分，对于本发明技术领域的普通技术人员而言这种具体记述仅为优选实施方式，明确的是，本发明的范围并不局限于此。
[0169]
产业上的可利用性
[0170]
本发明的利用能够靶向血流紊乱位点的肽的源自干细胞的纳米囊泡为抗-动脉硬化诊断治疗平台，提供与间充质干细胞相似的强力的抗炎及促内皮修复效果，有望在相关医疗产业领域中有用地用作能够预防或治疗动脉硬化的发病的新型诊断治疗剂。